（药物化学专业论文）几种海洋特征寡糖胶原蛋白复配物对紫外辐射损伤的保护作用及机制研究.pdf

每 1 i i l l r l l f l l lr f l l l r l f l i i i f l l f l l i i l l i l l l l l l f l l l y 1 8 2 8 7 2 5 几种海洋特征寡糖一胶原蛋白复配物对紫 外辐射损伤的保护作用及机制研究 学位论文完成日期 指导教师签字 答辩委员会成员签字 口渗缮 手 黼肋 彳 悭黾 i 纱勉 李三笋 砀 歇w 久 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含未获得 注 翅遗查墓丝益要挂型直盟数 奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意 学位论文作者签名 融签字日期 埘口年厂月牛日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留 使用学位论文的规定 有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和借阅 本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用 影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位论文 同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到 中国学位论文全文数据库 并通过网络向社会公 众提供信息服务 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名 毹匐夏 签字日期 加f o 年f 月牛日 导师签字 咨孝 9 舌 签字日期 a o d 年参月l 日 几种海洋特征寡糖 胶原蛋白复配物对紫 外辐射损伤的保护作用及机制研究 摘要 2 l 世纪是海洋的世纪 海洋中富含的寡糖及生物活性肽 因其良好的抗氧 化 抗紫外 抑癌 促生长等生理活性和药用价值已引起人们的广泛关注 海洋 寡糖及活性肽生物活性的研究与开发 将成为海水养殖产业高值化利用的突破 口 近年来 随着配伍理论的引入 人们逐渐将目光聚焦于海洋四大特征多糖褐 藻胶 卡拉胶 琼胶 壳聚糖与鱼皮胶原蛋白的复配 并已开发出性能良好的改 性生物材料 成功地应用于组织工程学领域 但目前 关于低分子量海洋四大特 征寡糖与鱼皮胶原蛋白活性肽间的复配却鲜有报道 特别是针对其抗紫外作用的 研究 紫外线广泛存在于自然界中 其引起的过量氧自由基会诱导光老化 癌症 及神经退行性疾病的发生和发展 在病理学过程中扮演了重要角色 因此 无论 从经济角度还是人类健康角度出发 对海洋四大特征寡糖与胶原蛋白活性肽的复 配及其改性复配物在抗紫外辐照作用方面的研究 均具有深远的科学意义 本论 文旨在将不同电荷性质 不同聚合度的海洋四大特征寡糖与低分子量鱼皮胶原蛋 白肽进行复配 结合化学分析 药理研究对二者间的配伍规律 抗紫外作用及机 制进行研究 主要研究内容如下 1 复配物的制备与鉴定 低聚甘露糖酸 k 卡拉胶 琼脂糖 壳聚糖经降 解制得不同聚合度的寡糖片段 与低分子量罗非鱼鱼皮胶原蛋白活性肽复配 通 过h p l c 和红外光谱分析二者间的相互作用 结果表明非共价键作用是复配物形 成的内在驱动力 离子间缔合 分子间氢键以及疏水基间的相互作用均对二者的 结合起到促进作用 2 复配物抗氧化 抗紫外作用评价 于分子水平和细胞水平分别测定复配 物对氧自由基的清除能力 细胞活力以及胞内抗氧化酶活力和脂质过氧化水平的 影响 并将复配物与相应单一组分相比较 确定复配对其单一组分活性的提高作 用 经筛选含羧酸根 具阴离子电荷性质 分子量1 0 0 0 左右的甘露糖醛酸与胶 原蛋白活性肽复配产物的抗氧化 抗紫外作用最强 3 复配物抗紫外辐照机理研究 同时建立低剂量和高剂量的紫外辐照细胞 损伤模型 通过检测筛选所得复配物对胞内活性氧水平 胶原酶 i 型胶原蛋白 含量 细胞凋亡以及m a p k s 信号转导通路的影响 并结合f i t c 标记复配物 的胞内定位 对复配物抗辐射机制进行研究 结果表明复配物能够定位于胞内线 粒体 清除胞内氧自由基 提高抗氧化酶活性 通过抑制m a p k s 信号转导途 径激活 抑制辐照后的胶原降解 线粒体上游凋亡分子j n k p 3 8 以及线粒4 t 游凋亡酶c a s p a s e 3 9 的表达 从而抑制光老化和凋亡的发生 降低光损伤程 度 达到对皮肤细胞的保护作用 4 复配物间作用方式及其微观结构分析 结合筛选得复配物及相应单一组 分的z e t a 电势分析以及a f m 对三者微观结构及状态变化的观察 为寡糖与肽 间的离子间作用提供有力的数据支持及更为直观的证据 以上研究提示 寡糖的电荷性质 聚合度以及连接与其上的极性基团 均会 对其与鱼皮胶原蛋白活性肽间的作用方式产生不同程度的影响 引起复配物抗紫 外活性的不同 其能够定位于线粒体 抑制皮肤细胞的光老化和凋亡 起到抗紫 外辐照作用 本论文首次将不同电荷性质 不同聚合度的寡糖与胶原蛋白活性肽 复配后的抗紫外活性进行比较 为海洋四大多糖以及海水养殖产业的高值化利 用提供了有力的技术支撑 并为具有类似结构寡糖 肽复配物药物的设计与开发 