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耐受性树突状细胞的研究进展徐东亮 综述唐孝达审校(上海市第一人民医院泌尿外科 ,上海200080)摘要树突状细胞 (DC) 是已知最强的抗原呈递细胞 ,在机体内可诱导强烈的免疫反应 。但随着对 DC 深入研究发现 ,DC 的来源 、表型及其功能都具有明显的多样性和异质性 。DC 既可以刺激免疫反应 ,也可诱导免疫耐受 ,目前对其机制不甚清楚 。最近有人提出耐受性 DC 的概念 。关键词树突细胞 ;移植 ;免疫耐受 文章编号 1001 24594 (2003) 0320256204 中图分类号 R617 文献标识码 A自 1954 年世界首例成功的肾移植实施以来 ,器官移植在治疗某些终末期疾病上已取得了巨大的成 就 。随着 CsA 、FK506 等强力高效的免疫抑制剂的 不断问世 ,移植器官的存活率已大大提高 。可目前所用的免疫抑制剂都为非特异性 、毒性大且往往需 终身服药 。这不仅给患者带来沉重的经济负担 ,还 常导致严重的机会感染和恶性肿瘤的发生 ,以及移 植器官的过早失功等副作用 。因此 ,当今器官移植 领域所面临的最大难题是如何诱导移植耐受 、防止移植物排斥 。近年来 ,随着对抗原呈递细胞 ( antigen presenting cell , APC) 特 别 是 树 突 状 细 胞 ( dendritic cells ,DCs) 的 深 入 研 究 , 发 现 DC 不 仅 是 最 有 效 的 APC ,而且 DC 本身具有调节免疫反应 、诱导免疫耐 受的作用 , 因而提出耐受性树突状 细 胞 ( tolerogenicDC) 的概念 。本文就耐受性树突状细胞在移植免疫 耐受中的研究进展作一简要综述 。1 DC 的不同亚群与免疫反应的关系树突状细胞 (DC) 因其表面具有星形或树枝状 突起 而 得 名 。一 般 认 为 成 熟 DC 是 已 知 最 强 的APC ,在机体内可诱导强烈的免疫反应 。但随着对DC 发育 、分化和功能认识的不断深入 , 发现 DC 的来源 、表型及其功能都具有明显的多样性和异质性 。DC 向 T 细胞呈递抗原可致两种不同结果 :免疫刺激(免疫原性) 或免疫抑制 ( 耐受原性) 1 。DC 是表现 耐受原性还是与其相反的免疫原性 ,其机制仍不明 确 。目前有两种观点 : 一是认为机体内存在不同的 DC 亚群 , 负责不同 的 功 能2 。根 据 表 面 标 志 可 将 DC 划 分 为 一 种 淋 巴 样 DC ( lymphoid dendritic cell , LDC ) 和 两 种 髓 样 DC ( myeloid dendritic cell , MDC) 1 ,3 ,LDC 除散布于间质组织 ,还局限于次级淋 巴组织的 T 细胞区 ;而 MDC 位于次级淋巴组织的边 缘区 。DC 在同一淋巴组织中的不同定位 ,提示存在 不同的功能亚群 。的确 , 淋巴结 T 细胞区的 DC 是 呈递 MHC 类分子2自身肽的主要细胞 , 从而支持 LDC 具有维持自身耐受的作用 ;而 MDC 是呈递外来 抗原的主要细胞 ,可引起 T 细胞免疫反应4 。MDC+可诱导 CD4 T 细胞的明显增殖反应 ,与此相比 LDC+诱导 CD4 T 细胞反应有限 ,并可能与 Fas/ FasL 介导的细胞凋亡有关 。