块状非晶态Mg-Zn-Ca合金在细胞的反应与腐蚀 精品.docx

块状非晶态Mg-Zn-Ca合金在细胞的反应与腐蚀1、引言近年，镁合金作为生物植入材料广受关注1-5。引起众多兴趣的原因在于镁合金具有良好的机械力学性能、生物相容性和可降解性6。有些研究者将人体必需的元素Zn和Ca加入镁中形成的镁合金应用于镁合金的生物安全性和生物相容性的研究3-5,7。例如，张等，研究报道过Mg-Zn合金具有很高的抗拉强度（278.5MPa），并且锌离子的释放不会对人体造成伤害。我们的研究表明Mg-1Ca合金在骨骼的植入部位的腐蚀降解速率为2.28mg/mm2/yr。并且在镁合金还会促进植入部位周围的骨骼组织的生长5。然而，在实际应用中，镁合金的腐蚀降解仍面临更多的挑战。第一，原本必需的镁合金固有的机械强度会随着腐蚀降解的进行会降低7。张等，曾发表Mg-Zn合金的机械强度在腐蚀的最初阶段下降的速度很快（当合金失重6%时，强度有625MPa降至390MPa）。第二，镁合金经常遭受不同类型的腐蚀。点蚀是镁合金在中性或碱性溶液中腐蚀的典型模式8，并且腐蚀沿着蚀坑的方向向周围扩展造成镁合金在一定的腐蚀时间过后失效5,9。Witte等2，研究表明LAE442和AZ91D合金植入猪腿骨18周后，其表面会呈现不规则的粗糙表面。我们以前的研究也发现Mg-1Ca合金在骨骼中的腐蚀出现不同的腐蚀产物5，并且由于点蚀造成的合金表面缺陷也会加快镁合金机械强度的下降。第三，现在常用的镁合金在生物体液环境中的腐蚀降解速度大于骨骼组织的自我恢复速度5,6,10，并且腐蚀过程会释放氢气并使腐蚀环境的碱化1,11对周围的生物组织造成危害。因而，研究一种新的镁基生物材料，使它具有良好的机械性能，较低的腐蚀速度的同时产生同样的腐蚀产物，应用于临床应用是非常必要的。由于镁基非晶态合金只具有一种相态而广受关注，其具有与普通镁合金相同的化学性质并且没有第二相12-14，这些性质会使合金的机械性能和腐蚀阻抗增加，并且其腐蚀产物是相同的。镁基非晶态合金有着长足的发展研究，产生包括Mg-Cu-Y、Mg-Ni-Y、Mg-Cu-Gd和Mg-Zn-Ca在内的各种合金12。其中，Mg-Zn-Ca展现了非常合适的机械强度，其单位体积质量强度（f/）在250-300MPa.cm3/g范围内15，其比常规晶态镁合金高出40%（铸造AZ91D和WE43的强度分别为220MPa.cm3/g、176MPa.cm3/g16）。通过增加人体必需的Zn和Ca17,18元素增加合金的生物相容性，使得Mg-Zn-Ca非晶态合金称为最合适的生物植入镁合金。在本次的研究中，着重研究镁基非晶态合金具有良好的非晶态形成能力（GFA），和Mg66Zn30Ca4与Mg70Zn25Ca5的腐蚀产物与细胞相容性。2、试验2.1.合金制备以纯度大于99.9%的Mg、Ca和Zn粒，在氩气的气氛的熔炉中进行熔炼，形成均匀的混合（按原子比例混合）的合金。将熔化的合金通过石英管注入直径为2mm的铜模具中。利用X衍射仪鉴定铸造Mg-Zn-Ca合金的非晶态性，通过Rigaku 的DMAX2400衍射仪，射线源为CuK靶 进行样品组织分析，并且利用差示扫描量热法（DSC）（Perkin-Elmer公司，Diamond-DSC测量仪）控制温差为40K/min的热传导进行样品与参比物的功率差和温度的关系。将铸造Mg66Zn30Ca4 和Mg70Zn25Ca5合金样品切割为2mm厚度的圆盘并用2000号砂纸将其表面打磨光滑，然后进行电化学试验。所有的样品必须经过丙酮、无水乙醇和蒸馏水的超声波清洗。对于要进行细胞培植试验的磁盘状样品，必须在紫外线辐射下照射至少2h进行灭菌处理。2.2.机械性能测试拉伸性能测试试验是按照ASTM 标准进行，试样为2mm长为4mm的圆柱。在室温中，利用8562拉伸轻度试验仪在210-4s-1的应变率的速度下进行单向静压缩试验。2.3.电化学测试电化学特征常用三电极电池装置测量，试验用铂作辅助电极，饱和甘汞电极（SCE）作为参比电极。