提供了新的线索和科学思路 昭 关键词 海洋特征寡糖 鱼皮胶原蛋白活性肽 复配 抗氧化 抗紫外辐 p r o t e c t i v ee f f e c t sa n dm e c h a n i s m so fc o m p l e x e sc o m b i n e d d e e p s e af i s hs k i nc o l l a g e np e p t i d e sw i t hd i f f e r e n tm a r i n e o l i g o s a c c h a r i d e sa g a i n s tu l t r a v i o l e t i n d u c e dd a m a g e a b s t r a c t t h e21s tc e n t u r yi st h ea g eo fo c e a n o c e a n sa lei m p o r t a n tn a t u r a lr e s o u r c e sf o r s e v e r a lp e p t i d e sa n do l i g o s a c c h a r i d e s 谢t l lp o t e n t i a la n t i o x i d a n tp r o p e r t i e s r e c e n t l y t h e r ei sag r o w i n gd e m a n df r o mt h ef o o d p h a r m a c e u t i c a la n dt h ec o s m e t i c si n d u s t r y f o rt h ed e v e l o p m e n to fe f f i c i e n ta n t i o x i d a n t s e s p e c i a l l yf r o mm a r i n ea c t i v ee x t r a c t s t h es p e c i f i cp r o p e r t i e so fe a c hc o l l a g e np e p t i d ea n dm a r i n eo l i g o s a c c a h r i d eo f f e r p o s s i b i l i t i e st op r o d u c ec o m p l e x e st h a tc a l lc o n f e ru n i q u es t r u c t u r a lp r o p e r t i e s t h e p r o t e i n p o l y s a c c h a r i d ec o m p l e x e sh a v eb e e ne x t e n s i v e l ys t u d i e da n da p p l i e di n t i s s u ee n g i n e e r i n g h o w e v e r o n l yf e ws t u d i e sa r ea v a i l a b l et h a tr e l a t et ot h e i m p r o v e m e n to fp r o t e c t i o na g a s i n tu v r a d i a t i o no fs u c hc o m p l e x e s i nt e r m so ft h e i r r o ss c a v e n g i n gc a p a b i l i t y r o sa l eg e n e r a t e db yu vr a d i a t i o n r e s u l t i n gi n p h o t o a g i n g c a n c e ra n dn e u r o l o g i c a ld e g e n e r a t i o n t h u s t os a t i s f i e d 埘t l lt h ep o s s i b l e e c o n o m i ca n dt h et r e a t m e n to fd i s e a s e s t u d y0 1 1p e p t i d e o l i g o s a c c h a l i d ec o m p l e x e s h a sb o t hs c i e n t i f i cs i g n i f i c a n c ea n da p p l i c a t i o nv a l u e s i nt h i ss t u d y w ec o m b i n e dt h e d i f f e r e n t i s o l a t e da n dp u r i f i e d m a r i n eo l i g o s a c c h a l i d e sw i t hc o l l a g e np e p t i d e so ft h e d e e p s e af i s hs k i n a n de v a l u a t e dt h e i ra n t i o x i d a n t a c t i v i t