地黄饮子孵育BMSCs移植对大鼠脑梗塞HSP70和VEGF表达的影响.doc

地黄饮子孵育BMSCs移植对大鼠脑梗塞HSP70和VEGF表达的影响【摘要】目的探讨地黄饮子孵育骨髓间充质干细胞(Bone marrow stromal stem cells, BMSCs) 移植对大鼠脑梗塞HSP70和VEGF表达情况的影响。方法健康SPF级Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、BMSCs组、维甲酸组和地黄饮子组。用线栓法制成Wistar大鼠大脑中动脉缺血模型(MCAO)，术后24 h假手术组、模型组大鼠经尾静脉注射生理盐水，其余各组大鼠经尾静脉输入相应药物孵育BMSCs。分别于移植后7d和14d后断头取脑,用免疫组化法检测脑组织HSP70和VEGF蛋白的表达情况。结果与假手术组比较，模型组HSP70和VEGF表达明显升高(P0.05);与模型组比较，各治疗组HSP70和VEGF表达显著升高(P0.05)，其中药物孵育BMSCs组HSP70和VEGF表达均高于单纯血清孵育BMSCs组(P0.05)。结论促进脑组织HSP70和VEGF的表达可能是地黄饮子孵育BMSCs移植治疗脑梗塞的作用机理之一。 【关键词】 脑梗塞; 骨髓间充质干细胞; 地黄饮子; 热休克蛋白; 血管内皮生长因子脑血管病是一种常见且后果非常严重的疾病,脑梗塞又是脑血管病中最常见者，寻找安全有效治疗脑梗塞的措施一直是近年来的研究热点。研究表明，骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植可有效保护脑缺血性损伤1。地黄饮子出自黄帝素问宣明论方，具有补肾摄阳、化痰通络之功，是治疗脑梗塞的有效药剂2。本文研究了地黄饮子血清孵育BMSCs移植对鼠脑梗塞脑组织HSP70和VEGF表达的影响作用，为中药与BMSCs移植联合临床治疗脑梗塞提供理论依据。1 材料与仪器SPF级Wistar大鼠由甘肃中医学院SPF级实验动物中心提供，动物生产合格证号：SCXK(甘)2004全反式维甲酸(RA，igma)，地黄饮子(甘肃中医学院附属医院药剂科)，低糖DMEM培养基(美国Gibco公司，批号：1240031)，胰蛋白酶(Gibco公司)，CD45、CD90荧光标记抗体，HSP70(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：sc-24),VEGF(武汉博士德生物工程有限公司，批号：BA0407)。CO2恒温培养箱(SANYO，MCO-18AIC)，倒置相差显微镜(OLYMPUS，型号XDS-1B)，流式细胞仪(BECKMAN COULFER XL-100)，医学图像分析系统(成都泰盟，型号BI-2000)。2 方法2.1 BMSCs的分离、纯化及鉴定Wistar大鼠，体质量(12010)g，肌肉注射水合氯醛麻醉后断颈椎处死，无菌条件下取双侧股骨、胫骨、肱骨，取骨髓细胞按全骨髓贴壁筛选法3分离、纯化BMSCs，获得细胞形态单一均匀，融合后呈典型的极性，漩涡状生长的第3代BMSCs，流式细胞仪检测CD90+CD45-细胞达到97%。2.2 含药血清的制备将地黄饮子药材浸于10倍量常水中过夜，第2天加热煮沸lh，药渣再加入8倍量的常水煮沸45 min，将药液浓缩，使其浓度为1.0g生药/ml，于4冰箱保存。体质量(25020)g Wistar大鼠10只，晚禁食，灌服药液(剂量按1g生药/100 g大鼠)，连续3 d，2次/d，于第3天给药后1h用水合氯醛麻醉动物(剂量为3.5 ml/kg)后，从股动脉取血，自然分离血清，将各组动物血清混合，56水浴中灭活30 min，0.22 μm滤器过滤除菌，分装，-20保存备用。