伐他汀对人高转移卵巢癌细胞HO8910PM增殖的抑制作用.doc

伐他汀对人高转移卵巢癌细胞HO8910PM增殖的抑制作用作者：符伟玉,兰柳波,陈杰,梁念慈单位：广东医学院生物化学与分子生物学教研室，广东湛江 524023【摘要】 目的 研究辛伐他汀（SIM）对人高转移卵巢癌细胞HO8910PM体外增殖的抑制作用。方法 MTT法检测SIM对HO8910PM细胞增殖的抑制作用；流式细胞术分析SIM对细胞周期的影响；Hoechst 33258荧光染色观察细胞凋亡的形态学改变。结果 SIM抑制HO8910PM细胞的增殖，细胞被阻滞在G0/G1期；荧光染色法显示经SIM作用后细胞出现变形，染色质浓缩，产生凋亡小体。结论 SIM在体外能有效地抑制癌细胞的增殖，其作用可能是通过诱导其凋亡产生的。 【关键词】 辛伐他汀；卵巢癌；HO8910PM细胞；细胞增殖Inhibitory effects of simvastatin on proliferation of highly metastatic ovarian carcinoma HO8910PM cells FU Weiyu,LAN Liubo, CHEN Jie, LIANG Nianci (Department of Biochemistry,Guangdong Medical College,Zhanjiang 524023，China) Abstract：Objective To investigate inhibitory effects of Simvastatin(SIM) on proliferation of human highly metastatic ovarian carcinoma HO8910PM cells.Methods HO8910PM cell growth inhibition mediated by SIM was detected by MTT. The cell cycle was assessed by flow cytometry. Apoptosis was observed by Hoechst 33258 fluorescence staining.Results SIM could inhibit the proliferation of HO8910PM cells significantly. Meanwhile, HO8910PM cells treated by SIM were block the cell cycle at G0/G1 phase. SIM could induce apoptosis.Conclusion In vitro SIM inhibited significantly the proliferation of HO8910PM cells and the activity may be realized by inducing apoptosis. Key words：simvastatin; ovariancarcinoma;HO8910PM cell;proliferation 他汀类药物作为羟甲基戊二酰单酰辅酶A (HMGCoA)还原酶抑制剂，已普遍用于临床治疗高胆固醇血症。近年来的研究表明，他汀类药物除降血脂的作用外，还因其可阻断甲羟戊酸的合成从而干扰了蛋白的异戊二烯化而产生一系列生物学效应，而对细胞周期、细胞增殖及凋亡产生影响12。本研究选用他汀类药物中的辛伐他汀（Simvastatin，SIM）处理人高转移卵巢癌细胞HO8910PM，探讨其对细胞增殖的抑制作用及可能的机制。 1 材料与方法 1.1 实验材料与试剂 HO8910PM细胞株购自上海细胞生物所；辛伐他汀(Sigma，实验前用DMSO溶解，培养液稀释，DMSO终体积浓度为0.1，实验证明该体积浓度对细胞无影响)；RPMI1640 培养基（Gibco）；小牛血清(杭州四季青工程有限公司)；MTT（Sigma）；PI（上海华舜生物工程有限公司）；细胞凋亡Hoechst染色试剂盒（江苏碧云天公司）。 1.2 方法 HO8910PM细胞培养于含体积分数10%小牛血清，100kU/L青霉素和100mg/L链霉素的RPMI1640培养液中，37、体积分数5%CO2饱和湿度细胞培养箱培养。取对数生长期细胞用于实验。 参照文献，取细胞接种于96孔板中，每孔接种90 μL（9000个/孔），培养过夜后，吸出培养液，加入新培养液90μL及不同浓度SIM药液10 μL，使其终浓度分别为4、8、16、32、64 μmol/L，每个浓度设3个平行孔，同时设置空白对照组、溶剂对照组和调零孔。MTT法测定SIM对HO8910PM细胞增殖的抑制作用：抑制率(%)=对照组A值-给药组A值对照组A值×100%。 SIM作用HO8910PM细胞48 h后，收集细胞，参照文献的方法，用Coulter EPTCSXL31240流式细胞仪检测细胞周期的变化，计算细胞增殖指数（PI）G2。 参照文献、细胞凋亡Hoechst染色试剂盒说明书，分别用SIM 0（对照）、32、64 μmol/L处理细胞48 h后观察细胞凋亡的形态学变化。 1.3 统计学处理 实验数据以±s表示，采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理。 2 结果 2.1 SIM对HO8910PM细胞增殖的抑制作用 不同浓度的SIM(864μmol/L)分别作用于HO8910PM细胞24、48、72h后，对细胞增殖的抑制作用与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05），可认为药物能明显抑制细胞的增殖。其抑制率随剂量增加、用药时间的延长而增大，见表1。