不同孕期小鼠羊水对小鼠肝癌细胞H22增殖和凋亡的影响.doc

不同孕期小鼠羊水对小鼠肝癌细胞H22增殖和凋亡的影响作者：丁雅明,方廖琼,周兰,张弘,白晋单位：(重庆医科大学生物医学工程系,重庆医科大学医学超声工程研究所,重庆400016)摘要:目的观察不同孕期小鼠羊水对小鼠肝癌细胞H22增殖和凋亡的影响。方法用孕11、13、15 d和17 d的KM小鼠羊水-RPMI1640培养基培养H22细胞(培养液中羊水终浓度为10% ),RPMI1640培养基培养的H22细胞作为对照组,采用MTT法检测细胞的增殖能力;AnnexinV-FITC法检测细胞凋亡率,透射电镜观察细胞形态; S-P免疫荧光染色法经激光共聚焦显微镜分析H22细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)和p53的表达。结果羊水能明显抑制H22细胞的体外增殖和PCNA的表达,随孕期的延长而增高(P<0•05);并能促进p53的表达以及诱导H22细胞凋亡,随孕期的延长而降低(P<0•05)。同时, PCNA和p53的表达强度具有明显的负相关性(r=-0. 808,P<0•01)。结论孕11、13、15、17 d的小鼠羊水能抑制H22细胞增殖,诱导其凋亡,可能与PCNA和p53的表达有关,并且孕期越早、干预时间越长,效果越显著。关键词: H22细胞;羊水;凋亡;增殖细胞核抗原; p53中图法分类号:R73-354;R73-36;R735. 7文献标识码:AEffects ofmouse amniotic fluid collected on different gestational days on prolifera-tion and apoptosis ofH22cellsin vitroDINGYa-ming,FANG Liao-qiong,ZHOULan,ZHANGHong,BAI Jin,WANG Zhi-iaoDepartmentofBiomedicalEngi-neering,Institute ofUltrasound Engineering nMedicine,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing 400016,China)Abstract:ObjectiveTo investigate the effects ofmouse amniotic fluid on the proliferation and apoptosisofmouse hepatoma cell ineH22.MethodsTreatedwith themixture ofRPMI1640 medium and 10% mouseamniotic fluid collected respectively on gestationalday11,13,15 and 17 orRPMI1640medium as control,theproliferation ofH22cellswas detectedwithMTT and the apoptosis ofH22cellswithAnnexinV-FITC;H22cellswere observedmorphologically under electronmicroscope;The expressions of proliferating cell nuclear antigen(PCNA)and p53 inH22cellswere investigatedwith immunofluorescence staining(S-Pmethod)and laser con-focalmicroscopy.ResultsAmniotic fluid significantly inhibited the cellproliferation aswell as the PCNA ex-ressions,increased the p53 expressions and induced cell apoptosis. The amniotic fluid collected on gestationalday 11 was themost effective,while that of gestational day 17 was the least effective(P<0•05),and theireffectswere both in a time-dependentmanner. There was a negative correlation between PCNA and p53(r=-0. 