另设空白组大鼠30只，雌雄各半，晚禁食，灌服生理盐水，余方法同上制备正常大鼠血清。2.3 大鼠BMSCs的孵育培养第3代BMSCs消化后按1×105/ml密度接种至6孔培养板培养，待细胞70%80%融合后，吸去10%L-DMEM培养液，随机数字表分为RA组、地黄饮子组、空白组进行培养(RA为0.5 μmol/L，中药组为含中药血清10%L-DMEM培养液诱导，空白组含空白大鼠血清10%L-DMEM培养液孵育)。细胞培养72 h后收集各组细胞，配制成1×106/ml备用移植。2.4 动物模型的制备与细胞移植参考采用改良的Longa法4阻塞大鼠大脑中动脉制备局灶性脑缺血动物模型(middle cerebral artery occlusion,MCAO)。术后24 h对大鼠神经功能评分，参考Longa等5评定神经功能缺损程度的5级4分法标准进行评分，评分标准为：0分：无神经系统症状;1分：不能完全伸展对侧前爪;2分：爬行时转圈;3分：向对侧倾倒;4分：不能自行行走，意识丧失。以13分的大鼠入选本次研究。假手术组大鼠接受相似手术处理,但是不插入线栓。对造模成功的48只SPF级大鼠随机均分为模型组(MCAO组)、BMSCs移植组(BMSCs组)、维甲酸诱导BMSCs移植组(维甲酸组)、地黄饮子血清诱导BMSCs移植组(地黄饮子组)，每组12只大鼠;术后24 h假手术、模型组大鼠尾静脉注射生理盐水1 ml，其余各组大鼠于造模24 h后经尾静脉输入等量相应药物诱导后的骨髓间充质干细胞1 ml(1×106个/ml)。2.5 标本制备及指标检测各组大鼠在细胞移植后，7 d,14 d分别处死6只大鼠，用4%多聚甲醛溶液进行灌注固定,取出全脑,生理盐水冲洗,除去积血,放入4%多聚甲醛固定，石蜡包埋,切片,分别进行免疫组化染色(SABC法),以胞质染成棕黄色为阳性细胞。镜下观察HSP70和VEGF在半暗带皮层神经细胞的免疫反应强度。每张切片于大脑皮质区随机取5个高倍镜视野(400×)，并计算其均值,用成都泰盟BI-2000型图像分析系统(免疫组化分析软件)测定HSP70和VEGF的平均灰度值(该值与阳性表达水平呈反向关系);用阳性细胞计数软件统计每个高倍镜视野阳性细胞数，其均值即为该标本每高倍镜视野中的阳性细胞数。2.6 统计学分析将所得计量资料以s表示。数据采用SPSS10.0软件进行分析,多组间比较采用单因素方差分析检验。P0.05为差异有统计学意义。3 结果3.1 HSP70在大脑皮质区的表达情况HSP70阳性细胞主要出现在梗塞周边区的皮层，主要为神经细胞，也可见少量的胶质细胞和毛细血管内皮细胞。阳性表达主要在胞质,DAB显色呈棕黄色者即为阳性细胞。假手术组有少量表达,模型组表达明显增加(P0.05);与模型组比较, 地黄饮子组、维甲酸组和BMSCs组HSP70表达显著增加(P0.05)。见表1。表1 HSP70在大脑皮质区中的表达3.2 VEGF在大脑皮质区的表达情况VEGF蛋白阳性表达主要在缺血半暗带区或相当处的小胶质细胞和巨噬细胞,与Plate 等6的报道一致。阳性表达主要在细胞浆，DAB显色呈棕黄色者为阳性细胞。假手术组有少量表达，模型组表达明显增加(P0.05);与模型组比较,地黄饮子组、维甲酸组和BMSCs组VEGF的阳性表达均显著增加(P0.05)。见表2。表2 VEGF在大脑皮质区中的表达4 讨论骨髓间充质干细胞(BMSCs)是中胚层来源的细胞,具有很强的增殖能力和多向分化潜能。研究证实外源性BMSCs在小鼠脑内可转变为神经元,提示BMSCs具有显著的可塑性和抗脑缺血损伤潜能7。BMSCs移植后可以在迁移至大鼠的缺血区发挥作用并向神经元细胞和神经胶质细胞分化，促进脑缺血后大鼠的神经功能恢复。