i e sa n dp h o t o p r o t e c t i v e e f f e c t s 讪廿lt h ei n v e s t i g a t i o no ft h e i rp r o t e c t i v em e c h a n i s m sa g a i n s tu v i r r a d i a t e d s k i nd a m a g ea n dt h er e g u l a rp a t t e r no ft h e i rc r o s s l i n k i n g t h em a i ni d e a so ft h i s p a p e ra l el i s t e db e l o w 1 t h ep e p t i d e o l i g o s a c c h a l i d ec o m p l e x e sw e r ep r e p a r e db yc o m b i n i n gt h e d i f f e r e n t i s o l a t e da n dp u r i f i e d m a r i n eo l i g o s a c c h a l i d e s 晰t hb i o a c t i v et i l a p i as k i n c o l l a g e np e p t i d e s t h e i n t e r m o l e c u l a ri n t e r a c t i o n sb e t w e e nt h ep e p t i d e a n d o l i g o s a c c h a r i d eh a v eb e e ni n v e s t i g a t e db yf o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e ds p e c t r o s c o p y f i i r a n ds i z ee x c l u s i o nc h r o m a t o g r a p h y s e h p l c t h er e s u l t sd e m o n s t r a t et h a t t h ei n t e r m o l e c u l a rc h a i na s s o c i a t i o n sw e r ef o r m e db e t w e e no l i g o s a c c h a d d ec h a i n s a n dp e p t i d em o l e c u l e sd r i v e nb yt h ee l e c t r o s t a t i c i n t e r m o l e c u l eh y d r o g e nb o n da n d h y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n s 2 c h e m i c a la n dc e l l u l a rl e v e la s s a y sw e r ep e r f o r m e dt om e a s u r et h ea n t i o x i d a n t a c t i v i t ya n dp r o t e c t i o na g a i n s tu vr a d i a t i o n o fs o m ep e p t i d e o l i g o s a c c h a r i d e c o m p l e x e sv i s a v i st h ea c t i v i t yo fi t so r i g i n a lo rn a t i v em o l e c u l e s r e s u l t si n d i c a t e d t h a tt h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t i e sa n dp r o t e c t i v ee f f e c t sa g a i n s tu vr a d i a t i o no fa l lt h e c o m p l e x e sw e r es t r o n g e rt h a nt h a to ft h e i ri n d i v i d u a l n a t i v ep e p t i d e s e s p e c i a l l yf o r m a l0 0 0 c pa n dk c a 3 0 0 0 c p 3 a n a l y s i so ft h ep r o t e c t i v em e c h a n i s m so fp e p t i d e o l i g o s a c c h a r i d ec o m p l e x e s w a sp e r f o r m e db yf c m e l i s a w e s t e r nb l o ta n dc o n f o c a l r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e