808,P<0•01).ConclusionAmniotic fluid collected on gestationalday 11,13,15 and 17 can inhibitthe proliferation ofH22cells and induce their apoptosis. The earlier pregnancy and the longer intervention is,more significant effects of amniotic fluid are.Key words:H22cells;amniotic fluid;apoptosis;proliferating cellnuclear antigen;p53胚胎发育环境能抑制肿瘤细胞生长及改善其恶性程度的现象已日益受到重视1, 2。目前普遍认为不同胚胎微环境(包括卵母细胞,囊胚和部分妊娠中、晚期胎儿)可能对携带全套遗传信息的细胞核有“程序重排作用”,从而逆转某些恶性肿瘤细胞的生物学行为,恢复其来源细胞的良性表型3。羊水是胎儿羊膜腔的内容物,随着孕期的延长,羊水中蛋白质、调控因子的种类及含量变化较大,并与胚胎发育密切相关4。本课题组Ma等5利用宫内移植技术,将恶性肿瘤细胞H22移植到胎鼠的羊膜腔,结果表明处于小鼠宫内中孕期环境的H22细胞对胎鼠发育无影响,推测胚胎微环境可能抑制了H22细胞的生长,或诱导其凋亡、分化,使H22不足以成瘤。在此基础上,本研究获取不同孕期小鼠羊水作用于恶性肿瘤细胞H22,观察其生物学行为的改变,探讨羊水作为胚胎微环境对恶性肿瘤细胞生长行为的影响。1材料与方法1. 1材料和仪器小鼠肝癌细胞株H22细胞(中国科学院上海细胞库提供),RPMI1640培养基及胎牛血清(FBS)(Gibco,美国),Annexin V-FITC凋亡试剂盒(福建晶美,中国),兔抗小鼠多克隆抗体增殖细胞核抗原PCNA,兔抗小鼠多克隆抗体p53,FITC标记的羊抗兔IgG二抗, SP-9000免疫组化试剂盒(北京中杉公司),清洁级KM小鼠(重庆医科大学动物实验中心), ELX800酶标仪(BIO-TEC,美国),流式细胞仪(flow cytometry,FCM)(BD acscalibur,美国),透射电镜(Philips,荷兰),德国Leica TCS SP2型激光共聚焦显微镜。1. 2方法1. 2. 1动物准备68周健康清洁级KM小鼠,体质量2530 g。光照周期12 h(8: 0020: 00),选取发情期雌鼠与雄鼠以31合笼2 h(8: 30 10: 30),查见阴栓者为妊娠第1天(D1)。1. 2. 2羊水准备实验选用孕11、13、15、17 d(D11、D13、D15、D17)妊娠小鼠,无菌条件下开腹, 4号不锈钢针头经羊膜腔穿刺抽取羊水, 2 000 r/min离心10 min,取上清液, 0. 2μm滤器过滤,灭菌玻璃瓶分装, -20冰箱保存备用。1. 2. 3细胞培养H22细胞用含10% FBS的RPMI1640培养, 37、50 ml/L CO2饱和湿度条件下培养传代。实验组给予D11、D13、D15和D17羊水干预(培养液中羊水终浓度为10% ),对照组培养基中不含羊水。1. 2. 4MTT法检测H22细胞体外增殖H22细胞以6×104ml-1接种于96孔细胞培养板中,总体积200μ,l培养72 h,加入MTT 20μl(5 mg/ml),继续培养4 h, 1 000 r/min离心5 min,然后每孔加入50μlDMSO,室温振荡10 min,选择490 nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值D(490)。实验重复3次。1. 2. 5PCNA和p53表达的检测H22细胞经羊水干预0、24、48 h和72 h后制成细胞涂片,分别滴加兔抗小鼠多克隆抗体PCNA和p53 50μl(1100稀释), 4过夜, PBS漂洗,滴加50μlFITC荧光标记的二抗(160稀释),室温孵育1 h, PBS漂洗,激光共聚焦显微镜下观察PCNA和p53的表达并进行荧光强度的分析。1. 2. 6H22细胞凋亡检测将各组培养72 h的H22细胞一部分制成6×106ml-1细胞悬液, 1 500 r/min离心15 min, 2%戊二醛固定常规制作切片,透射电镜观察细胞形态。另一部分用4预冷PBS洗2次,在250μl结合缓冲液中以1×106ml-1的浓度重悬细胞,按Annexin V凋亡试剂盒提供的方法进行,FCM分析凋亡率。