MDC 可诱导引流淋巴结内高水8044Meyer AL , Bruening EE , Dunkle WE , et al . Anti Viral Res , 2001 ; 52 (3) :289300Marschall M ,Stein GM ,Freitag MK ,et al . J Gen Virol ,2001 ;82 ( Pt6) :14391450Marschall M ,Stein GM ,Freitag MK ,et al . J Gen Virol ,2002 ;83 ( Pt5) :10131023Sullivan V. Nature ,1992 ;358 (6382) :162164Chou S , Waldemer RH , Senters AE , et al . J Infect Dis ,2002 ; 185 ( 2) :162169Ijichi O ,Michel D ,Mertens T ,et al . Antiviral Res ,2002 ; 53 ( 2) : 135142Emery VC. J Clin Virol ,2001 ;21 (3) :223228罗光华 ,叶青 ,高锦生. 国外医学临床生物化学与检验学分册 ,2001 ;22 :34Roberts TC ,Brennan DC ,Buller RS ,et al . Infect Dis ,1998 ;178 :626 收稿日期 :2002212212162117222318241920 作者简介 :徐东亮 (19762) ,男 ,安徽芜湖人 ,主要研究方向 :肾移植的临床和基础研究 ,在读博士 。平的 Th1 细胞因子 ( IFN2和 IL22) 分泌 ,而 LDC 却诱导了大量的 Th2 细胞因子 ( IL24 和 IL210) 分泌 。以 上结果提示 ,MDC 具有免疫刺激性 ,而 LDC 可诱导免疫耐受3 ,5 。人类淋巴样/ 浆细胞样 ( Plasmacytoid)DC 可激发 Th2 反应 ,因而也称作 DC2 ,而髓样/ 单核 细胞样 (Monocytoid) DC ( DC1) 可诱导 Th1 细胞因子分泌6 。但这种一类细胞对应一类免疫反应的概念近来受到挑战 。DC 亚群的不同效应也不是一成不 变的 , 比 如 小 鼠 脾 脏 髓 样 DC 也 可 激 发 Th2 反 应 。同样 ,从人的前体细胞分化而来的 DC ,对不同的活化刺激物表现出不同的反应7 。Rissoan 等8 证实 ,从人单核细胞发育来的 DC1 可强烈诱导 Th1 反应 , 而 CD11c - 、CD123 + 前体细胞发育来的 DC2 ,则既可 诱导 Th2 反应也可刺激分泌 IL210 和 IFN2 的 T 细 胞 。DC 既可刺激 Th1 又可刺激 Th2 反应 ,这取决于周围环境条件的影响 。但是否存在某一 DC 亚群 ,可忠实地执行耐受功能 ,尚不得而知 。另外有许多 研究认为 ,不同解剖部位的 DC 也可刺激 T 细胞释 放不同的细胞因子而表现出不同的反应状态 ,如从鼠脾脏分离的 DC 能很好地刺激 Th1 样反应 ,而呼 吸道粘摸及 Peyer 氏结等处的 DC 却可使 T 细胞发 生 Th2 的分化7 。因而提出另一种观点 :DC 的不同成熟状态有着不同的功能2 。DC 的成熟状态不仅决定 T 细胞的 激活程度 ,而且还决定 T 细胞的反应类型 。存在于非淋巴组织如肝 、肾 、皮肤 、血液等中的 DC 是一群 不成熟 DC ,具有极强的摄取 、处理和一定的呈递抗 原能力 ,但由于缺乏 B7 等共刺激分子 ,不能活化 T细胞 ,反而可致 T 细胞功能失活 ,诱导 T 细胞耐受 ,因而被认为是“耐受性”( tolerogenic) DC6 。从肝脏 分离的 DC 可以产生 Th2 细胞因子 ,并可在无免疫抑制剂治疗的情况下被宿主接受而不被排斥 ,这种 DC 功能上表现未成熟且具有诱发宿主 T 细胞反应 性凋亡的潜能 。因而认为 ,成功的肝移植时常可诱导超越 MHC 屏障 ,产生供体特异的耐受性 ,是因为 肝脏内含有较多的 DC 前体细胞 (DC precursor ,DCp ) 的缘故9 。