新型紫外衍生试剂用于D2氨基酸的毛细管电泳分离.pdf

新型紫外衍生试剂用于D2 氨基酸的毛细管电泳分离 瞿其曙 31 2 汤晓庆 1 王赪胤 1 杨功俊 1 胡效亚 1 张玉奎 2 阎 超 2 1 扬州大学化学化工学院 江苏省环境材料与环境工程重点实验室 扬州225002 2 中国科学院大连化学物理研究所 国家色谱研究分析中心 大连116011 摘 要 采用一种新型紫外衍生试剂对乙酰氨基苯磺酰氟 PAABS2 F 作为柱前衍生试剂 成功地对19种 标准D2 氨基酸和甘氨酸进行了衍生和毛细管电泳分离 详细研究了各种分离条件对毛细管电泳分离的影 响 实验结果表明 采用20 mmol L硼砂 pH 9 3 126 mmol L十二烷基硫酸钠 8 mmol L 2 环糊精和20 mmol L NaCl时分离结果最佳 16 min内实现了20种氨基酸的基线分离 关键词 毛细管电泳 D2 氨基酸 衍生 2006203202收稿 2006204225接受 本文系国家自然科学基金 No 20175023 20375034 扬州大学自然科学基金 No HK0513013 和扬州大学物理化学国家重点学科 培育点基金资助项目 1 引 言 氨基酸是组成蛋白质的基本单位 在以往的研究中 人们关注更多的是L2 氨基酸的分离和分析 近年来 研究发现一些D2 氨基酸对生命体的影响 1 例如 过多的D2 酪氨酸会抑制老鼠的生长 2 D2 天冬氨酸与细胞衰老和年龄的增长有密切关系 3 此外 D2 氨基酸的存在与某些蛋白质的功能密切 相关 如萤火虫尾部的荧光素含有D2 半胱氨酸 如果转换成L2 半胱氨酸 则不能发光 青霉素分子中 的D2 半胱氨酸若换成L型 则失去抗菌效能 所以 对D2 氨基酸的分离分析将在很多领域起重要作用 氨基酸的分离 分析通常采用气相色谱 4 或高效液相色谱 5 进行 近年来 毛细管电泳 CE 因其 具有进样量少 分离速度快 分离效率高和操作成本低等优点 已被广泛用于食品 药物 环境和生物等 样品中氨基酸的分析 随着D2 氨基酸日益引起人们的关注 对D2 氨基酸的分离就越来越具有十分重要 的意义 但目前尚未见CE分离19种常见D2 氨基酸和甘氨酸的报道 由于大多数氨基酸本身没有紫 外吸收 需要对氨基酸进行柱前衍生然后分离 目前使用的衍生试剂种类很多 但都有各自不同的缺 点 6 本实验采用自制的新型紫外衍生试剂对乙酰氨基苯磺酰氟 PAABS2 F 衍生氨基酸 7 研究表 明 PAABS2F在常温下非常稳定 它与氨基酸衍生反应条件简单 温和 能同时衍生一级和二级氨基 酸 过量衍生试剂不须预先除去 干扰少 衍生反应后可直接进行色谱分析 本研究着重探讨了缓冲液的浓度 pH值 表面活性剂十二烷基硫酸钠 SDS 的浓度 有机添加剂 2 环糊精 2 CD 的浓度以及无机添加剂NaCl浓度对PAABS2F衍生氨基酸分离的影响 从而获得了最 佳的分离条件 实现了19种标准D2 氨基酸和甘氨酸的基线分离 2 实验部分 2 1 仪器与试剂 MDQ P ACE毛细管电泳仪 美国Beckman公司 毛细管总长60 cm 有效柱长50 cm 内径50 m Milli2Q超纯水系统 美国Millilpore公司 D2 氨基酸 甘氨酸 生化试剂 国药集团 SDS 生化试剂 Alfa Aesar 其它试剂均为分析纯 2 2 氨基酸的衍生 准确称取19种常见的D2 氨基酸和甘氨酸并用缓冲液 10 mmol L Na2B4O7 pH 9 3 配制成各种氨 基酸储备液 0 01 mol L 移取各种氨基酸适量置于2 mL的具塞磨口试管内 加入对乙酰氨基苯磺酰 氟 PAABS2 F 的乙醇溶液 0 05 mol L 200 L 甲醇和1 L 混匀 塞紧后将其放入35 恒温水浴中反 应30 min 进样前用0 22 m的膜过滤 衍生剂的制备及衍生反应如图1所示 第34卷 2006年11月 分析化学 FENXIHUAXUE 研究简报 Chinese Journal ofAnalytical Chemistry 第11期 1587 1590 图1 对乙酰氨基苯磺酰氟衍生试剂制备及衍生过程 Fig 1 The synthesis and derivatization processes of p2acetamidobenzenesulfonyl fluoride 2 3 实验方法 采用不同浓度的硼酸盐 SDS 2 CD NaCl以及不同pH值的硼酸盐缓冲溶液 柱温 25 进样压力3 45 kPa 5 s 分离电压25 kV 254 nm 二级管阵列检测器检测 分别对已衍生的氨基酸进 行分离 从而寻找最佳的分离条件 实验前 对缓冲 溶液超声脱气10 min 每次进 样之 前 分 别 用 0 1 mol L