表1 SIM对HO8910PM细胞增殖的抑制作用2.2 SIM对HO8910PM细胞周期的影响 SIM作用细胞48 h后，HO8910PM细胞的周期发生变化。随着SIM作用终浓度的增加（864μmol/L），G0/G1期细胞数增多，S和G2/M期细胞数减少，细胞增殖指数PI值逐渐减小。这提示SIM将HO8910PM细胞阻滞在G0/G1期。64 μmol/L SIM处理细胞时，有指示细胞凋亡的亚G1期“凋亡峰”出现，凋亡率为6.0%，见表2，图1、2。表2 SIM作用48 h 后对HO8910PM细胞周期的影响 2.3 荧光染色观察SIM对HO8910PM细胞形态的影响 Hoechst 33258荧光染色结果显示，对照组细胞核大小较均一，呈圆形或椭圆形，染色质分布均匀，此外光下显蓝色荧光，出现个别坏死细胞（图3A），而经SIM处理48 h后的HO8910PM细胞形态则出现不同程度皱缩、变形，染色质浓缩，部分细胞核染色体碎裂，并有凋亡小体出现（图3B、C）。 3 讨论 细胞凋亡是细胞在其生长、发育过程中发生的一种复杂的生理和病理过程，对机体的正常发育和自身稳定起着极其重要的作用。许多抗癌药物都是通过最终触发肿瘤细胞凋亡通路达到治疗的目的5。大多数抗癌药物都可引起肿瘤细胞的凋亡，诱导细胞凋亡可能是抗癌药物发挥作用的共同通路，所以细胞凋亡成为评估抗癌药物作用能力的一项重要指标。 本实验研究发现，SIM体外对人高转移卵巢癌HO8910PM细胞的增殖有明显的抑制作用；流式细胞仪检测结果表明SIM使G0/G1期细胞数增多，而S期和G2/M期细胞数减少，细胞增殖指数PI值逐渐减小，并有凋亡峰出现，说明SIM将肿瘤细胞阻滞于G0/G1期，并抑制细胞的增殖。细胞周期中存在两个限制点，决定细胞是否继续增殖或是进入静止状态，一个限制点在DNA合成开始即G1S限制点，另一个在有丝分裂开始即G2M限制点，这其中G1S限制点更为重要，是细胞中很多调节因子及胞外刺激作用的位点。荧光双染的结果显示，经SIM处理48h后的HO8910PM细胞形态出现不同程度皱缩，变形，染色质浓缩，部分细胞核染色体碎裂，并伴有凋亡小体出现，这提示我们SIM体外对HO8910PM细胞增殖的抑制作用可能与其诱导凋亡有关。 近年来的研究表明，SIM的同类药物洛伐他汀具有诱导骨髓瘤、急性髓系白血病(AML)等肿瘤细胞凋亡的作用2,4,6，降低肿瘤细胞侵袭转移能力的作用3,7，其抗肿瘤作用的可能机制之一被认为与蛋白质异戊二烯化受抑有关。卵巢癌是最常见的恶性肿瘤之一，是危害妇女健康和生命最严重的一类疾病。有关SIM对卵巢癌HO8910PM细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用机制还不甚清楚。由于它能阻断HMGCoA向甲基二羟戊酸（MVA）转变并进一步抑制多种终产物如胆固醇、长醇和法尼基团等的形成，这些终产物可能对SIM介导的增殖抑制和诱导凋亡起重要作用89。本实验提示SIM具有诱导HO8910PM细胞凋亡的能力，为SIM作为潜在的抗肿瘤辅助药物提供了实验依据，其具体的机制有待于更深入的研究。【参考文献】 1 Feng C, Han A, Ye C, et al. The HMGCoA reductase pathway, statins and angio preventionJ. Semin Ophthalmol,2006, 21(1):2935.2 Cafforio P, Dammacco F, Gernone A, et al. Statins activate the mitochondrial pathway of apoptosis in human lymphoblasts and myeloma cellsJ. Carcinogenesis, 2005, 26(5):883891.3 张建和,符伟玉,覃燕梅,等.洛伐他汀影响人高转移卵巢癌细胞HO8910PM转移相关能力的研究J. 广东医学院学报, 2008, 26(4):373376.4 张建和,符伟玉,覃燕梅,等.洛伐他汀对高转移卵巢癌细胞HO8910PM细胞周期和增殖的影响J.实用癌症杂志, 2008, 23(3):227229.5 Waxman D J, Schwartz P S. Harmessing apoptosis for improved anticancer gene therapy J. Cancer Res,2003, 63(24):85638572.6 Dimitroulakos J, Nohynek D, Backway K L, et al. Increased sensitivity of acute myeloid leukemias to lovastatininduced apoptosis: A potential therapeutic approach J. Blood, 1999, 93(4):1308 1318.7 Farina H G, Bublik D R, Alonso D F, et al. Lovastatin alters cytoskeleton organization and inhibits experimental metastasis of mammary carcinoma cellsJ. Clin Exp Metastasis, 2002,19(6): 551559.8 Wang I K, LinShiau S Y, Lin J K. Suppression of invasion and MMP9 expression in NIH 3T3 and vHRas 3T3 fibroblasts by Simvastatin through inhibition of ras isoprenylationJ. Onc