凋亡相关基因产物FasAPO-1和bcl-2蛋白在肾癌组织中的表达及意义.doc

凋亡相关基因产物Fas/APO-1和bcl-2蛋白在肾癌组织中的表达及意义中华外科杂志 1998年第7期第36卷 临床论著作者：李宏军俞莉章杨宝龙孔祥田宓培郭应禄单位：100034 北京医科大学第一临床学院泌尿外科研究所关键词：肾肿瘤；癌基因蛋白质类；基因表达【摘要】目的研究凋亡相关基因Fas/APO-1和bcl-2 在肾癌发生发展中的作用。方法采用免疫组织化学法对35例肾癌组织和26例远离肾癌的正常肾组织Fas/APO-1和bcl-2蛋白的表达进行检测。结果肾癌组织Fas/APO-1蛋白表达率为57.14 %，明显低于正常肾组织中的表达率（84.62 %，P0.05），且表达强度也明显低下；而bcl-2蛋白表达率为80.00 %, 明显高于正常肾组织中的表达率(53.85 %，P0.05）。结论Fas/APO-1与bcl-2基因共同参与了肾癌的发生和发展。Expression and significance of Fas/APO-1 and bcl-2 protein in renal cell carcinoma Li Hongjun, Yu Lizhang, Yang Baolong,et al.Institute of Urology, First Teaching Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034.【Abstract】ObjectiveTo investigate the role of Fas/APO-1 and bcl-2 in occurrence and progression of renal cell carcinoma.MethodImmunohistochemisty method was used to detect the expression of Fas/APO-1 and bcl-2 protein in 35 cases of renal cell carcinoma tissues and 26 cases of normal renal tissues.ResultThe expression rate of Fas/APO-1 protein in renal cell carcinoma tissues was 57.14 %, significantly lower than that in normal renal tissues (84.62 %) (P0.05), and the intensity of expression was also lower. The expression rate of bcl-2 protein reached 80.00 %, much higher than that in normal renal tissues(53.85 %)(P0.05).ConclusionBoth Fas/APO-1 and bcl-2 take part in the occurrence and progerssion of renal cell carcinoma.【Key words】Kidney neoplasmsOncogene proteinsGene expressionFas/APO-1基因是凋亡信号基因，其基因产物Fas/APO-1蛋白是一种细胞凋亡信号受体1。Fas/APO-1和 bcl-2 是作用相反的凋亡相关基因，已有研究表明两者间的动态平衡对细胞凋亡起重要的调节作用。我们采用免疫组织化学方法对35例肾癌和26例远离癌组织的癌旁正常肾组织中凋亡相关基因 Fas/APO-1和bcl-2 蛋白进行检测，以探讨其在肾癌发生和发展中的作用。资料与方法1标本来源：35例肾癌组织标本来自本所19931997年间手术的肾癌患者；男23例，女12例；年龄3378岁，平均年龄54岁。26例正常肾组织为远离肾癌的正常肾组织。上述标本离体后用10 %福尔马林固定48小时，石蜡包埋，4 m切片，用于免疫组织化学染色。2方法： 检测Fas/APO-1蛋白表达所用的一抗为亲和纯化的兔抗人Fas/APO-1多克隆抗体，能与人源性Fas/APO-1分子C末端的第316至335个氨基酸特异性结合；Fas抗体（C-20）（购自美国Santa Cruz Biotechnology 公司)。