在试样上连接导线，除试样末端的表面（裸露部分表面积为3.14mm2）暴露在溶液中，其他部位用环氧树脂严格密封。电化学试验都是在CHI600C电化学工作站，在温度为37的模拟体液（SBF，NaCl 8.035 g, NaHCO3 0.355 g, KCl 0.225 g, K2HPO4 .3H2O 0.231 g, MgCl2 .6H2O 0.311 g, CaCl2 0.292 g, Na2SO4 0.072 g, (HOCH2)3H2 6.118 g）中进行。测量开路电位（OCP）4000s。镁合金的动电位极化曲线测试时电位扫描速度为1mv/s ,并且在4000s 的开路电位测量之后用小于腐蚀电位（Ecorr）的300mv初始电压开始测量。极化曲线测量完成后样品经丙酮、蒸馏水清洗干净后风干。用扫描电子显微镜（ESEM，Quanta 200FEG）进行样品表面腐蚀形貌的观察。之后，将试样浸入含三价铬的溶液（180g/l CrO3）中5-10分钟，用来清洗表面的腐蚀产物。将清洗风干后的试样再次放在扫描电子显微镜（ESEM）下观察并记录腐蚀形貌。采用Kratos 的AXIS-Ultra标准分析有X射线光电子能谱采集的数据，X射线光电子能谱仪的射线源为单色AlK(225 W, 15 mA, 15 kV),同时采用低能量的电子流进行电荷补偿。为了消除表面荷电效应的影响，利用C1s谱峰值为284.80 eV的标准烃进行校准。最后将实验数据转换为VAMAS格式输入CasaXPS软件进行曲线拟合与数据分析。2.4.生物毒性测试 小鼠的成纤维细胞（L929）与人体骨肉瘤细胞（MG63）常用于体外细胞培植试验。它们在Dulbecco-Eagle培养液（DMEM）中进行培养，培养液包括10%的胎牛血清（FBS）、100 U.ml-1青霉素、100 ug.ml-1链霉素，在37，含5%CO2的加湿气氛中试验。常用体外培养液为无血清的DMEM培养液中进行，其表面积与浸提介质比值为1cm2/ml，在37、含5%CO2的加湿气氛中进行72h的细胞培植，并且经过离心机分离，将上层的清液去除，然后在4温度下保存。利用DMEM培养液与含10%DMSO的DMEM培养液作为对比试验的阴性对照液和阳性对照液进行细胞毒性试验。细胞培养于96孔的细胞培养板上，每孔附着的细胞与培养液数量比为5103个细胞/100 ul，培养24h。去除培养液，每孔加入100ul的提取液，在37，含5%CO2的加湿气氛中培养的第1、3、5天，用光学显微镜观察96孔培养板各孔的情况，随后在每孔中添加10ul MTT溶液。试样在MTT溶液中继续在37，5%CO2中培养4h,然后在每孔中添加甲臜溶解液（含每毫升10%SDS的HCl）。 通过酶标仪（Bio-RAD680）测定吸光度，采用双波长测定利用波长为570nm和630nm进行测定。并且在不同的时间点进行PH值测定和提取Mg、Zn、Ca离子进行测定。2.5.细胞黏附测试将200ul细胞悬浮液接种到Mg66Zn30Ca4 、Mg70Zn25Ca5和冷轧纯镁试样（对照）的表面，细胞密度为1105个细胞/ml（L929），5104个细胞（MG63）。分别在37，5%CO2中的96孔培养板上培养1,3和5天后，在室温下的2.5%戊二醛溶液中浸泡2h，之后用磷酸盐缓冲液（PBS，PH=7.4）冲洗3次。随后在不同梯度的乙醇/蒸馏水（50%，60%，70%，80%，90%，100%）中进行脱水，接着在试剂（HMDS）中干燥。对细胞黏附的样品表面用扫描电子显微镜观察并记录形貌特征。并增加不同PH值下的镁合金的对照试验。3、试验结果3.1.微观组织和机械性能 图1所示为Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5和铸态纯镁的XRD谱，由图可以发现两种Mg-Zn-Ca合金具有典型的非晶态花样，其XRD谱没有晶粒体的衍射峰，反而在38和66方向出现明显的散射信号。相对于Mg66Zn30Ca4试样，Mg70Zn25Ca5在低角度出现更宽阔的散射峰，其原因可能在于其镁的含量高的缘故，我们都知道镁的原子半径大于锌原子15。