基因芯片技术及临床应用.pdf

基因芯片技术及临床应用基因芯片技术及临床应用 亚能生物技术 深圳 有限公司亚能生物技术 深圳 有限公司 雷成刚雷成刚 亚能生物亚能生物 亚能生物技术 深圳 有限公司亚能生物技术 深圳 有限公司深圳高新区深圳高新区 成立于成立于20012001年年7 7月 自主研发 生产 销售月 自主研发 生产 销售 20032003年深圳市高新技术企业 年深圳市高新技术企业 20092009年年 国家级高新技术企国家级高新技术企 业业 复星医药集团于复星医药集团于20102010年年8 8月正式投资入股成为控股股东月正式投资入股成为控股股东 核心技术核心技术 基因芯片技术平台基因芯片技术平台 首创膜载体基因芯片并产业化首创膜载体基因芯片并产业化 基因芯片基因芯片 基因芯片基因芯片 gene chip gene chip 又称基因微矩阵 是多种 又称基因微矩阵 是多种 特定的寡聚核苷酸序列为探针 有序 高密度地排列 特定的寡聚核苷酸序列为探针 有序 高密度地排列 并固定于支持物表面上而成的二维并固定于支持物表面上而成的二维DNADNA阵列阵列 玻璃载体玻璃载体 表达谱芯片表达谱芯片 基因诊断芯片基因诊断芯片 尼龙膜载体尼龙膜载体 基因诊断系列产品基因诊断系列产品 PCR技术技术 Kary B Mullis 穆利斯 聚合酶链式反应 聚合酶链式反应 PCR 利用利用DNA碱基互补配对原则及半保留复制的特性 碱基互补配对原则及半保留复制的特性 将目的将目的DNA在体外进行大量复制在体外进行大量复制 1989年美国年美国 Science 杂志将杂志将PCR 列为十余项重大科学发明之首列为十余项重大科学发明之首 1993年度诺贝尔化学奖年度诺贝尔化学奖 Polymerase Chain Reaction 高灵敏性高灵敏性保真性保真性 产物的生成量以指数方式增加产物的生成量以指数方式增加 产物与模板完全一样产物与模板完全一样 反应体系建立复杂反应体系建立复杂 操作过程要求规范操作过程要求规范 产物分析是关键产物分析是关键 核酸分子杂交核酸分子杂交 是指具有一定同源性的两条核酸单链在一定的是指具有一定同源性的两条核酸单链在一定的 条件下可按碱基互补原则退火形成双链的过程 条件下可按碱基互补原则退火形成双链的过程 分子杂交具有高度的分子杂交具有高度的 特异性特异性 探针探针杂交体杂交体 探针探针DNA 核酸分子杂交核酸分子杂交 化学显色化学显色 PCR扩增扩增 基因芯片技术原理基因芯片技术原理 样本处理样本处理 芯片制备芯片制备 8 探针杂交及显色探针杂交及显色 Color forming TMD Hybridize unlabled probe on membrane with labeled amplicon detect hyb events Immobilized probe Streptavidin POD conjugate biotin TMB PCR 反向点杂交技术特点反向点杂交技术特点 膜芯片 膜芯片 高灵敏度高灵敏度 PCRPCR 高特异性高特异性 核酸分子杂交核酸分子杂交 高通量高通量 膜上的多种探针膜上的多种探针 安全无毒安全无毒 生物素标记生物素标记 结果易判读结果易判读 肉眼可见肉眼可见 亚能的专利亚能的专利 序号序号专利名称专利名称专利号专利号类别类别专利时间专利时间 1 1 人乳头瘤病毒分型基人乳头瘤病毒分型基 因芯片检测系统因芯片检测系统 ZL200410037617 