c o m p l e xt a r g e t e dm i t o c h o n d r i aa f t e rp e n e t r a t i o no fc e l lm e m b r a n e a n ds u p p r e s s e d i n t r a c e l l u l a rr o sp r o d u c t i o na sw e l la si n c r e a s e dt h ea n t i o x i d a n te n z y m e sa c t i v i t i e s t h ea n t i o x i d a n t p r o p e r t i e s o ft h e c o m p l e x c a na t t e n u a t e u v i n d u c e d s k i n p h o t o d a m a g eb ym o d u l a t i n gm m p 1a n dc o l l a g e n ie x p r e s s i o n a sw e l la s s u p p r e s s i n gc e l la p o p t o s i st h r o u g ht h em a p k ss i g n a l i n gp a t h w a y s 4 t h es u r f a c ee l e c t r i c a lp r o p e r t i e sa n dt h em i c r o s c o p i cs t r u c t u r e so ft h ep e p t i d e o l i g o s a c c h a f i d ec o m p l e xa n di t si n d e p e n d e n to r i g i n a lm o l e c u l e sw e r ep e r f o r m e db y u s i n gz e t ap o t e n t i a la n a l y z e ra n da t o m i cf o r c em i c r o s c o p y r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e c l o s ec o m b i n a t i o n so fo l i g o s a c c h a r i d ec h a i n sa n dp e p t i d em o l e c u l e sm a i n l yd r i v e nb y t h ee l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n s i nc o n c l u s i o n t h es u r f a c ee l e c t r i c a lp r o p e r t i e sa n dt h ed e g r e eo fp o l y m e r i z a t i o n d p o fo l i g o s a c c h a r i d e s h a v ea ni n f l u e n c et o t h ed i f f e r e n t d e g r e e o nt h e c o n f o r m a t i o no fp e p t i d e o l i g o s a c c h a r i d ec o m p l e x e sa n dp r o t e c t i v ee f f e c t sa g a i n s t u vr a d i a t i o n t h ep r e s e n tf i n d i n g so p e nu pn e wa v e n u e si n t ot h ed r u gd e s i g no f h i g h l ye f f i c i e n tp e p t i d e o l i g o s a c c h a r i d ec o m p l e x e sa n dp r o v i d es t r o n gt e c h n i c a l s u p p o r tf o r t h eh i g ha d d e dv a l u eu t i l i z a t i o no fm a r i n ea q u a c u l t u r ei n d u s t r y k e yw o r d s m a r i n eo l i g o s a c c h a r i d e s c o l l a g e np e p t i d e s c r o s s l i n k i n g a n t i o x i d a n t p h o t o d a m a g e 目录 第一章前言 1 1 1 海洋四大特征寡糖的研究现状 1 1 1 1 海洋四大特征寡糖的制备与结构分析 1 1 1 2 海洋四大特征寡糖的生物活性及生物学功能 3 1 2 鱼皮胶原蛋白活性肽的研发与应用 1o 1 2 1 鱼皮胶原蛋白的结构及组成 1 1 1 2 2 鱼皮胶原蛋白的提取 1 2 