NaOH 水 和 缓 冲 溶 液 冲 洗 毛 细 管 柱 2 min 更换缓冲液时 需要再按上述步骤进行冲洗 3 结果与讨论 3 1 缓冲溶液浓度对分离的影响 由于 硼 酸 盐 缓 冲 液 能 提 供 稳 定 的 电 渗 流 EOF 并且具有分离速度快及重现性好等优点 故 本实验采用硼酸盐作为缓冲缓冲溶液 在压力进样 3 45 kPa 分离电压25 kV 柱温25 缓冲液pH 9 3 SDS浓度为126 mmol L 2CD浓度为8 mmol L NaCl浓度为20 mmol L的条件下 改变缓冲溶液中硼酸盐的浓度 对氨基酸进行分离 选择D2 天冬酰 胺 D2Asn D2 缬氨酸 D2Val D2 苏氨酸 D2 Thr D2 异亮氨酸 D2 Ile 和D2 甲硫氨酸 D2Met 5种氨基 图2 硼酸盐缓冲液浓度对迁移时间的影响 Fig 2 Effectof borate concentration onmigration time 126 mmol L十二烷基硫酸钠 sodium dodecyl sulfate SDS 8 mmol L 2 cyclodextrin 2 CD 20 mmol L NaCl pH 9 3 分离电压 running voltage 25 kV 进样 injection 3 45 kPa 5 s 二极管阵列检测器 diode array DAD detection 254 nm 裸熔融石英 毛细管 bare fused silica capillaries 50 cm 50 m i d 峰 peak 1 D2 天冬酰胺 asparagine D2 Asn 2 D2 缬氨酸 D 2valine D2Val 3 D2 苏氨酸 D 2threonine D2Thr 4 D2 异亮氨酸 D 2isoleucine D2Ile 5 D2 甲硫氨酸 D 2methionine D2 Met 酸 考 察 了 氨 基 酸 的 迁 移 时 间 随 硼 酸 盐 浓 度 10 30 mmol L 的变化情况 结果见图2 从图2可以 看出 降低硼酸盐的浓度使电渗流 EOF 增加 从而加快分 离速度 但是 如果EOF过大 会导致氨基酸衍生物的分 离度下降 增加硼酸盐的浓度会提高氨基酸的分离度 但 是浓度过大会引起焦耳热的增加 导致分离效率下降 且使 分离时间延长 本实验选择20 mmol L硼酸盐 因为它能 提供合适的分离时间 良好的分离度和尖锐的峰型 3 2 表面活性剂的浓度对分离的影响 阴离子表面活性剂SDS是CE分离中使用最多的一种 缓冲液添加剂 它对于改善分离度有明显作用 由于加入 不同浓度的SDS对分离时间和分离度都有很大影响 因 此 实验选择了迁移时间非常接近的6种氨基酸 按照迁移 时间从小到大分别为D2Pro D2Asn D2Val D2Thr D2Ile D2 Met 详细考察了不同SDS浓度在上述最佳条件下对分离 度的影响 图3 确定最佳的SDS浓度为126 mmol L 3 3 2CD的浓度对分离的影响 2 CD是常用的手性拆分试剂之一 经常被用在胶束电 动色谱中分离手性化合物 本实验加入少量的 2CD 发现 它能显著提高氨基酸衍生物的分离度 此外 加入适量的 2CD 不仅可以改善分离选择性 而且还可明 显增加电迁移速率 一个合理的解释是 2 CD的包合作用在改善各样品组分相对迁移速率的同时 本 质上减少氨基酸衍生物分子的负电荷密度 进而降低了本身与EOF反向的电泳速度 从而加快了分离 速度 实验结果发现 当保持其它条件不变 在缓冲液中加入8 mmol L 2 CD对分离的改善程度最好 图 4 3 4 缓冲溶液pH值对分离的影响 有些氨基酸的等电点 p I 相差不大 所以要把它们分开 就要选择缓冲液的合适的pH值 因为pH 值能影响分析物质的有效电荷数 8 或影响EOF的大小 从而改变其在毛细管中的迁移速度 通过考 8851 分 析 化 学第34卷 图3 十二烷基硫酸钠浓度对分离度的影响 Fig 3 Effect of SDS concentration on resolution 20 mmmol L硼酸盐 sodium borate pH 9 3 其它条件同 图2 all other conditions are same as in Fig 2 图4 2 环糊精浓度对分离度的影响 Fig 4 Effect of concentration of 2 CD on resolution 20 mmmol L硼酸盐 sodium borate pH 9 3 其它条件同 图2 all other conditions are same as in Fig 2 察缓冲液pH值的变化对氨基酸衍生物分离度的影响 图5 发现当保持其它条件不变 