图1. Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5和铸态纯镁的XRD谱 图2所示为Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5和铸态纯镁的曲线DSC（差示扫描量热法）曲线。Mg66Zn30Ca4的玻璃花温度（Tg）和第一个结晶化温度（Tx1）都高于Mg70Zn25Ca5。赵等19，也发现在Mg-Zn-Ca合金中随着镁的增加，合金的Tg与Tx1都会下降。图2. Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5和铸态纯镁的DSC曲线图3所示为Mg66Zn30Ca4与Mg70Zn25Ca5在压缩试验中的典型应力应变曲线。Mg66Zn30Ca4与Mg70Zn25Ca5的断裂强度分别为（565.823.2）MPa和（531.222.8）MPa，二者都高于铸态纯镁的（198.14.5）MPa20。图3. Mg66Zn30Ca4和Mg70Zn25Ca5的压缩时应力应变图3.2.电化学行为测量结果 图4所示为Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5和铸态纯镁在模拟体液中的OCP（开路电位）图。两种Mg-Zn-Ca合金的OCP在开始的1000s时快速增加，而且很明显发现二者都高于铸态纯镁。Mg66Zn30Ca4试样呈现比Mg70Zn25Ca5更高的开路电位，其原因可能在于合金中Zn含量不同，由于Zn的电极电位（-1.02VSCE）高于Mg的电极电位（-1.65VSCE）9。另外，Mg70Zn25Ca5和铸态纯镁的开路电位有明显的波动，而Mg66Zn30Ca4得开路电位要稳定的多。如图4（b）所示，两种Mg-Zn-Ca合金的阴阳极反应的动态极化电位高于铸态纯镁。随着合金中的Zn的含量增加，会使合金的稳定性增加并降低Mg的析氢反应21,22。Mg66Zn30Ca4 、Mg70Zn25Ca5和铸态纯镁的腐蚀电流密度Icorr分别是3.53uA/cm2，11.2 uA/cm2和36.8 uA/cm2。通过试验结果可以推断两种Mg-Zn-Ca合金的腐蚀阻抗比铸态纯镁高，并且Mg66Zn30Ca4 的阻抗高于Mg70Zn25Ca5。图5所示为浸泡10min前后试样的SEM图，Mg66Zn30Ca4浸泡前后的腐蚀形貌比较类似，而且裂纹很少，然而Mg70Zn25Ca5和铸态纯镁可以发现很明显很深的裂纹。在去除腐蚀产物后，在Mg66Zn30Ca4的表面发现很多微观孔洞（2-10um），而铸态纯镁会出现更大的不对称分布的孔洞（10-60um）。而XPS试验结果显示Mg-Zn-Ca合金的腐蚀产物由Mg、Zn、Ca和O组成，并且在Mg66Zn30Ca4的表面发现的ZnO和O2-含量高于Mg70Zn25Ca5。3.3.浸泡测试 图6所示为铸态纯镁和Mg-Zn-Ca合金在模拟体液中腐蚀时对溶液PH值的改变。结果显示Mg66Zn30Ca4对PH值的改变速度慢于铸态纯镁和图4.（a）开路电位图（b）Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5和铸态纯镁的动态电位极化曲线Mg70Zn25Ca5。并且，铸态纯镁和Mg66Zn30Ca4在部分区域出现稳定的上升速度。图7所示为Mg66Zn30Ca4 、Mg70Zn25Ca5和铸态纯镁在模拟体液中不同时间的表面腐蚀形貌图。Mg66Zn30Ca4试样在37的模拟体液中浸泡3天后其表面较为平坦，表面腐蚀产物包含C、O、Mg、P、Ca、Zn元素，并且Zn的含量比Mg还高。在Mg70Zn25Ca5的表面可以观察到可见的微观孔洞，并且其EDS（能量色散谱）结果显示Zn的含量高于Mg，图5. (a) Mg66Zn30Ca4, (b) Mg70Zn25Ca5 (c) 铸态纯镁浸泡前的SEM表面腐蚀形貌图和在37模拟体液浸泡10min后(d) Mg66Zn30Ca4, (e) Mg70Zn25Ca5 (f) 铸态纯镁的SEM表面腐蚀形貌图然而含量的数值没有Mg66Zn30Ca4高。