1 2 3 鱼皮胶原蛋白肽的生物活性研究 13 1 2 4 罗非鱼皮胶原蛋白 15 1 3 抗辐射研究机理 16 1 4 海洋四大特征寡糖与鱼皮胶原蛋白活性肽的复配在抗辐射研究中的前景 1 4 1 海洋特征糖与鱼皮胶原蛋白复配物的研究现状 2 0 1 4 2 海洋特征寡糖与鱼皮胶原蛋白活性肽复配的前景 2 0 参考文献 2 2 第二章复配物的制备与鉴定 2 9 2 1 实验试剂及仪器 2 9 2 2 寡糖的制备 纯化与分子量测定 3 0 2 2 1 实验方法 3 0 2 2 2 实验结果 3 2 2 3 复配物的制备 3 7 2 4 复配物高压液相色谱 h p l c 分析 3 7 2 5 复配物红外光谱 f i t r 分析 4 2 2 6 本章小结与讨论 4 8 参考文献 5 0 第三章复配物的抗氧化作用 5 l 3 1 氧自由基的清除作用 5 1 3 1 1 实验试剂及仪器 51 3 1 2 对d p p h 的清除作用 5 2 3 1 3 对超氧阴离子自由基 0 2 的清除作用 5 4 3 1 4 对羟基自由基 o h 的清除作用 5 8 3 2 细胞紫外辐射损伤模型建立以及m t t 细胞活力检测 6 0 3 2 1 实验试剂与仪器 6 0 3 2 2 细胞紫外辐射损伤模型的建立 6 2 3 2 3m t t 细胞活力检测 6 3 3 2 3 1 实验方法 6 3 3 2 3 2 实验结果 6 3 3 3 抗氧化酶s o d g s h p x 活力以及m d a 含量测定 6 8 3 3 1 实验试剂与仪器 6 8 3 3 2 复配物对细胞s o d g s h p x 抗氧化酶活性以及m d a 含量的影响 6 8 3 4 本章小结与讨论 7 5 参考文献 7 7 第四章复配物抗辐射机理研究 7 9 4 1 实验试剂与仪器 7 9 4 2 复配物对胞内活性氧的影响 8 l 4 2 1 实验方法 81 4 2 2 实验结果 81 4 3e l i s a 检测复配物对光老化细胞的改善作用 8 3 4 3 1e l i s a 检测复配物对细胞m m p 1 含量的影响 8 3 4 3 2e l i s a 检测复配物对细胞c o l l a g e n 1 含量的影响 8 4 4 4 复配物对细胞调亡的影响 8 6 4 4 1 流式细胞术检测细胞调亡 8 6 4 4 2t i 烈e l 细胞调亡检测 8 8 4 4 3w e s t e r nb l o t 检测p a r p 表达 9 0 4 5w e s t e r nb l o t 检测复配物对m a p k 信号转导途径的影响 9 2 4 5 1 实验方法 9 2 4 5 2 实验结果 9 2 4 6 激光共聚焦观察f i t c 标记复配物m a l 0 0 0 c p 在细胞内的定位 9 4 4 6 1 实验方法 9 4 4 6 2 实验结果 9 5 4 7 激光共聚焦观察f i t c 标记复配物m a l 0 0 0 c p 与线粒体共定位 9 6 4 7 1 实验方法 9 6 4 7 2 实验结果 9 7 4 8w e s t e r nb l o t 检测复配物m a l 0 0 0 c p 对c a s p a s e 3 8 9 表达的影响 9 8 4 8 1 实验方法 9 8 4 8 2 实验结果 9 8 4 9 本章小结与讨论 1 0 0 参考文献 一10 0 第五章复配物间作用方式及其微观结构的分析 1 0 3 5 1 实验试剂与仪器 1 0 3 5 2 实验方法 10 3 5 2 1 复配物及其单一组分的z e t a 电势测定 1 0 3 5 2 2 原子力显微镜观察复配物及其单一组分的微观结构 1 0 3 5 3 实验结果 1 0 3 5 3 1m a l 0 0 0 c p m a l 0 0 0 c p 的z e t a 电势分析 1 0 3 5 3 2a f m 对m a l 0 0 0 c p m a l 0 0 0 c p 的微观结构分析 一1 0 4 5 4 本章小结与讨论 1 0 6 参考文献 1 0 7 第六章结论和创新点 一1 0 8 6 1 总结与讨论 10 8 6 2 论文研究主要结论 1 1 0 6 3 创新点 1 1o 几种海洋特征寡糖一胶原蛋白复配物对紫外辐射损伤的保护作用及机制研究 第一章前言 1 1 海洋四大特征寡糖的研究现状 继蛋白质 核酸之后 糖链已成为生命科学中人们关注的又一焦点 其惊人 的复杂性和多样性 使糖链包含高出蛋白质 核酸几个数量级的巨大信息量 l 其功能复杂多样 几乎参与了所有真核生物的每一个生命过程 经过近2 0 年的 研究 糖链的生物学功能正不断被揭示 其不仅能够影响蛋白质的折叠 溶解度 半衰期 抗原性及生物活性 还能通过与蛋白质间的相互作用介导细胞的专一识 别 进一步调控生命过程 2 1 除此之外 糖链自身也能作为信号传导分子在生命 信息的传递过程中发挥重要作用 归根结底 无论是对受精 发育 分化 神经 系统和免疫系统恒态的维持 还是在炎症 老化 自身免疫病 癌细胞异常增殖 及转移等过程中 都涉及到糖链的参与 其在生命和疾病特别是疑难疾病的发生 发展过程中起到了举足轻重的作用 糖链的生物学功能取决于其寡糖残基 3 4 这就促使寡糖成为糖化学以及糖 生物学领域的研究热点 由于其单糖分子结合位置 结合类型和衍生化修饰的不 同 使得寡糖种类繁多 