pH 9 3为最佳值 3 5 离子添加剂对分离的影响 文献报道加入NaCl可以改变胶束的大小和形状 并且可以增加胶束的疏水性 9 实验发现 NaCl 的加入对提高分离度具有明显的效果 这主要是由于缓冲液的离子强度的增加使被分析物的溶解能力 和淌度受到了影响 从而提高了分离度 但是加入过多的钠盐会延长分离时间且对基线有影响 实验 结果表明 当保持其它条件不变加入20 mmol L NaCl是最适宜的 3 6 衍生物的分离 按前述优化条件对19种标准D2 氨基酸和甘氨酸进行了分离 结果见图6 从图6中可以看出 PAABS2F与一级 二级氨基酸均可以发生衍生化反应 并且这20种氨基酸都达到了基线分离 分离结 果表明本方法具有很好的应用前景 图5 缓冲液pH对分离度的影响 Fig 5 Effect of pH on resolution 条件 conditions 20 mmmol L硼酸盐 sodium borate 其它 条件同图2 all other conditions are same as in Fig 2 图6 19种标准D2 氨基酸和甘氨酸的色谱图 Fig 6 Electrophoregrams of 19 standardD2amino acids and glycine Gly 20 mmmol L硼酸盐 sodium borate pH 9 3 其它条件同 图2 all other conditions are same as in Fig 2 References 1 Linda S Brunauer S C J B io Chem 1986 261 12538 12543 2 FriedmanM J Agric Food Chem 1999 47 3457 3479 3 Helfman PM Bada J L ShouM Y Gerontology 1977 23 419 425 4 Zhao Y Y CaiL S Jing Z Z Wang H Yu J X Zhang H S J Chrom atogr A 2003 1021 175 181 5 You J M You J LaoW J Wang G J Analyst 1999 124 1755 1760 6 Yu Hong 于 泓 Mou Shifen 牟世芬 Chinese J Anal Chem 分析化学 2005 33 3 398 404 7 Qu Q S Tang X Q Wang C Y Yang G J Hu X Y Li S C Anal Chim Acta 2006 572 212 218 8 YuanWei 袁 炜 L Jiande 吕建德 Fu Xiaoyun 傅小芸 Chinese J Anal Chem 分析化学 2000 28 6 749 752 9 McLaren D G BoulatO Chen D D Y Electrophoresis 2002 23 1912 1920 9851 第11期瞿其曙等 新型紫外衍生试剂用于D2 氨基酸的毛细管电泳分离 Separation ofD2Am ino Acids by Capillary Electrophoresis Using P2Aectam idobenzenesulfonyl fluoride asDerivatization Reagent Qu Qishu3 1 2 Tang Xiaoqing 1 Wang Chengyin1 Yang Gongjun1 Hu Xiaoya1 Zhang Yukui 2 Yan Chao2 1 Jiangsu Key Laboratory of Environm entalM aterials and Environm ental Engineering College of Chem istry and Chem ical Engineering Yangzhou University Yangzhou225002 2 National Chrom atographic Research accepted 25 April 2006 中国化学会第九届分析化学年会暨全国原子光谱学术会议纪要 由中国化学会 中国光谱学会 中国地质学会联合主办 南昌大学承办的 中国化学会第九届分析化学年会暨全国原 子光谱学术会议 已于2006年10月10日至15日在南昌召开 会议就我国自上届学术会议以来分析化学学科的新成 就 新进展和加快我国分析化学学科的发展进行了广泛的学术交流 本次大会与会代表752位 是历届会议中规模最大的一次盛会 中国科学院院士汪尔康 方肇伦 陈洪渊 张玉奎和 第三世界科学院院士董绍俊出席了大会 国家自然科学基金委化学部分析化学学科主任庄乾坤教授到