7ZL200410037617 7发明发明20102010年年5 5月月5 5日获证书日获证书 2 2 地中海贫血的核酸地中海贫血的核酸 杂交膜条及试剂盒杂交膜条及试剂盒 ZL200510034015ZL200510034015发明发明20082008年年6 6月月2525日获证书日获证书 3 3 分枝杆菌菌种鉴定基分枝杆菌菌种鉴定基 因芯片检测系统因芯片检测系统 ZL200610063554 1ZL200610063554 1发明发明20102010年年6 6月月2323日获证书日获证书 4 4 乙型肝炎病毒基因亚乙型肝炎病毒基因亚 型和耐药突变的试剂型和耐药突变的试剂 ZL200710073933 3ZL200710073933 3发明发明20102010年年1 1月月2020日获证书日获证书 5 5 诊断诊断 地中海贫血的地中海贫血的 核酸膜条及试剂盒核酸膜条及试剂盒 ZL200710074203 5ZL200710074203 5发明发明20092009年年1111月月4 4日获证书日获证书 6 6 宫颈脱落细胞采集器宫颈脱落细胞采集器 ZL200920131328 1ZL200920131328 1实用新型实用新型20102010年年4 4月月2121日获证书日获证书 7 7 宫颈脱落细胞采集器宫颈脱落细胞采集器 ZL200920204688 XZL200920204688 X实用新型实用新型20102010年年8 8月月1111日获证书日获证书 主要产品主要产品 HPVHPV基因分型检测试剂盒基因分型检测试剂盒 乙肝分型及耐药突变基因检测试剂盒乙肝分型及耐药突变基因检测试剂盒 结核耐药突变检测试剂盒结核耐药突变检测试剂盒 分枝杆菌菌种鉴定基因检测试剂盒分枝杆菌菌种鉴定基因检测试剂盒 地中海贫血基因检测试剂盒 地中海贫血基因检测试剂盒 3 3个产品 个产品 Y Y染色体微缺失基因检测试剂盒染色体微缺失基因检测试剂盒 HPV基因分型检测试剂盒基因分型检测试剂盒 国食药监械国食药监械 准准 字字 2008第第3400994号号 2009年度十大先进试剂年度十大先进试剂 体外诊断试剂生产 净化车间 质量体系认证 ISO9001质量体系认证 编号0243Q10960R0S ISO13485质量体系认证 编号04706Q10160R0S 检测流程检测流程 结果示例结果示例 膜条无杂交背景或浅背景膜条无杂交背景或浅背景 斑点大 边界清楚 易判读斑点大 边界清楚 易判读 HPV16 HPV6 52 HPV 亚能亚能 HPV试剂盒性能指标试剂盒性能指标 灵敏度 灵敏度 1 0 103copies mL 准确性 准确性 98 以上以上 特异性 特异性 98 以上以上 重复性 重复性 98 以上以上 稳定性 有效期内完全能满足以上指标稳定性 有效期内完全能满足以上指标 检测通量 检测通量 23种种HPV基因型基因型 包括常见高危型及低危型 包括常见高危型及低危型 结果客观可靠 与临床 结果客观可靠 与临床 TCT及病理结果吻合度高及病理结果吻合度高 亚能亚能HPV 优势优势 可检测不同类型标本可检测不同类型标本 宫颈脱落细胞 宫颈脱落细胞 TCTTCT标本 标本 组织切片 疣体组织组织切片 疣体组织 一次检测数量随需而变 单人份 多人份任选一次检测数量随需而变 单人份 多人份任选 实验室设备通用实验室设备通用 一次可检测量大 单次 一次可检测量大 单次9696人份 人份 人工效率高 人工效率高 单人每月最少可操作单人每月最少可操作960960人份人份 