功能各异 5 海洋作为生命的发源地 其生物多样性和 化学多样性远胜于陆地 以壳寡糖 褐藻寡糖 卡拉胶和琼胶寡糖等为代表的海 洋性寡糖 来源丰富 结构独特 尤其是在结构特点和生物活性方面与内源性寡 糖有诸多相似点 因此 海洋特征寡糖在糖化学 糖生物学中作为外源性特征糖 链的支援作用正逐渐被人们重视起来 具有极大的开发潜力和研究价值 6 1 1 1 1 海洋四大特征寡糖的制备与结构分析 1 1 1 1 寡糖的制备 寡糖的制备方法有很多 主要可分为化学方法以及特异酶裂解的生物方法 1 化学法 主要包括酸降解 氧化降解 自由基降解以及碱降解等 其中 以酸降解法为主 该法主要适用于得到不同的酸性片段 如对褐藻胶m g 杂合 段降解从而分离m 段和g 段 7 1 于广利等 8 1 在温和条件下通过盐酸水解 降解 来自k a p p a p h y c u ss t r i a t u m 的卡拉胶 制得d p 为5 7 1 1 的三种寡糖 除了经 几种海洋特征寡糖一胶原蛋白复配物对紫外辐射损伤的保护作用及机制研究 典的酸解法 氧化降解法也常被采用 通过氧化法降解壳聚糖可得相对分子质量 分布范围较大的低分子壳寡糖 2 生物法 生物酶法制各寡糖是目前广泛采用的方法 与化学方法不同的 是其所获得的产物为聚合度或结构专一的寡糖 生物裂合酶主要来源于海洋软体 动物 m a r i n em o l l u s k s 棘皮动物 e c h i n o d e r m s 的消化腺及海洋细菌 真菌等1 9 k n u t s e n 等 1o 采用k 卡拉胶裂解酶 来自p s e u d o m o n a sc a r r a g e e n o v o r a 对两种 红藻f u r c e l l a r i al u m b r i c a l i s 和e u c h e u m ag e l a t i n a e 的卡拉胶进行降解 得到非还 原端的低分子量的寡糖 日本学者s h i m o d a 等 l l 从海洋细菌a l t e r o m o n a ss p 中发 现的壳糖酶 不但可以降解壳聚糖 同时还可以把p 1 4 连接的糖苷键转为p 1 6 构型 从而获得b 1 6 连接的寡糖 随着分子生物学和生物工程技术的发展 使通过基因突变 基因重组等方法制备裂解酶成为可能 极大的拓宽了酶解法的 应用范围 利用构建基因组文库和水解圈筛选法得到的琼胶酶 在琼脂的降解中 被广泛采用 其一般可分为两类 一类是a 琼胶酶 裂解琼胶糖的a 1 3 糖苷 键 生成以b d 半乳糖为非还原末端和以3 6 内醚 a l 半乳糖为还原末端的琼 寡 a g a r o o l i g o s a c c h a r i d e s 系列 另一类是p 琼胶酶 裂解琼胶糖的p 1 4 糖苷键 生成以p d 半乳糖为还原末端和以3 6 内醚 0 l 半乳糖为非还原末段 的新琼寡糖 n e o a g a r o o l i g o s a c c h a r i d e s 系列 l 引 1 1 1 2 寡糖的分离纯化与结构分析 由于寡糖链具有极大的不均一性 其分离纯化以及结构鉴定是阻碍生物学研 究的瓶颈 也是一项探索性很强的工作 1 寡糖的分离纯化 凝胶色谱在寡糖的分离领域应用广泛 其利用分子筛 原理对不同的寡糖进行分离纯化 目前 在褐藻胶寡糖分离的初期和后期都用到 该法 ym a t s u b a r a 等 和z z h a n g 等f 1 4 分别采用b i o g e lp 6 凝胶色谱法和低 压凝胶色谱 l p g p c 对经褐藻胶裂解酶处理后的寡糖进行分离 最终得到聚 合度单一的几种寡糖 除此之外 膜分离技术 离子交换色谱法 反向吸附液相 色谱法以及高效毛细管电泳 h p c e 在不同聚合度分布寡糖的分离 纯化中逐 渐发展起来 并得到了广泛应用 2 寡糖的结构分析 传统的寡糖分析方法如甲基化分析 s m i t h 降解 高碘 几种海洋特征寡糖一胶原蛋白复配物对紫外辐射损伤的保护作用及机制研究 酸氧化等化学手段 已经远远不能满足寡糖结构分析的需要 而光谱技术的成熟 和应用改变了这种局面 尤其是红外 i r 核磁共振 1 d n m r 2 d n m r 等 质谱 m s 与各种色谱技术的联合应用 为寡糖的分离和分析提供了可能 k n u t s e n 等 1 0 采用n m r 法对降解得到的寡糖进行系统的结构分析 此后该方法 被陆续采用 并逐步由1 d n m r 扩展到2 d n m r 技术 1 9 9 4 年c r o c h a s 等 1 5 j 采用1 3 c n m r 法分析了a 琼脂水解酶水解琼脂糖的寡糖产物 在还原端发现以 d 半乳糖和3 6 内醚 a l 半乳糖为单体组成的寡糖 并对琼寡糖和新琼寡糖的 结构差异进行比较 目前 质谱已成为寡糖分析最常采用的方法之一 其样品用量少 且易于与 分离手段联用实现自动化 由于各种软电离手段和不同用途质谱仪的出现和普 及 使得质谱更易于获得寡糖分子量及其结构片段信息 为进一步确定寡糖组成 和糖残基间的连接顺序提供重要依据 目前常采用的质谱技术有电喷雾电离质谱 e s i m s 基质辅助激光解析质谱 m a l d i m s 基质辅助激光解析飞行时 间质谱 m a l d i t o f m s 等 z h a n g 