检测bcl-2蛋白表达所用的一抗为鼠抗人bcl-2单克隆抗体bcl-2(100)（购自美国Santa Cruz Biotechnology 公司)。所有标本均在同一条件下采用链菌素亲生物素蛋白-过氧化酶连接法（LSAB），参照试剂盒说明书上步骤进行免疫组织化学染色，一抗稀释度为150。各步骤间均用磷酸盐缓冲液(PBS)洗片,Fas/APO-1阳性对照选用经病理确诊为淋巴瘤的病理石腊切片,bcl-2蛋白阳性对照选自bcl-2蛋白高表达的肾癌标本，用PBS代替一抗为阴性对照。3结果判定：Fas/APO-1蛋白表达以细胞膜出现棕黄色染色为阳性细胞，bcl-2蛋白表达以细胞浆出现棕黄色颗粒为染色阳性细胞，切片内染色阳性细胞率小于20 %为阴性显色，大于20 %为阳性显色。阳性显色者按细胞着色强度和范 围分为、3个级别。将26例肾癌组织和癌旁正常肾组织配对资料对比分析，观察Fas/APO-1蛋白表达强度，并进行统计学分析。4统计学分析：对本组资料采用卡方检验。结果1肾癌和正常肾组织Fas/APO-1蛋白表达结果：统计学分析两组间Fas/APO-1蛋白表达阳性率差异有显著性意义（P0.05）（表1）。Fas/APO-1蛋白表达强度的差异也有显著性意义。按表达强度将26例肾癌与癌旁正常组织配对标本分为肾癌表达低于正常肾组织组和高于正常肾组织组，两组结果显示，肾癌高表达组4例(15.38%)，表达强度一致组5例(19.23%)，正常肾高表达组17例(65.38%)；两组间差异有显著性意义（P0.01）。正常肾组织Fas/APO-1蛋白的表达部位以近曲小管最强，为较深棕黄色；集合管次之，为浅棕黄色；而髓袢及肾小球均无表达。表1肾癌和正常肾组织Fas/APO-1蛋白表达结果分组例数阳性例数%表达强度+肾癌组352057.14*151730正常肾组织组262284.6246142注：* 与正常组相比，表达阳性百分率差异有显著性意义（P0.05)235例肾癌中Fas/APO-1 蛋白阳性表达结果与肿瘤病理分类、分级及分期之间的关系（表2，3）：随着肾癌分级的增加，Fas/APO-1蛋白阳性表达率及表达强度均减弱，但统计学分析差异无显著性意义；Fas/APO-1蛋白表达在临床分期间的分布无明显趋势，差异也无显著性意义。表2Fas/APO-1蛋白表达在肾癌病理类型之间的分布情况组别例数阳性例数%表达强度+透明细胞癌组221150.0011920颗粒细胞癌组4375.001300肉瘤型组100.001000混合型组8675.002510 表3Fas/APO-1蛋白表达与肾癌病理分级之间的关系组别例数阳性例数%表 达 强 度+G1组10770.003610 G2组191157.898920G3组6233.3342003肾癌和正常肾组织bcl-2蛋白表达结果：统计学分析两组间差异有显著性意义（P0.05）(表4)。bcl-2 蛋白在肾癌不同病理分类、分级和分期间差别无统计学意义。表4肾癌和正常肾组织bcl-2蛋白表达结果组别例数阳性例数%表达强 度+肾 癌 组352880.0079127正常肾组织组261453.85*12851注：* 与肾癌组比较，阳性表达百分率差异有显著性意义(P0.05)讨论肿瘤的发生不仅由于细胞的增殖，而且还有细胞死亡的减少共同参与，即细胞增殖与死亡的动态平衡失调所致。细胞坏死与凋亡是细胞死亡的两种基本形式，而凋亡在肿瘤发生与治疗中的重要作用已为人们了解。凋亡的发生机制还不清楚，可能是多基因参与调控，受多种促进因素和抑制因素共同作用的结果。Fas/APO-1与bcl-2基因是凋亡相关基因中作用相反的两个典型代表。Fas/APO-1基因产物Fas/APO-1蛋白是分子量为45KD的跨膜糖蛋白，属神经生长因子与肿瘤坏死因子受体超家族成员，是一个细胞凋亡信号受体。它与Fas/APO-1抗体或配体结合后，其胞浆区经特殊胞内蛋白介导，直接激活凋亡基因产物，可以诱导Fas/APO-1蛋白所在细胞的凋亡1。bcl-2基因产物bcl-2蛋白为内膜蛋白，分布于线粒体、细胞核和内质网的膜性部分，在多种肿瘤细胞中有异常高表达，具有抑制凋亡的作用2，3。对Fas/APO-1及bcl-2蛋白在肿瘤细胞中的表达情况及表达强度的研究是探讨肿瘤的发生、判断愈后及进行 Fas/APO-1途径治疗肿瘤的重要基础。