N0.5 PCR 技术支持培训 维修 配件2012-10.pdf

聚合酶链式反应 PCR 第五部分 技术支持培训用 广州万诚医疗设备技术服务有限公司 工程师 李想斌 020 81122149技术服务技术服务QQ 409945430 提供提供PCR维修 配件 技术支持维修 配件 技术支持 2012 10 1 试剂盒技术特点 试剂盒三大独特技术设计 负压纯化柱提取 使用双色荧光设计内标 定量更准确 标准品参与提取 PCR检测核酸提取是关键 核酸提取 循环扩增 结果检测分析 自动化程度已 经很高 操作 难度已经降低 成为操作难点 是保证实验结 果的关键 核酸提取对结果的影响 抑制DNA聚合酶的活性可导致结果偏低 以及假阴性 很多物质可以抑制DNA聚合酶活性 标本因素抑制 溶血 高脂血症 黄疸等 提取试剂残余物抑制 酚 氯仿 乙醇等 模板损失要影响定量结果 易造成假阴性 负压纯化柱提取 原理 采用硅胶膜吸附 核酸 而对其他生化组 分如蛋白质 多糖 脂 类既不相亲也不吸附 因而可得到纯化的核酸 负压纯化柱抽提操作简单 裂解 移入柱 洗涤两次 洗脱 负压纯化柱抽提的优点 操作难度低 易于掌握 适应性强 能用于各种DNA RNA病毒 提取物可用于其他分子生物学检测 对离心要求低 对实验环境无污染 科华试剂抗干扰实验 干扰物 浓 度检测值检测值检测值 g L copies m l copies m l copies m l 对照0 2 5 10 4 0 2 5 10 4 0 2 5 10 4 10 195 2 3 10 4 12 5 3 9 10 4 6 25 1 9 10 4 21 56 2 9 10 4 25 3 9 10 4 12 5 1 7 10 4 36 25 2 9 10 4 50 4 5 10 4 25 2 5 10 4 450 1 9 10 4 100 3 7 10 4 50 2 0 10 4 5200 3 1 10 4 200 4 9 10 4 100 1 7 10 4 血红蛋白血脂胆红素 样品浓度 mg dL 浓度 mg dL 全溶血的标本对定量结果没有明显影响 高脂 高胆红素血症也对定量结果没有明显影响 内标设计原理 内标为一已知低含量的与 模板扩增效率相似的一段 DNA片段 将它加入PCR反 应液中 与模板共同扩增 以反应每管真实的扩增情 况 如果内标和样品都未 扩增出结果 则表示该管 扩增无效 应重新做 样本 内标 双色荧光补偿原理 640705 波长 荧光强度 样本 内标 内标曲线 用了颜色补偿程序的内标图 未用颜色补偿程序的内标图 内标 避免假阴性 定量更准确 内标的种类 同源 异源 竞争 非竞争 使用竞争性内标 真实反应扩增效率 避免假阴性 假阴性是目前PCR最大的问题 之一 内标相当于每管都进行质控 科华试剂定量不使用内标 仍用外 标定量 标准品参与提取 标准品与标本同样处理结果更准确 重复性更好 定量更准确 不需要额外的阳性对照 实质上四个阳性对照 降低了成本 防污染技术 UNG的应用 在试剂中采用UNG dUTP技术可有效 避免扩增产物对本次扩增的影响 其原理是在扩增中利用dUTP代替 dTTP 这样扩增产物中就含有dUTP 在下一次扩增前 如被以前扩增产 物所污染 用UNG 尿嘧啶糖苷酶 可消解含dUTP的模板 因而可防止 污染 在加热变性阶段 UNG失活 不能对新扩增产物起作用 试剂盒优点及技术指标 科华试剂的优点 抗干扰性强 每管质控 结果更准确 纠错成本 低 标准曲线参与提取 定量更准确 结果重复性更好 有效防止污染 操作难度低 人为因素引起的错差 小 新手也很容易掌握 负压提取 无实验室污染 敏感度 特异性及线性