Khanna 等10 从 小 鼠 肝 脏 中 分 离 出 DC前体细胞 ,加入 GM2CSF 及 IL24 在体外扩增后 ,于小鼠心脏移植前输入受体小鼠 ,发现移植的同种异体 心脏存活时间明显延长 , 证明了未成熟 DC 具有诱 导耐受的功能 。2 耐受性 DC 的作用机制DC 既可以耐受也 可 以 激 活 的 方 式 呈 递 抗 原 。已有许多研究证实 ,DC 在决定耐受和免疫的平衡中起决定性作用 。在中枢和外周耐受中 DC 起着关键 性作用11 ,目前对其机制还不甚清楚 。在胸腺髓质 中 DC 参与胸腺的阴性选择 ,DC 呈递自身 MHC 分 子抗原 。若将带有抗原的 DC 直接注入发育中的胸腺 ,反应性 T 细胞将被清除 ,如 MHC2 类分子仅在 髓质 DC 上表达 , 则阴性选择随之发生 ; 而如 MHC2 类分子仅在皮质上皮细胞表达而髓质中 DC 不表 达 ,则发生自身免疫的倾向明显增加 ,提示髓质中的 DC 负责清除自身反应性 T 细胞12 。同样 DC 也能诱 导 外 周 耐 受 , 其 机 制 可 能 涉 及 到 以 下 几 个 方面11 ,13 15。2 . 1 诱导 T 细胞的无能或低能反应未成熟 DC 表面表达低水平的 MHC 分子 ,几乎 不表 达 CD40 、CD80 、CD86 、IFA23 、ICAM21 等 激 活 T细胞所必须的辅助分子 ,所以虽然它们具有很强的 抗原摄取加工能力 ,但由于缺乏多种共刺激分子不 能活化 T 细胞 ,导致 T 细胞的无能或低反应 ,从而诱 导抗原特异性耐受 。Gao 等16 用 CD40 缺乏 DC 输 注 ,可使小鼠心脏异体移植存活时间明显延长 。细胞因子 IL210 可以抑制 DC 的成熟 ,从而调节 DC 的 功能 。经 IL210 处理的 DC 刺激 CD4 + T 细胞的反应 能力明显下降 , 这种抑制作用的大小与 IL210 的剂 量成 正 比 , 而 对 已 经 成 熟 的 DC , IL210 则 无 此 作用10。转染 vIL210 基因的 DC ,MHC2 类分和共刺激分子表达下降 ,刺激 T 细胞增殖分化成 CTL 的能力下降 ,强烈诱导对异体抗原的特异性无反应 ,并延长 心 脏 和 胰 岛 同 种 异 体 移 植 物 的 存 活 时 间17 。TGF2在体外也可阻碍 DC 的成熟而显示免疫抑制活性 。Lu 等18 用 TGF21 与 GM2CSF 共同 作 用 , 可 促进共刺激分子表达缺陷的骨髓来源的 DC 生成 , 并明显延长了小鼠心脏同种异体移植的存活 。2 . 2 诱导激活 T 细胞的凋亡DC 能表达抑制 T 细胞生长或诱导 T 细胞凋亡 的分子 ( 如 NO 、FasL 等) ,使得 DC 具有破坏 T 细胞应答的能力 。NO 不但可以抑制同种异体 T 细胞增 殖 ,也可诱导 T 细胞和 DC 的自身凋亡 。胸腺内 DC 产生的 NO 是导致胸腺细胞凋亡和产生自身耐受的原因19。用 GM2CSF 和 IL24 共同孵育小鼠骨髓来源的 MDC 可表达 FasL ,这些表达 FasL 的 DC 可诱导T 细胞的凋亡并呈剂量依赖性增强 ; 而从 FasL 缺陷 性小鼠动员的 DC 则无此功能 。小鼠同种异体肝移植耐受模型中可见 , FasL + DC 可诱导 T 细胞清除 。区 FasL + 的供肝 DC 所介导的20 。但 Lu 等21 的实验却显示 Fas/ FasL 的相互作用可能不是 DC2T 细胞 反应中的唯一凋亡诱导通路 。GM2CSF + IL24 体外共同培养的小鼠 MDC 表达 FasL ,在同种抗原激活的 T 细胞 中 诱 导 低 水 平 凋 亡 , 一 旦 用 CTLA42Ig 封 闭 CD28/ B7 通路 ,则 T 细胞凋亡显著增加 。