高效液相色谱检验操作规程培训材料.doc

高效液相色谱仪理论培训材料依据：中国药典2010年版一部附录 D、中国药品检验标准操作规范2010年版P81P86。1原理：高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号并进行数据处理，得到测定结果。2组成：高效液相色谱仪由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成。21输液泵主要部件：入口单向阀，出口单向阀、柱塞杆。入口、出口单向阀：在使用流动相不清洁或高浓度有机溶剂时易阻塞或粘连，此时柱压发生波动性变化或无柱压（即为0），要对单向阀进行清洗，清洗时要按其安装方向在烧杯内放置。柱塞杆：使用流动相中有缓冲盐时，易生成盐的结晶，所以在工作中应定期用纯化水对其进行清洗。22进样器：试验前、后要对其进行清洁。进样时应把进样针扎入后再旋转进样阀以减少死体积。23色谱柱色谱柱的填充剂和流动相的组分应按各品种项下的规定。反相色谱系统使用非极性填充剂，常用的色谱柱填充剂为化学键合硅。以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键全硅胶（如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等）也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换色谱系统使用离子交换填充剂，分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异构体的分离通常使用手性填充剂。以硅胶为载体的键合固定相使用温度通常不超过40，为改善分离效果可适当提高色谱柱的使用温度，但不宜超过60。色谱柱应按箭头方向使用，新柱使用时应用纯甲醇冲洗后再使用含缓冲盐的流动相，每天实验结束后应用10倍量柱体积（如150mm柱长，约15ml）的低浓度甲醇或乙腈水溶液（10%-20%）沖洗，使色谱柱内的盐全部溶解洗脱出，再用较高浓度（50%）冲洗，最后用80%或100%有机溶剂冲洗。24检测器：最常用的检测器为紫外检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。紫外检测器由吸收池和氘灯组成，吸收池偶尔会被污染可用异丙醇冲洗，氘灯正常使用时间为2000小时。25色谱处理系统：工作站。2流动相：流动相的pH应控制在28之间。当pH大于8有流动相时，可使载体硅胶溶解；当pH小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。21配制：使用色谱纯和新鲜制备的重蒸馏水，并通过0.45m滤膜过滤，防止化学和物理性杂质污染和腐蚀色谱系统。凡规定pH值的流动相，应使用精密pH计进行调节，除另有规定外，偏差一般不超过0.2pH单位，使用前必须经过脱气处理，否则易在系统内逸出气泡，影响泵的工作，色谱柱的分离效果，检测器的灵敏度以及基线稳定性。22贮存：贮存于玻璃容器内，贮存容器一定要要盖严，防止有机溶剂挥发引起组成变化，也防止二氧化碳溶入流动相引起pH值变化。磷酸盐、醋酸盐缓冲液易发霉变质，应尽量新鲜配制。可在冰箱内冷藏，并在3天内使用，用前应重新过滤。4系统适用性试验色谱系统的适用性试验通常包括理论塔板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个参数。其中，分离度和重复性尤为重要。41色谱柱的理论板数(n)：用于评价色谱柱的分离效能。42分离度（R）：用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。43重复性：用于评价连续进样中，色谱系统响应值的重复性能。采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0。采用内标法时，通常配制相当于80、100和120的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子，其相对标准偏差应不大于2.0。44拖尾因子（T）：用于评价色谱峰的对称性。为保证分离效果和测量精度，应检查待测峰的拖尾因子是否符合各品种项下的规定。5测定法51内标法按各品种项下的规定，精密称(量)取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子： 校正因子( f ) = 式中 AS为内标物质的峰面积或峰高； AR为对照品的峰面积或峰高； CS为内标物质的浓度； CR为对照品的浓度。再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量： 含量(Cx)= f . 式中 Ax为供试品的峰面积或峰高； Cx为供试品的浓度。 为内标物质的峰面积或峰高；为内标物质的浓度；f为校正因子。 采用内标法，可避免因样品前处理及进样体积误差对测定结果的影响。52外标法按各品种项下的规定，精密称(量)取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积(或峰高)，按下式计算含量： 含量(Cx) = CR 式中各符号意义同上。由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中成分或杂质含量时，以定量环或自动进样器进样为好。 53加校正因子的主成分自身对照法 测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。54不加校正因子的主成分自身对照法测定杂质含量时，若没有杂质对照品，也可采用不加校正因子的主成分自身对照法。55面积归一化法按各品种项下的规定，配制供试品溶液，取一定量注入仪器，记录色谱图。测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的各色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率。用于杂质检查时，由于峰面积归一化法测定误差大，因此，通常只用于粗略考察供试品中的杂质含量。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。62溶液的配制与保存 除另有规定外，采用规定溶剂配制对照品溶液和供