已有研究表明 Fas/APO-1及bcl-2蛋白在许多正常及恶性肿瘤组织细胞中都有表达3，4，但在泌尿系肿瘤中尚缺乏深入系统的研究。我们采用免疫组织化学的方法对35例肾癌组织和26例正常肾组织Fas/APO-1和bcl-2蛋白表达进行了检测，结果表明：在正常肾组织中Fas/APO-1蛋白表达以近曲小管细胞为主，集合管次之，而髓袢及肾小球全部无表达，这与 Leithauser等5的报道一致。 Leithauser等5检测的6例肾癌标本 Fas/APO-1蛋白全部阳性，而我们检测35例肾癌标本中 Fas/APO-1 蛋白表达率虽然较高（57.14 %），但比癌旁正常肾组织中的表达率（84.62 %）明显减少，且表达强度明显减低。bcl-2蛋白表达情况则相反：以肾癌组织中表达率较高且较强，而正常肾组织中表达率较低且较微弱。细胞膜表达有功能的Fas/APO-1蛋白，并且其表达量达到一定强度是通过Fas/APO-1途径诱导凋亡作用的首要条件6。已有研究表明某些细胞在其发生发展过程中 Fas/APO-1基因的表达不断增加，而凋亡抑制基因bcl-2的表达逐渐减少，最终导致细胞凋亡的发生，完成细胞代谢过程，达到细胞增殖与凋亡的平衡7。由于肾癌多数可能起源于近曲小管8，与正常肾组织相比（主要是与近曲小管相比）肾癌组织中Fas/APO-1蛋白表达率较低，表达强度较微弱，且与肿瘤病理分级有一定联系，随着肿瘤病理分级的增加，Fas/APO-1蛋白表达率逐渐降低，且表达强度减弱。虽然由于研究例数的关系未能证明统计学显著性存在，但从表4中还是不难看出这种趋势的存在；bcl-2 蛋白表达率较高，表达较强。因此组织细胞在Fas/APO-1蛋白表达低下及bcl-2 蛋白表达增高的情况下可能难以进行正常的凋亡作用，从而破坏了细胞增殖与凋亡的动态平衡，这可能是肾癌形成及进展的原因之一。Fas/APO-1与 bcl-2基因可能相互协调起作用，也可能分别起作用来共同调节细胞的凋亡作用9，10。Fas/APO-1与 bcl-2基因在肿瘤发生发展中的调控机制比较复杂，深入研究两者在肿瘤中的表达情况及作用是十分必要的。参考文献1Nagata S, Golstein P. The Fas death factor. Science,1995,267:1449-1456.2Park JR, Hockenbery DM. bcl-2, a novel regulator of apoptosis. J Cell Biochem, 1996,60:12-17.3Yang E, Korsmeyer SJ. Molecular thanatopsis: a discourse on the bcl-2 family and cell death. Blood, 1996,88:386-401.4李宏军，俞莉章，郭应禄. Fas系统在肿瘤研究中的应用.中华外科杂志, 1997,35:59-63.5Leithauser F, Dhein J, Mechtersheimer G, et al. Constitutive and induced expression of APO-1, a new member of the nerve growth factor/tumor necrosis factor receptor superfamily, in normal and neoplastic cells. Lab Invest， 1993,69:415-429.6Weller M, Malipiero U, Rensing-Ehl A, et al. Fas/APO-1 gene transfer for human malignant glioma. Cancer Res, 1995, 55:2936-2944.7Tamura A, Yui K. Age-dependent reduction of bcl-2 expression in peripheral T cells of lpr and gld mutant mice. J Immunol, 1995,155:499-507.8吴阶平主编.泌尿外科.济南：山东科学技术出版社，1993.479.9Mapara MY, Bargou R, Zugck C, et al. APO-1 medi