Wilson病基因产物在人肝细胞内存在和定位的研究.doc

Wilson病基因产物在人肝细胞内存在和定位的研究中国神经精神疾病杂志 2000年第4期第26卷 论著与学术交流作者：侯国庆梁秀龄陈嵘黄帆徐评议欧翠华王莹唐莉雯单位：侯国庆梁秀龄陈嵘黄帆徐评议欧翠华王莹（中山医科大学附属第一医院神经科510080）；唐莉雯（Department of Pharmacology, University of Kentucky, KY 40506）关键词：肝豆状核变性；P型ATP酶；铜；肝细胞【摘要】目的证实Wilson病铜转运P型ATP酶(WD蛋白)在人肝内的存在，并初步研究其在肝细胞内的具体定位。方法应用Western-blot蛋白印迹技术对离体培养正常人肝细胞内蛋白进行分离；通过高浓度铜及P型ATP酶阻滞剂矾酸钠、激动剂长春新碱孵育培养，差速离心分离肝细胞胞浆、溶酶体、线粒体和微粒体，对各亚细胞铜含量分别对照分析。结果人肝细胞内分离出155 kDa的WD蛋白特异性条带；在人肝细胞质膜、微粒体内存在有铜转运P型ATP酶，其阻滞剂及激动剂对肝细胞铜转运有显著影响。结论证实正常人肝细胞存在WD蛋白，其存在部分可能在肝细胞质膜、内质网和高尔基器。 A preliminary study of presence and localization of the Wilson disease gene product in human hepatocytesHuang FanHou GuoqingLiang XiulingChen RongLiwen TangHuang FanXu PingyiOu CuihuaWang Ying（Department of Neurology, The First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou. 510080. Tel8282）【Abstract】Objective To confirm the presence and localization of Wilson disease gene product-copper transporting P-type ATPase (WD protein) in human hepatocytes.Methods Human cultured hepatocytes were incubated and the proteins were separated by SDS-PAGE and analyzed by Western-blot. Media of copper 15g/mL only, copper 15g/mL with vincristine (agonist of P-type ATPase) 0.5g/mL, or copper 15g/mL with sodium vanadate (antagonist of P-type ATPase) 18.39g/mL of hepatocytes were used according to grouping. Microsomes, lysosomes, mitochondria, and cytosol of hepatocytes were isolated by differential centrifugation. The influence on copper transport of these organelles by sodium vanadate and vincristine was comparatively analyzed among different conditions.ResultsA specific 155 kDa band of WD protein was separated from normal human hepatocytes. Copper transporting P-type ATPase was found to be localized in human hepatocytic plasma membranes and microsomes, and sodium vanadte and vincristine can obviously change their copper transporting.ConclusionsWD protein plays an important role in hepatocytic copper metabolism. It was first directly confirmed that there were WD proteins in normal human liver, and this protein was probably situated at hepatocytic plasma membranes, Golgi apparatus and endoplasmic reticulum. Dysfunction of WD protein might be the most important pathogenetic factor of WD.