工业微生物育种论文.doc

紫外诱变大肠杆菌青霉素抗性突变株筛选 摘 要：人工诱变微生物育种具有速度快、收效大的优点，在生产和科研中被广泛应用。常规的微生物育种技术主要分为物理诱变、化学诱变、生物诱变三种。为了得到大肠杆菌链霉素抗性突变株，本设计采用物理诱变中紫外诱变的方法，并对得到的菌种进行筛选，从而获得对青霉素有较高抗性的大肠杆菌的突变株。 关键词： 紫外诱变 大肠杆菌 青霉素 抗性突变株 紫外线的波长在200380 nm 之间，但对诱变最有效的波长仅仅是在253265 nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254 nm。紫外线诱变的主要生物学效应是由于DNA 变化而造成的，DNA 对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA 结构变化的形式很多，如DNA 链的断裂、碱基破坏。但其最主要的作用是使同链DNA 的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而引起微生物突变或死亡。经紫外线损伤的DNA，能被可见光复活，因此，经诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和可见光的照射，故经紫外线照射后样品需用黑纸或黑布包裹。另外，照射处理后的孢子悬液不要贮放太久，以免突变在黑暗中修复。切补修复：DNA修复机制之一。认为是经过下列四步酶促反应完成的。（1）由能识别损伤部位的特异内切核酸酶在损伤部位附近打开缺口；（2）外切核酸酶将损伤部分从DNA切除；（3）以未受损伤一方的DNA单链作模版，修复填补损伤链中切除产生的缺口；（4）由连接酶把修复好的DNA部分与原有的DNA接上，成为完整的DNA。目前催化该反应的酶制剂已从微生物分离成功。现知作为人体多发性皮肤癌遗传病的色素性干皮病患者的表皮细胞切补修复能力低，在上面的（1）（3）的反应中，某一步反应不正常。 所需菌种为大肠杆菌；所需培养基（完全培养基）为肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏0.5 g、蛋白胨1.0 g、NaCl0.5 g、水100 mL、pH=7.2、100 KPa 、121高压蒸汽灭菌20min、琼脂1.5%2%。）主要药品：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、可溶性淀粉、青霉素。主要器皿：试管30支、移液管1mL10支、5mL3支、10mL1支、锥形瓶10个、量筒、烧杯、培养皿30个、离心管、20 W 紫外灯、磁力搅拌器、离心机、紫外诱变箱等。 菌种介绍：大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli） 革兰氏阴性短杆菌，大小0.513微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病。但若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在肠道中大量繁殖，几占粪便干重的1/3。兼性厌氧菌。在环境卫生不良的情况下，常随粪便散布在周围环境中。若在水和食品中检出此菌，可认为是被粪便污染的指标，从而可能有肠道病原菌的存在。因此，大肠菌群数（或大肠菌值）常作为饮水和食物（或药物）的卫生学标准。（国家规定，每升饮用水中大肠杆菌数不应超过3个）大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K），后者有抗机体吞噬和抗补体的能力。根据菌体抗原的不同，可将大肠杆菌分为150多型，其中有16个血清型为致病性大肠杆菌，常引起流行性婴儿腹泄和成人肋膜炎。大肠杆菌是研究微生物遗传的重要材料，如局限性转导就是1954年在大肠杆菌K12菌株中发现的。莱德伯格（Lederberg）采用两株大肠杆菌的营养缺陷型进行实验，奠定了研究细菌接合方法学上的基础，以及基因工程的研究。 实验设计内容：1. 出发菌株 把大肠杆菌斜面培养到对数期，以便得到大量的大肠杆菌。2. 前培养 出发菌株移接新鲜斜面培养基，以肉汤为主，适量加入核酸类物质或酵母膏等制成营养丰富的培养基，同时还可以加入抑制修复的物质，如咖啡碱或异烟肼等。37培养1624h，将菌体培养到最佳生理状态，利于诱变。3. 菌悬液的制备取已培养20 h 的活化大肠杆菌斜面一支，用10 mL 生理盐水将菌苔洗下，取4mL于5mL离心管中离心(3000 r/min)15min，弃上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2 次，最后制成菌悬液并倒入盛有玻璃珠的锥形瓶中，强烈振荡10 min，以打碎菌块，用无菌滤纸活脱脂棉过滤使之形成单菌悬液。菌悬液浓度为为108/mL。4. 平板制作 将肉膏蛋白胨培养基熔化后，冷至45左右倒平板。待平板完全冷却后，取0.1mL链霉素用无菌棒涂布于平板上。其中留三块平板不涂布链霉素作为对照。5. 诱变处理(1) 预热 正式照射前开启紫外灯预热30 min。(2) 搅拌 取制备好的菌悬液5 mL 移入6 cm 的无菌培养皿中，放入无菌磁力搅拌捧，置磁力搅拌器上，20 W 紫外灯下30 cm 处。(3) 照射 然后打开皿盖边搅拌边照射，剂量分别为5s，10s，15s。可以累积照射，照射完毕先关上皿盖再关闭搅拌和灯。所有操作必须在红灯下进行。4. 稀释涂平板 在红灯下分别取未照射的菌悬液(作为对照)和照射过的菌悬液各0.5mL 进行适当稀释分离。取最后3 个稀释度的稀释液涂于肉膏蛋白胨平板上，每个稀释度涂3 个平板，每个平板加稀释液0.1 mL，用无菌玻璃刮棒涂匀，37培养48 h(用黑布包好平板)。注意在每个平板背后要标明处理时间、稀释度、组别。5.诱变后培养 取1mL诱变处理好的菌悬液接入肉膏蛋白胨液体培养基中进行后培养，37120rpm摇瓶避光培养；6.菌株的筛选 将经过诱变后培养的菌悬液适当稀释后，分别涂布于含最小抑制浓度的青霉素培养基平板上，37培养长出的菌落即为青霉素抗性突变株。观察紫外诱变的效果。7.遗传稳定性鉴定筛选出的菌株，要经过多次传代之后，再进一步鉴定其对青霉素抗性是否发生了变化。如果产生了回复突变，则需要重复诱变筛选过程，直至到筛选出遗传稳定的高产菌株为止。注意事项1、用作诱变处理的菌液应尽量使其分散成单细胞，使每个细胞能均匀的被紫外线照射，以避免产生不纯的单菌落。2、照射后的操作都必须在暗室内红光下进行。3、在整个过程中注意无菌操作，避免被杂菌污染。 结束语：在微生物育种研究领域，随着相关基础学科的研究发展，利用基因工程、代谢工程等现代生物技术，合理改造代谢途径，构建优良菌株的研究受到关注，成为育种领域一个研究热点和微生物药物工业育种发展的一个重要方向。化学诱变与其他传统诱变育种方法一样，具有盲目性和随机性等不足，但也有无需知晓遗传背景和代谢途径、操作简便、不需要价格昂贵的现代高档仪器设备等显著优势。同样因随着技术发展和仪器开发而异军突起的物理诱变技术也存在着无法控制诱变方向、工作量大、诱变产物安全性不确定等问题。但随着研究的深入，广大微生物学工作者的不懈努力，相信这些困难定会被克服。 参考文献 1 程世清. 产色素菌T_(17-2-39)的诱变育种试验J. 江苏食品与发酵. 2000(2): 9-12.2 孙玉雯，崔承彬. 抗生素抗性筛选在微生物菌株选育中的作用J. 国际药学研究杂志. 2008(3): 213-217. 3