等 1 6 1 采用负离子方式电喷雾串联质谱 e s i m s m s l e o n e 等 1 7 采用m a l d i t o f m s t c h a k i 等 1 8 采用 e s i o t o f m s m s 分别对褐藻胶寡糖进行分析 均取得了理想的效果 2 0 0 4 年 和2 0 0 6 年a a n t o n o p o u l o s 等 1 9 和j t a g u i l a n 等 2 0 分别报道了使用离子对色谱串 联电喷雾质谱方法和阳离子模式的n a n o e s i f t i c r m s 方法对k 卡拉胶寡糖的 结构进行了成功的分析 1 1 2 海洋四大特征寡糖的生物活性及生物学功能 海洋来源的寡糖主要包括来自褐藻的褐藻胶寡糖 褐藻糖胶寡糖和褐藻淀粉 寡糖 红藻的卡拉胶寡糖和琼胶寡糖 绿藻的绿藻寡糖以及来自甲壳动物的壳寡 糖 海藻糖中对来源于褐藻和红藻的寡糖研究较多 其可作为保湿剂 生物活 性物质稳定剂和保护剂 广泛用于生物制剂 医药 食品 化妆品及农业科学 等各个行业 1 1 2 1 褐藻寡糖类 褐藻中至今已发现有3 种主要多糖成分 即褐藻胶 a l g i n 褐藻糖胶 几种海洋特征寡糖一胶原蛋白复配物对紫外辐射损伤的保护作用及机制研究 f u e o i d a n 和褐藻淀粉 l a m i n a r a n 褐藻胶和褐藻糖胶是褐藻生物细胞壁的填 充物质 而褐藻淀粉存在于褐藻细胞质中 在海带中 褐藻胶约占1 9 1 7 褐藻 糖胶约占0 3 1 5 褐藻淀粉一般约占1 左右 因此 作为来源最为广泛的海 藻糖之一 褐藻胶糖类的结构以及生物活性研究的最为透彻 褐藻胶 a l 西n 是一类直链无分支的多糖类化合物 是水溶性褐藻酸钠 钾 等碱金属盐和水不溶性褐藻酸与二价金属离子相结合的褐藻酸盐类的统称 主要 来源于海带 马尾藻 巨藻等褐藻 褐藻酸是由p d 1 4 甘露糖醛酸 m a n n u r o n i c a c i d m 和o l 1 4 古罗糖醛酸 g u l u r o n i ca c i d g 所组成的二元线型 嵌段化合物 其分子中存在三种不同的结构片段 b d 1 4 连接的聚甘露糖醛 酸 p o l y m a n n u r o n a t c p m a l 1 4 连接的聚古罗糖醛酸 p o l y g u l u r o n a t e p g g 与m 交替共聚的片段p m g 7 图1 1 在褐藻胶中 m 与g 的比值根 据藻类不同 地域不同 季节不同及在藻类中分布部位不同而呈现差异 大致为 2 1 至l 2 1 2 q hh h mmm 憨一 m gggg 霹缈 mgmg 图1 1 褐藻胶寡糖结构 4 几种海洋特征寡糖一胶原蛋白复配物对紫外辐射损伤的保护作用及机制研究 近年来与内源性糖类肝素 类肝素生物活性相似的低分子量褐藻胶寡糖 已 成为新的研究热点 其具有免疫调节 促生长 促进生物活性物质释放 抗氧化 瞄 等多种生物活性 1 免疫调节活性 褐藻胶寡糖能够经多层次 多途径调节免疫系统 其 中包括对各类免疫细胞 细胞因子以及补体的调节 1 w a m o t o 等 2 3 j 和y a m a m o t o 等 2 4 均发现褐藻胶寡糖能够诱导小鼠巨噬细胞系r a w2 6 4 7 细胞产生多种细胞 因子 不饱和褐藻胶寡糖末端的结构对肿瘤坏死因子 t u m o rn e c r o s i sf a c t o r a l p h a t n f a 白介素i l 1 a i l 1 p i l 6 i l 9 i l 一1 3 粒细胞集落刺激因子 g r a n u l o c y t e c o l o n y s t i m u l a t i n gf a c t o r g c s f 单核细胞化学引诱蛋白一1 m o n o c y t e e h e m o a t t r a c t a n tp r o t e i n 1 m c p 1 粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子 g m c s f 和嗜酸细胞活化趋化因子 e o t a x i n 的释放都具有诱导作用 而通过酸解制得的 具有饱和末端的寡糖则几乎没有诱导作用 同年y a m a m o t o 小组 2 5 通过体内实验 进一步研究了褐藻胶寡糖对细胞因子的影响 其向小鼠腹膜内注射酶解的褐藻胶 寡聚古罗糖醛酸g 3 g 6 和寡聚甘露糖醛酸m 3 m 6 通过监测小鼠血清中细胞因 子水平 发现2 3 种细胞因子中有2 0 种的含量都获得不同程度的升高 x u 等 2 6 在褐藻胶寡聚物结构研究的基础上 合成出两种类似物p d 1 4 甘露糖醛酸 二糖和b d 1 4 古罗糖醛酸三糖拟糖脂 对甘露糖醛酸t 0 l l 样受体 t l r 的配体调节免疫应答进行模拟 2 促生长作用 褐藻胶寡糖的促生长作用不仅体现在动物细胞 还体现在 整体植物上 k a w a d a 等 2 7 于19 9 7 年发现褐藻胶寡糖混合物对人角质化细胞生 长有促进作用 该小纠2 8 于1 9 9 9 年进一步发现经酸解的褐藻胶寡糖能够通过 v e g f 介导 促进人上皮细胞的生长和转移 其中5 m g m l 的褐藻胶寡糖混合物 即可刺激上皮细胞生长和迁移 