缺血性脑血管病即脑梗塞属中医学中风范畴，地黄饮子由熟地黄、山茱萸肉等中药组成，具有补肾摄阳、化痰通络之功，是治疗脑梗塞的有效药剂。本文经尾静脉移植用地黄饮子中药血清孵育BMSCs以治疗脑梗塞大鼠,研究其对大鼠脑缺血损伤的保护效应及其作用机制。本研究发现各治疗组大鼠脑组织HSP70和VEGF表达均明显增加(P0.05)，且地黄饮子孵育BMSCs组HSP70和VEGF的表达均高于单纯血清孵育BMSCs组(P0.05)。大量研究表明,在脑梗死发生后,VEGF的表达会上调,促进半暗带区新血管形成,达到缩小梗塞体积,减轻缺血损害的目的8。VEGF 是一种特异地作用于血管内皮细胞的内皮生长因子,有促进内皮增生,增强血管通透性,加速新血管形成的作用。缺血缺氧等条件确实可以促进VEGF的表达上调,而VEGF 可能参与缺血性脑血管的血管修复过程,从而改善缺血、缺氧情况。通过采用相应的治疗促进VEGF的表达,将有助于改善缺血性神经功能损伤,不断提高缺血性脑血管病的治疗水平，为临床治疗缺血性脑血管疾病提供一种血管再生的新思路9。血管再生是决定缺血性神经元存活的关键因素,与缺血性脑卒中病人的预后关系密切10。热休克蛋白70(HSP70)是一种极敏感和可靠的脑缺血的标志。HSP70是HSP家族中的一种,它的主要功能是保护各种应激所致的细胞损伤。HSP70对大脑缺血性损伤有保护作用,它的保护作用机制为:作为分子伴侣,有助于蛋白质的正确折叠;通过直接抑制促细胞凋亡蛋白的功能及间接提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平而抑制细胞凋亡11。提示促进脑组织HSP70和VEGF的表达可能是地黄饮子孵育BMSCs移植治疗脑梗塞的作用机理之一。【参考文献】 1 桂 莉，李露斯,范文辉.骨髓间质干细胞移植对脑梗死大鼠神经功能的恢复作用J.中国临床康复,2004,8(28):6060.2 盖成安，张立明，刘军华.地黄饮子治疗进展性脑梗塞26例J.中国中医急症, 2002，11(5):405.3 刘永琦，范 萍，吴晓晶，等.不同条件下骨髓间充质干细胞的分离培养及其生物学特性研究J.细胞与分子免疫学杂志,2010,26(3):221.4 曹勇军,程彦斌.线栓法建立大鼠局灶性脑缺血/ 再灌注模型的改进与探讨J.中国应用生理学杂志,2001，17(2):198.5 Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middlecerebral artery occlusion without craniectomy in ratsJ.Stroke,1989,20(1):84.6 Plate KH,Beck H,Danner S ,et al. Cell type specific up - regulation of vascular endothelial growth factor in an MAC- occusion model of cerebral infarctJ.J Neuropathol Exp Neurol,1999,58(6):654.7 刘敬霞,李建生,赵跃武,等.脑脉通联合骨髓间充质干细胞经动脉移植保护大鼠脑缺血损伤的研究J.中医研究，2007，20(6)：12.8 黄 丽，涂 丽，高铁祥.益气法与化瘀法对脑梗死大鼠脑组织VEGF蛋白表达影响的实验研究J.中国中医药科技，2007，14(4)：229.9 范丽君.脑梗死患者血管内皮生长因子的变化J.河南职工医学院学报，2003，15(4):16.10 海 舰,丁美修.血管内皮生长因子与缺血性脑血管疾病J.国外医学生理病理科学与临