【Key words】Wilson disease P-type ATPase Copper Hepatocyte肝豆状核变性又称Wilson病(WD)，是一种铜代谢障碍的常染色体隐性遗传病，好发于青少年，以慢性肝脏病变、肾脏功能损害以及神经精神障碍等症状为主。1993年WD基因(ATP7B)被克隆，定位于13 q 14.3。DNA序列分析表明，该基因编码一种铜转运P-型ATP酶，即推测中的Wilson病蛋白(WD蛋白)12。已在肝、肾、脑、眼等器官发现ATP7B mRNA，其中以肝脏含量为最多，但至今尚无直接证据证实WD蛋白在人肝内的存在35。我们在国内首次采用人离体培养肝细胞模型，电泳分离细胞蛋白，经Western-blot分析以明确WD蛋白是否存在，并结合P型ATP酶阻滞剂或激动剂孵育，对肝细胞内铜代谢情况进行研究，试探讨WD蛋白在人肝细胞中的定位及其在WD发病机制中的作用。1资料和方法1.1实验对象实验组?5例，男4例，女1例，年龄3549岁，为肝血管瘤或肝结石手术切除患者，体检及铜生化检查排除了WD的可能。肝标本于术后立即浸于4培养液中保存，24小时内行细胞分离及培养。1.2肝细胞的分离和原代培养6以冰冷?D-Hanks缓冲液冲洗肝组织标本，剪去外露血管和胆管组织。使用体外型胶原酶温育消化法分离肝细胞，筛网过滤、离心，显微镜下观察肝细胞形态，台盼蓝染色计算成活率。用DMEM/F12条件培养基(含胰高血糖素、胰岛素、二性霉素、转铁蛋白、表皮生长因子、20%胎牛血清等)，在37、5% CO2条件下进行肝细胞原代培养，动态观察细胞生长情况。根据实验设计加入一定浓度的长春新碱、矾酸钠、CuCl2等。同时分离肝血管内皮细胞进行培养作为阴性对照。1.3孵育条件及方法当细胞生长至刚融合时，倾去培养液，分组加入下述条件的培养液；单铜孵育组：内含?CuCl2 15g/mL；铜加ATP孵育组：内含CuCl2(含量同上)，ATP 30 mmol/L；阻滞剂组：铜加矾酸钠孵育，内含CuCl2、矾酸钠18.39g/mL；阻滞剂加ATP组：内含CuCl2、ATP(含量均同上)、矾酸钠18.39g/mL；激动剂组：铜加长春新碱孵育，内含CuCl2、长春新碱0.5 g/mL；激动剂加ATP孵育组：内含CuCl2、ATP(含量均同上)、长春新碱0.5 g/mL。各组细胞分别于孵育24 h后，倾去培养液，D-Hanks液冲洗3次，加入0.05mol/L Tris-HCl(pH 8.6)液?2 mL，用橡皮刮刮下细胞，4超声粉碎(功率：80 W，时间?60 s)。1.4肝细胞器的分离及铜含量测定细胞匀浆?4下差速离心(8 000g,10 min；9 000g，10 min；30 000g,?15 min；108 000g,60 min)分离细胞核、溶酶体、微粒体及胞浆，用原子吸收火焰法测定铜含量，以铜/蛋白质比值表示(ng/mg)。1.5WD蛋白的分离使用?Bio-Rad公司的垂直电泳、电转槽。SDS-PAGE电泳：将收获细胞加入细胞裂解液(含Nonidet P-40, aprotini,PMSF,Tris-HCl等, pH 8.0)作用15 min,4 800 g离心5 min，去除细胞碎片；取50L上清加样于6%聚丙烯酰胺凝胶，200 V电泳45 min。Western blot:100 V下将上述电泳凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜，分别与一抗(兔抗人ABD多克隆抗体，Oregon health sciences university school of medicine的S. Lutsenko教授惠赠)及二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，New England Bio-Lab公司)孵育。显影反应按说明书操作，将孵育后的膜置入化学发光试剂中，作用10 min后在暗室内压片曝光。1.6分子量分析和统计学处理电泳分子量标准使用New England Bio-Lab公司提供的6.5165 kDa生物素标记的蛋白Markers。通过Bio-Rad Gel 2 000型凝胶成像系统分析并照像记录条带的数目和分子量大小，数据分析采用SPSS统计学软件进行。2结果2.1铜孵育前肝细胞各组分铜含量铜孵育前肝细胞线粒体、微粒体、溶酶体和胞浆铜含量分别为(84.611.8)ng/mg、(74.113.5)ng/mg、(69.510.7)ng/mg和(526.463.2)ng/mg。