单管密封杂交 避免了交叉污染单管密封杂交 避免了交叉污染 机会性筛查机会性筛查45409例例 HPV总阳性率为总阳性率为23 2 其中有高危型的占 其中有高危型的占 84 2 单一型别感染占单一型别感染占61 8 多重 多重HPV感染比例感染比例 38 20 高危型出现次数的排序高危型出现次数的排序16 58 33 18 52 流行病学数据流行病学数据 年龄段年龄段HPV阳性比阳性比 206 56 21 3038 93 31 4031 01 41 5016 76 51 604 94 61 701 50 700 3 中华妇产科杂志中华妇产科杂志 2009 44 8 023 027 乙型肝炎病毒分型和耐药突变乙型肝炎病毒分型和耐药突变 基因检测试剂盒基因检测试剂盒 基因芯片技术基因芯片技术 通量高 特异性强 灵敏度高 快速通量高 特异性强 灵敏度高 快速 检测目标是血清或血浆中的检测目标是血清或血浆中的HBV DNA 抗病毒治疗前和抗病毒治疗中 对慢性乙肝患者抗病毒治疗前和抗病毒治疗中 对慢性乙肝患者 HBV DNA进行进行基因分型基因分型和和耐药突变基因耐药突变基因分析分析 产品特性产品特性 区分中国常见的区分中国常见的 HBV B C D 基因型基因型 检测检测HBV抗病毒药物抗病毒药物 5 个热点突变位点个热点突变位点 的的 6 种突变类型种突变类型 动态监控动态监控HBV变异 辅助确定个性化的变异 辅助确定个性化的 临床诊疗方案临床诊疗方案 产品用途产品用途 1 准确性 准确性 检测检测105例临床慢性例临床慢性HBV感染阳性样本 结果与测序比较显示为感染阳性样本 结果与测序比较显示为 相同的基因型和耐药突变类型 准确率为相同的基因型和耐药突变类型 准确率为100 2 特异性 特异性 检测检测50例临床例临床HBV阴性样本结果全部为阴性 检测非阴性样本结果全部为阴性 检测非HBV感染感染 性病原体性病原体DNA 包括 包括C型肝炎病毒 型肝炎病毒 HCV 乙型脑炎病毒 梅毒螺旋体和 乙型脑炎病毒 梅毒螺旋体和 HIV 结果均为阴性 结果均为阴性 3 灵敏度 灵敏度 能稳定检测血清能稳定检测血清HBV的最低检出限为的最低检出限为1 0 103IU mL 4 精密度 精密度 检测检测2 0 103IU mL的血清的血清HBV 批内和批间的一致性为 批内和批间的一致性为100 5 稳定性 稳定性 产品有效期为产品有效期为6个月 在有效期内产品性能稳定 个月 在有效期内产品性能稳定 产品性能指标产品性能指标 结果判读示例 结果判读示例 结核分枝杆菌耐药突变基因检测结核分枝杆菌耐药突变基因检测 产品的特点产品的特点 可直接运用痰样进行检测 无需培养 可直接运用痰样进行检测 无需培养 检测结核检测结核DNA上上8个位点个位点13种突变种突变 一线药物一线药物 利福平 异烟肼 链霉素 乙胺丁醇利福平 异烟肼 链霉素 乙胺丁醇 的耐药性的耐药性 检测时间短检测时间短 8小时内获得检测结果小时内获得检测结果 检测基因突变的结果准确 与测序结果符合率达检测基因突变的结果准确 与测序结果符合率达99 以上以上 临床应用临床应用 检测到结核菌的有无只是其第一步检测到结核菌的有无只是其第一步 更进一步的是对结核菌进行相关基因分析更进一步的是对结核菌进行相关基因分析 确定有无相应耐药突变 指导临床用药确定有无相应耐药突变 指导临床用药 结果判读示意结果判读示意 N1N2N3N4N5315N 15NPC