1. 3统计学处理数据以-x±s表示,采用SPSS 13. 0统计软件进行单因素方差分析和相关性分析。2结果2. 1羊水对细胞增殖的影响2. 1. 1MTT结果MTT法检测发现, D11、D13、D15和D17组吸光度值均明显低于对照组,差异有显著性(P<0•05)。实验组的吸光度值随孕期延长而增大(P<0•05);同一实验组吸光度值随羊水干预时间延长而减少(P<0•05)。见表1。表1不同孕期的小鼠羊水作用24、48、72 h时H22细胞的增殖情况D(490),-x±s组别24 h 48 h 72 h对照组0. 450±0. 005 0. 440±0. 003 0. 441±0. 015D11组0. 365±0. 011a0. 339±0. 018ab0. 299±0. 012abcD13组0. 392±0. 008a0. 377±0. 005ab0. 359±0. 015abcD15组0. 415±0. 015a0. 400±0. 007ab0. 385±0. 010abcD17组0. 438±0. 005a0. 426±0. 011ab0. 410±0. 011abca:P<0•05,与对照组比较;b:P<0•05,与同一实验组24 h比较;c:P<0. 05,与同一实验组48 h比较2. 1. 2PCNA水平S-P免疫荧光染色后,激光共聚焦显微镜下观察发现,与对照组相比, D11、D13、D15和D17组的PC-NA在H22细胞细胞核表达均显著减少(P<0•05)。各实验组的荧光强度均低于对照组,并随孕期延长而增高(P<0•05);且同一实验组内, PCNA的表达随羊水干预时间的增加而降低(P<0•05,图1、表2)。2. 2羊水对H22细胞凋亡的影响2. 2. 1H22细胞形态观察透射电镜观察(图2),与对照组相比,羊水干预72 h的细胞多数形态发生了明显变化,大部分细胞核细胞质比例变小,核膜皱缩,核质浓缩,可见典型细胞凋亡现象,染色质固缩,呈块状或新月形小体位于核膜下,细胞质有大量空泡变。但细胞结构完整,有较完整丰富的细胞器。A:对照组;B:D11组图1不同孕期的小鼠羊水作用H22细胞72 h时PCNA的表达(激光共聚焦显微镜)表2不同孕期的小鼠羊水作用24、48、72 h时H22细胞PCNA的表达(-x±s)组别24 h 48 h 72 h对照组49. 69±0. 46 50. 27±0. 62 50. 16±0. 48D11组42. 95±0. 48a42. 08±0. 39ab40. 38±0. 42abcD13组44. 85±0. 44a43. 80±0. 61ab42. 73±0. 63abcD15组46. 58±0. 85a45. 73±0. 45ab44. 43±0. 59abcD17组48. 21±0. 36a46. 89±0. 57ab46. 11±0. 60abca:P<0•05,与对照组比较;b:P<0•05,与同一实验组24 h比较;c:P<0. 05,与同一实验组48 h比较A:对照组;B:D11组图2不同孕期的小鼠羊水作用72 h时H22细胞的形态(透射电镜)2. 2. 2H22细胞的凋亡率羊水干预72 h后实验组的凋亡率较对照组显著增高(P<0•05),以D11组最高,D17组较之降低了7. 34%。各实验组间的差异有显著性(P<0•05),凋亡率随孕期的延长而下降(图3)。a:P<0•05,与对照组比较;b:P<0•05,与D11组比较;c:P<0•05,与D13组比较;d:P<0•05,与D15组比较图3不同孕期的小鼠羊水作用H22细胞72 h时的凋亡率(FCM)2. 2. 3p53水平激光共聚焦显微镜下观察发现,实验组与对照组比较p53在H22细胞细胞核表达显著增加(P<0•05),并随孕期延长而减少(P<0•05);且同一实验组内, p53的表达随羊水干预时间的增加而增加(P<0•05)。分析发现,羊水能促进p53的表达,且孕期越早和干预时间越长, p53表达强度越高(r=0. 812,P<0•01)(图4、表3)。A:对照组;B:D11组图4不同孕期的小鼠羊水作用72 h时H22细胞p53的表达(激光共聚焦显微镜)表3不同孕期的小鼠羊水作用24、48、72 h时H22细胞的p53表达组别24 h 48 h 72 h对照组40. 65±0. 53 40. 24±0. 60 38. 78±0. 54D11组51. 30±1. 15a47. 71±0. 58ab44. 85±0. 44abcD13组47. 38±0. 86a45. 