2.2WD蛋白电泳与蛋白印迹试验使用抗?WD蛋白ATP结合位点的抗体(抗ABD抗体)进行Western-blot试验，人肝脏可见二条主要的条带，分子量分别为155 kDa和90 kDa，人肝血管内皮细胞未见155 kDa条带或其它任何条带。2.3P型ATP酶阻滞剂、激动剂对微粒体、溶酶体铜含量的影响在微粒体，当加入ATP时，方差分析结果为F=6.08,P0.05，提示3组之间铜含量有差异；再两两比较，发现铜加矾酸钠孵育时微粒体铜含量显著高于单用铜或铜加长春新碱孵育；而在无ATP孵育时，各种孵育条件的微粒体铜含量经方差分析未见明显异常(F=2.90,P0.05)；溶酶体铜含量变化经方差分析，也未发现统计学意义(F=0.61,P0.05)，见表1。Table 1 Concentrations of copper in hepatic microsomes and lysosomes表1各种条件孵育24小时微粒体铜、溶酶体铜含量比较(ng/mg,s)Organelles细胞器Groups分组Cu2(A)单铜Cu2 andvincristine (B)铜加长春新碱Cu2 andvanadate (C)铜加矾酸钠Microsome微粒体ATP deficient无ATP346.252329.549353.632ATP added1）加ATP287.6392）245.3463）336.843.0Lysosome溶酶体ATP deficient无ATP321.740341.532364.055ATP added加ATP369.346353.037389.4461)F-test of the three groups of A,B,and C, F=6.08，P0.01. A,B,C 3组方差分析，F=6.08,P0.01.2)P0.05 compared with C, 与C组相比，P0.053)P0.01 compared with C, 与C组相比，P0.012.4P型ATP酶阻滞剂、激动剂对线粒体铜、胞浆铜含量的影响在胞浆，当加入?ATP时，方差分析结果为F=12.15,P0.005,提示3组之间铜含量差异有极显著性；再经两两比较，发现铜加矾酸钠孵育时，胞浆铜含量显著高于长春新碱孵育组；铜加长春新碱孵育时，胞浆铜含量显著低于单铜或加矾酸钠孵育，在无ATP组，各组孵育条件下铜含量均无明显变化，线粒体铜含量变化亦无统计学意义(F=3.47,P0.05)(表2)。3讨论WD的致病基因ATP7B的成功克隆为揭示WD发病的机制提供了可能。但是ATP7B基因产物WD蛋白是否在人体肝内存在以及它在肝细胞亚细胞结构的具体定位均未清楚，而这正是研究WD蛋白在WD发病机制中所起作用的关键所在。Bingham等3采用差速离心法分离得到了大鼠肝细胞内质网(微粒体)，在67CuCl2孵育下，发现100mol/L矾酸钠能使微粒体铜的聚集抑制达50%，这些都符合铜转运P型ATP酶“微量(mol)级矾酸钠即可抑制其活性”的特点，故推测内质网有该酶存在。Dijkstra等4采用差速离心法对人肝细胞质膜进行分离，同时检测其转用铜离子情况，发现肝内胆小管膜上有一ATP依赖的铜转运体。如果该铜转运体的功能异常会导致因胆小管泌铜减少而肝内铜淤积。这刚好能解释WD的排铜障碍；但是对于WD的铜蓝蛋白的合成障碍却不能解释，因为后者是在内质网由铜与前铜蓝蛋白结合而形成的。Table 2 Concentrations of copper in hepatic mitochondria and cytosol表2各种条件孵育24小时线粒体铜、胞浆铜含量比较?(ng/mg,s)Organelles细胞器Groups分组Gu2only (A)单铜Gu2 andvincristine(B)铜加长春新碱 Gu2 andvanadate(C)铜加矾酸钠Cytosol胞浆ATP deficinent无ATP1 589.396.41 501.11201 629.3134ATP added1）加ATP1 463.81102）1 173.61073）1 493.312Mitochondria线粒体ATP deficinent无ATP458.268448.365429.752ATP added加ATP416.773364.031389.4461)F-test of the three groups of A,B, and C, F=12.15,P0.005. A,B,C 3组方差分析，F=12.15,P0.0052)P0.05 compared with B. 与B组相比，P0.053)P0.01 compared with C. 与C组相比，P0.01目前，有实验室通过制备抗WD蛋白抗体，进行免疫组化研究，也发现在转染了人WD cDNA质粒的细菌或一些肿瘤细胞株内存在WD蛋白，但结果尚不一致，在内质网、高尔基器或线粒体上都有报道5，7，8。