而高浓度的寡糖混合物 约1 0 0 m g m 1 则会抑 制细胞生长 同年 t a j i m a 等 2 9 1 研究了褐藻胶寡糖对人皮肤成纤维细胞形态学 细胞增殖和胶原表达的调节作用 研究发现寡糖在l o m g m l 剂量下即可抑制成 纤维母细胞增殖 并伴随细胞形状的改变 此外 褐藻胶寡糖对植物促生长作用 也有较多报道 3 促进生物活性物质的释放 a o y a g i 等 3 0 发现富含g 片段的褐藻胶可以 促进长春花属植物吲哚型生物碱的释放 a l d m o t o t o m i y a m a 等 1 8 则发现褐藻胶 几种海洋特征寡糖一胶原蛋白复配物对紫外辐射损伤的保护作用及机制研究 寡聚物可促进长春花属植物c a t h a r a n t h u sr o s e u s 细胞磷酸二酯酶的释放 采用寡 糖做激发子在工业上生产多种重要的微生物产物是一种新的技术 具有广阔的发 展前景 a r i y o 掣3 1 l 发现褐藻胶寡糖能提高青霉素g 的产量 寡聚m 可将其提 高4 7 而寡聚g 则可提高4 9 r a d m a n 等 3 2 发现作为激发子的褐藻胶寡糖能 够提高土霉素链霉菌 产黄青霉菌等的次级代谢产物产量 并考察了活性氧簇 r o s 作为其激发作用评估指标的可行性 4 抗氧化作用 尽管已有较多的研究报道 但尚未有明确的机理解释 研 究发现 糖环上的还原性羟基可捕捉脂质过氧化链式反应中产生的活性氧 阻断 或减缓脂质过氧化的进行 起到抗氧化作用 3 3 1 也有研究认为 糖环上的 o h 可与产生o h 等所必需的金属离子 f e 2 c u 2 等 等络合 使其不能产生启动 脂质过氧化的经自由基或使其不能分解脂质过氧化产生的脂过氧化氢 从而抑制 活性氧的产生 蚓 另外 其还是皮肤细胞的保护因子 修复因子 可有效保护 免受由放射线引起的损伤 实验研究证明 1 0m m o l k g 的褐藻糖 可使活细胞 承受正常剂量4 3 倍的a b 射线 3 4 1 褐藻寡糖对与一些无法在常温和长时间保 持活性的生化物质具有良好的保护作用 可通过提高超氧化物歧化酶 s u p e r o x i d e d i s m u t a s e s o d 过氧化氢酶 c a t a l a s e c a t 谷胱甘肽还原酶 g l u t a t h i o n r e d u c t a s e g s h p x 等抗氧化酶的活性 发挥其抗氧化作用p 4 j 5 保湿作用 糖分子中的羟基 羧基和其他极性基团可与水分子形成氢键 结合大量水分 同时 糖链间还可相互交织成网 起到较强的保水作用 另外 多糖具有良好的成膜性能 可形成均匀薄膜 减少水分蒸发 常用做高效皮肤保 湿剂 其能够使水分从基底组织弥散到角质层 诱导角质层进一步水化 达到润 肤保湿的效剽 5 j 1 1 2 2 红藻寡糖类 红藻中的多糖成分主要存于红藻的细胞壁中 分为卡拉胶 c a r r a g e e n 和琼 胶 a g a r o s e 两种 1 1 2 2 1 卡拉胶寡糖 卡拉胶是对从角叉菜属 麒麟菜属 杉藻属和沙菜属等海洋红藻中提取的一 6 几种海洋特征寡糖一胶原蛋白复配物对紫外辐射损伤的保护作用及机制研究 类硫酸半乳糖的统称 也是目前研究最为广泛的一类海洋红藻多糖 卡拉胶中一般含有1 3 和1 4 两种连接的半乳糖重复二糖单元结构 根 据半乳糖上硫酸基的含量和取代位置不同分为十多种表现型 其中应用较为广泛 的主要有k k a p p a 和九一 l a m d a 两种 图1 2 0隙s03 oh d 图1 2 k 卡拉胶和k 卡拉胶结构图 卡拉胶寡糖的生物活性是目前的研究热点 其具有显著的抗氧化 诱导胚胎 发生 免疫调节和抗癌活性 1 抗氧化活性 2 0 0 5 年y u a n 等 冽对1 c 卡拉胶寡糖及其过硫酸化 乙酰化 及磷酸化衍生物的抗氧化活性进行比较 研究发现 过硫酸化物能有效清除超氧 阴离子 磷酸化产物和低聚合度的乙酰化产物清除羟基自由基效果显著 而磷酸 化衍生物清除d p p h 离子能力最为突出 研究表明 卡拉胶寡糖所含有的硫酸基 对氧自由基的清除有促进作用 而其分子量与抗氧化活性之间并不存在明显的关 联 2 诱导胚胎发生 2 0 0 1 年 p e n h u i z i c 纠3 6 1 为了模拟b r a s s i c ao l e r a c e a 小孢 子母细胞胚胎发生所需的生物压力 选取了8 种寡糖成分 分别来自果胶 褐藻 胶 岩藻聚糖 海带淀粉 琼胶 静卡拉胶 1 卡拉胶 n 卡拉胶 只有卡拉胶 寡聚物体现出了对小孢子母细胞胚胎发生的诱导功能 尤其是n 卡拉胶的存在能 显著的增强小孢子母细胞受热诱导的胚胎发生 3 免疫调节和抗癌活性 2 0 0 6 年y u a n 等 3 7 1 对小鼠耐受可移植肉瘤细胞 7 几种海洋特征寡糖一胶原蛋白复配物对紫外辐射损伤的保护作用及机制研究 1 8 0 的能力进行了观察 小鼠灌输 1 8 0 悬液后 分别以5 0 1 0 0 a n d2 0 0 州g 注射k 卡拉胶寡糖1 4 天 并分别测定了其巨噬细胞的吞噬作用 绵羊红细胞溶 血作用 淋巴细胞增殖 n k 细胞 自然杀伤细胞 活性 i l 一2 水平 t n f q 水 平 发现卡拉胶寡糖能显著抑制s 1 8 0 的生长 增强巨噬细胞的吞噬