59±0. 45ab42. 95±0. 48abcD15组45. 64±0. 62a44. 27±0. 43ab41. 53±0. 39abcD17组44. 51±0. 51a43. 14±0. 45ab40. 40±0. 75abca:P<0•05,与对照组比较;b:P<0•05,与同一实验组24 h比较;c:P<0. 05,与同一实验组48 h比较2. 3p53与PCNA表达的相关性分析H22细胞的p53表达增多的同时其PCNA的表达下降,二者荧光强度呈明显的负相关性(r=-0. 808,P<0•01)。3讨论恶性肿瘤是增殖失控和异常分化的细胞集合体6,其发生、发展与胚胎发育的生命过程极为相似。在一定条件下肿瘤细胞与受精卵具有互变性。现已发现,胚胎微环境的独特性不仅对胚胎组织发挥着精细有序的调控,也能有效地调控肿瘤细胞的生物学行为。Simonetta等7曾将标记的肿瘤干细胞接种于妊娠期胎鼠,发现出生后小鼠未有肿瘤发生,并可在成年期组织中追踪到标记的肿瘤细胞。结果表明,鼠胚微环境在着床后至器官形成期间能有效地调控肿瘤细胞的生长,但胚胎微环境使肿瘤细胞正常化的机制尚不清楚。本课题组Ma等5将恶性肿瘤细胞H22种植到妊娠912 d的胎鼠羊膜腔,结果显示处于小鼠宫内中孕期环境的H22细胞对胎鼠发育无影响。因此,我们推测羊水可能是实现胚胎微环境对H22细胞实施调控的介质之一。本实验将不同孕期羊水作用于H22细胞,发现不同孕期羊水能够抑制H22细胞的增殖并诱导其凋亡,且孕期越早、干预时间越长,效果越显著。结果证实羊水参与了胚胎微环境调控恶性肿瘤细胞生物学行为的进程。本实验中MTT结果表明,小鼠羊水能显著抑制H22细胞的体外增殖。而PCNA是DNA聚合酶辅助因子,调控DNA的合成。作为增殖细胞的一个内源性标志物8,现已证实PCNA的表达与肿瘤细胞的增殖活性呈正相关9。本实验结果显示,羊水作用H22细胞后其PCNA的表达显著下降,并呈时间依赖性(P<0•01),推测可能是羊水中存在的有效成分通过抑制H22细胞PCNA的表达而抑制了其体外增殖,其具体机制待进一步实验证明。在细胞周期的调控中, p53起着重要作用,大量研究表明p53因阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡而达到抗肿瘤作用10-12。一方面, p53可因降低Bcl-2/Bcl-XL的表达和促进Bax的表达,引起Cytc释放而发生线粒体途径的细胞凋亡;另一方面又可促进Fas和DR5的表达而诱导发生死亡受体介导的细胞凋亡11。本实验结果表明,羊水干预后H22细胞p53表达水平显著增高(P<0•01),并呈时间依赖性(P<0•01)。同时经分析得出, p53与PCNA的荧光强度之间具有明显的负相关性(r=-0. 808,P<0•01)。提示小鼠羊水通过促进H22细胞p53表达增多而诱导细胞发生凋亡,同时抑制其PCNA的表达,最终抑制了H22细胞的体外增殖。我们推测早期胚胎中的某些有效物质(可能是蛋白质或者肽类),通过调控细胞的增殖、凋亡和分化对正常未分化细胞发挥调节作用的同时能诱导肿瘤细胞发生凋亡、抑制其增殖或促进其向良性分化;羊水中的该物质促进了p53表达增加并通过以上两种途径最终导致细胞凋亡发生,抑制了细胞的体外增殖。具体机制有待进一步实验研究。不同孕期羊水对恶性肿瘤细胞H22具有不同程度的作用,D11组对H22细胞的抑制增殖和促进凋亡的效应较D13、D15和D17组强,可能与不同孕期羊水成分和含量随妊娠阶段不同而变化有关。胚胎发育早期,体内促分化因子活性高,胚胎晚期,机体则产生较多的促生长因子以适应胚胎的生长发育。Astigiano等7也有类似发现,胚胎微环境只有在器官形成之后才允许其内肿瘤细胞生长,肿瘤细胞被移植到胚胎环境内越早其发生肿瘤概率也就越低。胚胎细胞分泌的各种活性肽和整体信号可识别、调控和清除不利于胚胎正常发育的因素。我们推测羊水中发挥上述实验作用的有效成分可能参与了不利于胚胎发育因素的清除,而这种有效成分的含量决定于胚胎发育的阶段性(不同孕期),故羊水对恶性肿瘤细胞H22呈现出上述不同的效应。抑制肿瘤细胞的无限增殖是肿瘤综合治疗的重要策略之一。本实验为胚胎微环境逆转某些恶性肿瘤细胞的生物学行为提供了新的实验依据,为肿瘤的临床治疗提供了新的思路,但羊水中究竟是何种成分、怎样发挥了抑癌作用,尚有待于进一步研究。(致谢:感谢超声医疗国家工程研究中心对本课题提供的资助! )参考文献:1 QuarantaV. 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