这些研究 结果提示 ,除了 FasL DC 还可能表达其它参与 DC 诱导凋亡的分子 , 如 TNF/ TNFR 、TRAIL/ TRAIL2R 以及421BB/ 421BBL 等20 。2 . 3 诱导调节性 T 细胞DC 可诱导产生调节性 T 细胞 ,可能是外周耐受 的又一机制15 。调节性 T 细胞可以抑制反应性 T细胞以加强耐受状态是肯定的 ,然而其作用机制仍不明了 。通过对非肥胖型糖尿病 (NOD) 小鼠的研究 发现 ,DC 在调节侵袭性和调节性 T 细胞亚群之间的 平衡确实十分重要 。雌性 NOD 小鼠接受从胰腺淋巴结分离纯化的 DC ,可明显保护其免患糖尿病 ,并 且受保护鼠的淋巴结细胞可将它们的保护性赋予受放射性照射的糖尿病小鼠22 。在此 ,调节性 T 细胞通过与 DC 的相互作用 ,反馈性加强了其耐受状态 。 这一作用可能与调节性 T 细胞分泌 IL210 、IFN2 等 细胞因子有关 ,其中 IFN2可诱导 DC 表达吲哚 2 ,32 脱氧酶 ,并产生色氨酸分解作用 ,从而导致 T 细胞增 殖必需的色氨酸缺乏而抑制了 T 细胞应答2 。2 . 4 选择性激活 Th2 样 T 细胞亚群DC 的耐受性可能与选择性激活 Th2 样 T 细胞 亚群有 关 。最 近 有 人 将 DC 根 据 其 功 能 不 同 分 为 DC1/ DC2 ,其中 DC1 可产生大量 IL212 、TNF2和少量 IL26 ,诱导 Th 向 Th1 分化 ; 而 DC2 可分泌大量 IL26 和少量 IL212 ,诱导 Th 向 Th2 分化 。在移植免疫中 , Th1 可致明显的急性排斥反应而使移植物失功 ; 而 Th2 则 认 为 对 移 植 具 有 保 护 意 义23 。 GorczynskiDC ,这种未成熟 DC 不能有效的刺激幼稚 T 细胞 ,并可诱导同种异体抗原特异性 T 细胞的低反应 ,延长 同种异体心脏移植的存活25 。3 . 2GM2CSF 和 TGF2共同作用下获得耐受性 DC TGF2是一种抗炎细胞因子 ,在体外可抑制 DC的成熟 。GM2CSF 在 TGF2 共同作用下动员 DC , 可 获得不成熟 DC 并显示 T 细胞异体刺激低反应 。与低剂量 GM2CSF 相比 , GM2CSF + TGF2 可刺激小鼠 骨髓产生更多的耐受性 DC26 。移植前应用这种耐受性细胞可显著延长 MHC 完全不匹配的同种异体 心脏移植的存活24 。3 . 3 用 NF2B 特异性寡聚脱氧核糖核苷酸 (ODN)增强 DC 的耐受性NF2B 与 DC 的成熟和功能有关 。DC 表面共刺 激分子的表达与 NF2B 依赖性基因转录相关 。DC的耐受性与共刺激分子基因 NF2B 依赖性转录的削弱及 NF2B 核移位有关 。最近 Giannoukakis 等27 采 用含有 NF2B 结合位点的双链 ODN ,可有效地整合 入骨髓来源的 DC ,并能特异性抑制 NF2B 依赖性的基因转录 。用 NF2B 的 ODN 处理 BM 来源的 DC 祖 细胞 ,可选择性抑制共刺激分子的表达 , 而不影响 MHC 的表达 。另外 ,NF2B ODN 处理的 DC 可诱导 同种异体供者特异性混合淋巴细胞低反应 ,这一作 用与 Th1 型细胞因子的分泌抑制有关 。移植前输注NF2B ODN 修饰的 DC ,可促进同种异体受者在缺乏 免疫抑制剂情况下的长期存活 。因此 ,用 ODN 干预 NF2B 或其它 DC 转录途径 ,可能是促进器官移植耐 受诱导的有效手段6 ,27 。3 . 4 基因工程与耐受性 DC 的获得基因工程的目的是为了促进不成熟 DC 的耐受 原性 ,因而提高对异体 T 细胞的耐受性 。