D516VD516GH526YH526DS531LS531W315M 15M 43N88N306N43M88M306M1306M2306M3 1 所有的所有的N代表该位点为野生型 代表该位点为野生型 M代表耐药突变 代表耐药突变 2 第一排第一排N1到到N5和第二排的和第二排的D516V到到S531W分别表示利福平敏感和耐药分别表示利福平敏感和耐药 突变位点 突变位点 3 突变位点的氨基酸变化 突变位点的氨基酸变化 D516V D V 代表天冬氨酸突变成缬氨酸 代表天冬氨酸突变成缬氨酸 其它雷同 其它雷同 4 516代表相关基因 这里是代表相关基因 这里是rpoB 上第 上第516个氨基酸 其它位点类同 个氨基酸 其它位点类同 5 315N 15N和和315M 15M分别表示异烟肼敏感和耐药突变 分别表示异烟肼敏感和耐药突变 6 第三排第三排43N 88N代表链霉素敏感 代表链霉素敏感 43M 88M代表代表rpsl基因相应位点基因相应位点 发生耐药突变 发生耐药突变 7 第三排第三排306N代表乙胺丁醇敏感 代表乙胺丁醇敏感 306M1 306M2 306M3代表代表embB 基因发生不同类型的耐药突变 基因发生不同类型的耐药突变 结果判读示例结果判读示例 1 1 利福平敏感 异烟肼敏感利福平敏感 异烟肼敏感 链霉素敏感 乙胺丁醇敏感链霉素敏感 乙胺丁醇敏感 2 2 利福平耐药利福平耐药 S531L 异烟肼敏感 异烟肼敏感 链霉素敏感 乙胺丁醇敏感链霉素敏感 乙胺丁醇敏感 3 利福平耐药 利福平耐药 H526Y 异烟肼耐药 异烟肼耐药 315M 链霉素敏感 链霉素敏感 乙胺丁醇敏感乙胺丁醇敏感 分支杆菌菌种鉴定基因检测分支杆菌菌种鉴定基因检测 PCR 反向点杂交法 基因芯片 非结核分枝杆菌概述非结核分枝杆菌概述 非结核分枝杆菌又称非典型抗酸杆菌或非典型结核杆菌 非结核分枝杆菌又称非典型抗酸杆菌或非典型结核杆菌 广泛分布于自然界广泛分布于自然界 在水 土壤 尘埃 粪便 人及动物在水 土壤 尘埃 粪便 人及动物 体内普遍存在 体内普遍存在 报道报道150150多种 命名多种 命名5454种 多数为腐生菌种 多数为腐生菌 其中其中3 3 种可使 种可使 人和动物致病 我国分离出人和动物致病 我国分离出2020多种 多种 常用的分枝杆菌细检测方法常用的分枝杆菌细检测方法 痰涂片镜检法痰涂片镜检法 最基本的细菌学检查方法 其特 点是简单快速和价廉 但敏感性低 特异性差 分枝杆菌常规培养法分枝杆菌常规培养法 获得的纯培养物可进行菌 种鉴定 药物敏感性试验 2到8周才能报告结果 Bactec TB960Bactec TB960分枝杆菌全自动快速培养系统根据不 同分枝杆菌的理化特性 以生物化学的方法为主 特 异性差 可直接运用痰样 脑脊液 胸腹水 石蜡切片进行 检测鉴定 无需培养 通过16S rDNA基因进行分子水平上的菌种鉴定 可 以鉴定出我国境内分离的98 以上致病性分枝杆菌 芯片进行菌种鉴定特点芯片进行菌种鉴定特点 技术先进性技术先进性 借助核酸分子杂交的特性从分子水平进行借助核酸分子杂交的特性从分子水平进行DNADNA样品信样品信 息的高效分析息的高效分析 准确率高准确率高 检测通量大 一次可以对数检测通量大 一次可以对数2323种分枝杆菌种分枝杆菌进行检测进行检测 和鉴定 和鉴定 检测简便 快速 准确 检测简便 快速 准确 一天一天就可以出结果 就可以出结果 1 胞内分枝杆菌胞内分枝杆菌 MIN 阳性 阳性 结果判断示例结果判断示例 2 结核分