经过30min浸泡后，Mg66Zn30Ca4试样仍保持原有的几何形状。结果表明Mg66Zn30Ca4表面的致密均匀的腐蚀产物层中的Mg的含量略高于Zn。并且腐蚀产物中的O含量随浸泡时间增长而快速增长。作为对照的铸态纯镁在3天浸泡后表面出现腐蚀裂纹并且腐蚀产物中含有O、Mg、P和Ca。图6.铸态纯镁、Mg66Zn30Ca4和Mg70Zn25Ca5在37模拟体液浸泡30min中的PH值的变化曲线图图7.（a）（d）Mg66Zn30Ca4、(b)(e)Mg70Zn25Ca5和(c)(f)铸态纯镁在37模拟体液浸泡30min前后的微观形貌与腐蚀产物成分图3.4.细胞毒性测试结果图8所示为用L929和MG63细胞在Mg66Zn30Ca4与Mg70Zn25Ca5上进行的细胞毒性测试结果。结果显示，在Mg66Zn30Ca4与Mg70Zn25Ca5上培植的细胞的存活率较铸态纯镁高。并且细胞在间接法试验中的存活率高于直接发试验，而且Mg66Zn30Ca4上的存活率高于Mg70Zn25Ca5。图9所示为L929和MG63细胞在Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5和铸态纯镁上培养5天后的细胞形貌。对于铸态纯镁试样，在其表面培养1天后只能观察到少量细胞，3天后，很多细胞呈现狭长并且细胞数目有所上升，5天后，两种细胞均呈现不健康的形状。对于Mg66Zn30Ca4试样，培养1天其表面细胞数目也比较少，然而培养3天到5天后，细胞的数目增长和外观形状健康。对于Mg70Zn25Ca5试样而言，其表面黏附少量的细胞，培养3-5天后较Mg66Zn30Ca4上的细胞增长速度缓慢。可以观察到Mg70Zn25Ca5表面上出现细微裂纹，而且一些部位出现破裂（如图9（c）所示）。图10所示为在培养1，3，5天后从培养液中提取的试样腐蚀释放的Mg、Zn、Ca元素。在Mg66Zn30Ca4上培养液中提取的镁离子较铸态纯镁和Mg70Zn25Ca5上少。而Mg70Zn25Ca5中提取的镁离子与铸态纯镁数量相近。另外，Mg70Zn25Ca5的提取液中的Ca离子含量与Mg66Zn30Ca4相近而Zn离子的含量较高。图11所示为在培养1,3,5天后从Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5和铸态纯镁的DMEM培养液中的PH值的变化。由图可知，铸态纯镁和两种Mg-Zn-Ca合金中的DEME培养液5天培养期内的PH值都有增长。三者的PH值由大到小为铸态纯镁、Mg70Zn25Ca5、Mg66Zn30Ca4。但在同一金属上的不同细胞L929与MG63的培养液的PH值相近。再者，在无血清的DEME培养液中的PH值高于含血清的DEME培养液。图8.（a）L929和（b）MG63细胞在铸态纯镁、Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5提取液中的含量，（c）L929和（d）MG63在铸态纯镁、Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5培养液中的直接测量的含量。4.讨论 最近的研究表明，镁基合金要作为临床应用的生物植入材料必须具有良好的机械力学性能和较低的腐蚀降解速度。而Mg-Zn-Ca材料具有明显的应用优势。4.1.以往生物应用镁合金与Mg-Zn-Ca非晶态合金的机械性能的比较 图12所示为以往生物应用镁合金与Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5和皮质骨的机械性能的比较。两种Mg-Zn-Ca非晶态合金在腐蚀降解一段时间后仍具有较高的力学性能，并且两种Mg-Zn-Ca非晶态合金的弹性系数与其他生物镁合金相比与骨骼更为相近。