通过基因工程 的 方 法 , 使 DC 表 达 免 疫 抑 制 分 子 , 如 IL210 、等24研究发现 ,从门静脉注射供者 DC 可延长同种TGF2、CTLA4 Ig 或 FasL 等 可 诱 导 T 细 胞 凋 亡 的 分异体皮肤移植的存活时间 , 是与分泌 IL24 、IL210 的受者 Th2 细胞分化有关 。Khanna 等10 将肝脏 DC 皮 下局部注入同种异体鼠内 ,可诱导 Th2 细胞增生 ,促进 Th2 型细胞因子分泌 ,这也许是肝脏移植物容易 形成耐受的主要原因 。3耐受性 DC 的获得及其在移植中的治疗应用3 . 1低剂量 GM2CSF 培养骨髓GM2CSF 是 MDC 增殖的关键细胞因子 , 它的浓 度影响 DC 的成熟 。采用低剂量的 GM2CSF 培养小子 ,对增强 DC 耐受原性将是十分吸引人的方法6 。可用各种病毒 ( 逆转录和腺病毒) 或非病毒载体对DC 进行基因修饰 ,不成熟 DC 因具有很强的吞噬能 力也可用质粒进行转染 。Takayama 等17 采用逆转 录病毒转导小鼠 DC 产生 vIL210 ,明显削弱了 DC 的 异体刺激活性 ,并可诱导异体特异性 T 细胞的低反应 。Min 等28 将 人 FasL cDNA 转 入 鼠 DC , 可 诱 导 Fas + T 细胞的凋亡并促进体内异体抗原特异性的 低反应 。反复腹腔内注射 FasL 转导 的 DC 可 延 长9 Thomson AW ,Lu L . Immunol Today ,1999 ;20 (1) :2732MHC 完全不匹配的同种异体心脏移植的存活 。4展望DC 是一种十分有效的刺激和调节免疫反应的 APC ,它不但能呈递抗原 、激活 T 细胞免疫应答 , 同 时在中枢和外周耐受的诱导和维持上发挥重要作 用 。利用供者来源的 DC 诱导特异性免疫耐受已取 得一定的成功 ,特别是随着基因技术的不断发展 ,将 抑制 T 细胞生长或诱导 T 细胞凋亡 ( 如 NO 、FasL) 以 及抑制 DC 成熟 (如 IL210) 的基因转染给 DC ,进而放 大 DC 的耐受原性至最大程度 , 从而应用于器官移 植 。目前已有不少这方面的实验研究并取得可喜的 效果 ,但如何保证转染基因在体内高效 、稳定地表达 仍有待进一步的研究 。另外随着对 DC 不同亚群分 离纯化和功能的深入阐述 , 相信 DC 将成为诱导器 官移植 、延长移植物长期存活的有力工具 。Khanna A ,Morelli AE , Zhong C ,et al . J Immunol ,2000 ; 164 ( 3) : 13461354Rifle G ,Mousson C. Transplantation ,2002 ;73 (1 Suppl) : S12Banchereau J ,Steinman RM. 1998 ;392 (6673) :245252Alegre ML . Nephrol Dial Transplant ,1999 ;14 (2) :322332Morelli AE , Thomson AW. Curr Opin Nephrol Hypertens ,2000 ; 9 ( 6) :607613Steinman RM ,Nussenzweig MC. Proc Natl Acad Sci USA ,2002 ;99 (1) :351358Gao J X ,Madrenas J ,Zeng W ,et al . Immunology ,1999 ;98 (2) :159170Takayama T , Nishioka Y ,Lu L , et al . Transplantation , 1998 ; 66 ( 12 ) :15671574Lu L ,Li W ,Fu F ,et al . 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