由于是异常细胞株或菌株，它们与人肝细胞的结构、功能、代谢等特点都存在差异，因此并不能完全应用于人肝细胞。我们利用抗WD蛋白ATP结合位点的抗体(抗ABD)，对所分离的正常人肝细胞WD蛋白进行Western-blot分析，在人肝细胞中首次检测到155 kDa和90 kDa两条与抗WD特异抗体反应的条带，其中155 kDa条带即是WD蛋白，而90 kDa条带可能是全长WD蛋白的蛋白酶解产物，因为在不加用蛋白酶抑制剂(aprotini、PMSF等)、或肝细胞裂解后放置较长时间时，发现155 kDa条带变淡甚至消失，而90 kDa条带更明显，并可出现其它更小分子量的条带7，8。Nagano对转染了人类全长WD基因的培养的LEC大鼠(一种典型的WD动物模型)肝细胞裂解后，也发现了155 kDa条带，另外还有一条80 kDa的酶解产物，这与我们的结果基本一致8。Lutsenko等5使用与我们同样的抗体(抗ABD)在肝癌细胞株HepG2检测出140 kDa和160 kDa两条带，其中140 kDa是WD蛋白酶解产物，而160 kDa为全长WD蛋白，这与我们的结果不同。在长期培养的细胞，不论正常细胞株或肿瘤细胞株，都会丧失或改变某些蛋白的合成功能。HepG2虽未失去合成WD的功能，但所合成的WD蛋白是否有改变，尚无这方面的研究。本研究证实在人肝细胞内有WD蛋白存在，为进一步确定该蛋白的具体定位及在铜转运中的作用提供了研究基础。我们曾采用高铜(200 mol/L)孵育皮肤成纤维细胞模型研究WD，推测在细胞微粒体上存在有WD铜转运P型ATP酶9，10。本文对正常人离体肝细胞铜的转运情况进行研究，发现铜加长春新碱孵育时，微粒体和胞浆铜含量显著低于单用铜孵育，而铜加矾酸钠孵育时，微粒体和胞浆铜含量显著高于单用铜孵育的含量。由于微粒体主要是内质网和高尔基器，而胞浆的铜主要通过细胞质膜的转运来调节，因此说明P型ATP酶阻滞剂和激动剂，通过抑制或增强WD P型ATP酶的活性，从而对这些细胞组分铜离子的转运产生了显著的不同影响；并且，对铜代谢的这种影响，只有在ATP存在时才能表现出来；当培养液不含ATP时，对铜转运的影响虽也有这种趋势，但并无显著性意义。上述结果提示在微粒体和质膜上存在依赖ATP来提供能量的铜转运体，这与Bingham等的结果一致34。由于肝细胞内尚未发现其它能转运铜的蛋白，结合Western-blot结果，我们认为在人肝细胞的微粒体和质膜上存在有铜转运P型ATP酶，而在溶酶体、线粒体铜含量并无这种变化规律，提示在这些细胞器内可能无WD蛋白。内质网和高尔基器不仅对细胞的物质转运有重要作用，在肝细胞它们还是铜蓝蛋白合成的部位，而质膜与铜分泌入胆小管有关。本研究提示，肝微粒体、质膜可能存在铜转运P型ATP酶。这些部位WD蛋白的异常必将导致铜转运障碍，从而引起WD患者与铜代谢改变有关的各种症状。如能对内质网、高尔基器、质膜等细胞器作进一步的研究，必将促进WD蛋白在肝细胞内的精细定位及其功能的研究，从而有助于对WD病理机制的探讨；同时，人肝细胞铜代谢模型的建立，为探讨WD的病理机制也提供了一个新的细胞生物学方法。卫生部临床学科重大项目(批准编号：37091)、广东省自然科学基金(批准编号：960128)、中山医科大学“211工程”重点建设项目及广东省自然科学基金(批准编号：990064)资助课题参考文献1，Tanzi RE, Petrukhin K, Chernov I, et al. The Wilson disease gene is a copper transporting ATPase with homology to the Menkes disease gene. Nat Genet, 1993,5(4):3442，梁秀龄，陈嵘，刘焯霖，等. 高铜孵育后皮肤成纤维细胞内铜的测定诊断肝豆状核变性. 中华医学杂志，1994，74(2)：1113，Bingham MJ, Burchell A, Mcardle HJ. Identification of a ATP-dependent copper transport system in endoplasmic reticulum vesicles isolated from rat liver. J Physiol, 1995,482(Pt3):5834，Dijkstra M, Berg GJ, Wolters H, et al. Adenosine triphosphate-dependent copper transporter in human liver. J Hepatol, 1996,25(1):375，Lutsenko S and Cooper MJ, Localization of the