两种Mg-Zn-Ca非晶态合金不同于其他生物镁合金的机械性能，其缘由可能是其特有的微观组织结构，这些合金为单相结构，内部化学性质均匀一致，其机械强度高于单晶合金与晶态镁合金。图9.（a-c）L929与（d-f）MG63在（a,d）铸态纯镁、（b,e）Mg66Zn30Ca4、(c,f) Mg70Zn25Ca5培养5天后的细胞形貌4.2以往生物应用镁合金与Mg-Zn-Ca非晶态合金的腐蚀行为比较 由图12可知，通过ASTM-G102-89标准计算，Mg66Zn30Ca4 和Mg70Zn25Ca5的腐蚀速率较其他镁合金低。另一方面，Mg-Zn-Ca合金的不同腐蚀性能原因在于其没有第二相，Zn在Mg的固溶镀较高因而即使图10.DEME培养液中的Mg、Zn、Ca元素在（a）L929（b）MG63(c)提取液在培养1,3,5天的含量图11.DEME培养液在铸态镁合金、Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5培养L929和MG63细胞提取液的PH值变化图12.以往生物应用镁合金与Mg66Zn30Ca4、Mg70Zn25Ca5非晶态合金的（a）机械性能（b）腐蚀性能的比较加入高浓度的Zn，依然可以。由于Mg-Zn-Ca合金整体结构统一，因而会减低腐蚀电流强度，并且可能是形成较铸态纯镁更统一的腐蚀形态的原因。另一方面，氢氧化锌和氢氧化镁等氢氧化物的腐蚀产物构成了连续均匀的腐蚀层因而改善了合金的腐蚀性能。有EDS图谱显示可知，经过3天的浸泡试验产生的氢氧化锌的含量还高于氢氧化镁。此外，两种Mg-Zn-Ca合金的不同腐蚀行为是由于合金中的Zn的含量不一致造成。类似的，李等26，发表过Mg65Cu20Zn5Gd10的耐蚀性高于Mg65Cu25Gd10，其原因在于Zn的存在。另外，由于Ca的加入，Ca在Mg66Zn30Ca4和Mg70Zn25Ca5的含量分别为0.04wt%和0.06wt%，也会增加合金的耐蚀性。有研究显示含有小于1wt%Ca有利于改善镁合金的腐蚀行为，而高于1wt%的Ca对镁合金的腐蚀行为有不利影响5,28,29。图13所示为根据研究获得的腐蚀形貌和腐蚀产物绘制的Mg-Zn-Ca非晶态合金的腐蚀过程示意图。（1）当Mg-Zn-Ca试样浸入体液中，作为阳极的镁开始腐蚀降解并在合金表面形成氢氧化镁层，由于体液中的Cl-离子存在会与氢氧化镁发生反应生成可溶解的氯化镁，新鲜的基体被暴露出来，基体继续腐蚀并不断释放Mg2+、Zn2+(如图13（a）所示)。（2）当浸泡时间延长，Zn不断溶解为Zn2+，由于Zn的Ksp(溶度积)(1.810-14) 较Mg的Ksp(5.6210-12) 更低，Zn(OH)2优先产生并形成连续的腐蚀层，因而其产生的保护性较会不断溶解的Mg(OH)2好（如图13（b）所示）。（3）随着Zn(OH)2腐蚀层产生扩展形成明显的保护层（如图13（c）所示）。同时，为降解的Mg(OH)2和Zn(OH)2堆积促使磷灰石形核生长，在腐蚀处形成磷酸盐和钙盐的保护层。4.3.Mg-Zn-Ca与铸态纯镁的生物相容性的比较 根据细胞毒性测试显示，Mg-Zn-Ca合金的细胞毒性等级为0-1（依照ISO10993-5:199932）与Mg-Ca5、Mg-Zn7一样，结果证明Mg-Zn-Ca的生物安全性在生物应用方面具有潜力。研究显示Mg66Zn30Ca4具有良好的细胞黏附性和0-1的细胞毒性，其细胞黏附性与骨骼类似，并且Mg-0.51wt%Ca合金会降低ALP（碱性磷酸酶）的活性，在8天的细胞培养后会在表面产生蛋白质29。张等33，报道过MC3T3-E1细胞易黏附在Mg-Zn合金表面，并且也指出缺乏腐蚀层的区域会降低细胞的黏附性。同样的现象也在铸态纯镁的腐蚀孔洞中发现。然而Mg66Zn30Ca4去除腐蚀层后仍被氢氧化镁和氢氧化锌的保护。许等34，发现在培养1天后只有少量的L929细胞黏附在裸露的Mg-Mn-Zn合金基体上，并且在第3天和第5天观察细胞增长速度缓慢（大概700/mm2,来自图713）。在培养3天后的Mg66Zn30Ca4试样的表面发现1000/