实验方案：成年猪MSCs的培养及鉴定.doc

成年猪MSCs的培养新的实验方案实验材料：（1） 取材准备：骨髓穿刺针，50ml离心管（1个含有抗生素无血清30mlL-DMEM,1个30ml含抗生素的PBS溶液，1个含有30ml枸橼酸钠抗凝剂，2个空离心管），酒精棉球，枸橼酸钠（105mmol/l,即32g/l，与血液以1:9比例稀释）。（2） 细胞分离准备：100ml无血清含抗生素的L-DMEM(洗液)，100ml含抗生素的PBS溶液，10ml离心管，5ml枪头和枪，离心管架，1.5ml离心管，1.5ml枪头和枪，percoll细胞分离液（1.073g/ml），毛细微管，35x10（小）培养皿，培养瓶（25cm2,75cm2）,10%血清L-DMEM,废液缸。（3） 溶液配制：电子天平，称量纸，钥匙，磁力搅拌器，转子，5ml注射器，100ml烧杯，250ml烧杯，100ml量筒，250ml滴流瓶，100ml滴流瓶，一套滤器，废液缸，瓶塞，ph计，1M盐酸，1M氢氧化钠， 枸橼酸钠：3.2g/100ml. 3.2g枸橼酸钠+100mlDMEM 肝素钠(140iu/mg)：200iu/ml 0.01M PBS ：Nacl 8g, kcl 0.2g, Na2HPO4 1.44g ,KH2PO40.24g, 先加入800ml蒸馏水，然后调节Ph到7.2-7.4，最后加水定容到1L,高压灭菌20min,最后加入50g/ml卡那霉素。 1.073g/ml percoll分离液：储存液，percoll原液：8.5%Nacl=9:1; 工作液：10ml储存液+7.544ml0.85%氯化钠。 L-DMEM洗液：将原粉L-DMEM倒入容器中，然后用注射器抽超纯水冲掉残余的原粉，然后加入800ml超纯水搅拌溶解后，加入3.7g/l NaHCO3,完全溶解后加入5.958g/l HEPES,完全溶解后，调节PH到7.2-7.4，过滤，然后加入50g/ml卡那霉素和300g/ml的两性霉素B。 L-DMEM完全培养液：配制方法同上，最后加入10%胎牛血清和0.5g/ml的两性霉素B，要求做对照，一份为未经过过滤的含有10%胎牛血清的L-DMEM,另一份为经过过滤的含有10%胎牛血清的L-DMEM.1M HCl：取9ml盐酸加水到100ml，按照37%浓度计算，盐酸的密度为1.19，即9*1.19*0.37/36.46=1.087mol/l.然后通过过滤或离心，贴上标签。1M NaOH：欲配制100ml,则m=1*0.1*40=4g.将称量好的氢氧化钠加入烧杯中，然后加入蒸馏水将其溶解，待完全溶解后，用蒸馏水定容轻轻摇动，使溶液混合均匀，然后进行过滤或离心。贴好标签。注释： （1）取材，离心稀释用PBS的培养皿标记为A （2）取材，离心稀释用L-DMEM的培养皿标记为B. （3）毛细吸管要在使用前用酒精灯灼烧灭菌或者高压灭菌。 （4）取材溶液，调PH溶液以及离心洗涤溶液均应该过滤或离心。实验步骤：1，成年猪骨髓间充质干细胞的采集：（1） 提前一天进行骨髓穿刺针和50ml离心管的高压灭菌，对保温箱清洗并消毒，冷冻冰袋，准备10ml注射器，酒精棉球，器材包装袋。取材用的含抗生素的L-DMEM洗液和PBS.（2） 首先用枸橼酸钠冲洗骨髓穿刺针，防止采集过程中出现凝血块，然后用酒精棉球擦拭骨髓穿刺针，进行股骨腔，髂骨多点穿刺，要求穿刺最后，每个空离心管中含有50ml以上的混合液。每次穿刺后，都要用酒精棉球擦洗穿刺针头，并用抗凝剂冲洗骨髓穿刺针。将用PBS和L-DMEM的不同冲洗液标记并放到不同的离心管中，取材最后要求离心管用酒精棉球擦洗，然后封装到含有冰块的保温盒中，并颠倒数次，防止出现血凝块。2，成年猪骨髓间充质干细胞的分离培养：（1）将采集的猪骨髓在2h之内拿到实验室，并颠倒数次防止沉淀凝集，然后用酒精棉球擦拭干净然后放入4度冰箱，开始进行无菌操作台的擦拭，所需物品摆放，紫外消毒。20min后开始操作。（2） 取出7只10ml离心管，每管加入7ml混悬液，要求无菌操作，在没有灼烧要求的条件下，关闭酒精灯。然后离心，480g,5min.去除上清液，加入相应的L-DMEM或PBS进行再次离心，离心3次一共，最后将离心沉淀收集到50ml 离心管中，加入15ml相应的稀释液进行稀释，根据分层离心液的多少制定稀释液的量（1.073g/ml percoll分离液，按照分离液和细胞悬液2:1比例，则细胞悬液至少要10ml）。要求加入0.8ml percoll分离液+0.4ml细胞悬液。800g,25min.然后用毛细吸管吸取分层后的骨髓间充质干细胞。将分层后的白膜层加入到5ml离心管中，然后用L-DMEM洗液洗涤离心480g,5min.离心两次，最后去除上清，将沉淀细胞稀释5倍到10ml离心管中，计数，调整细胞密度为2x105/cm2,接种到25cm2培养瓶中(0.1-0.2ml/cm2),或者接种到35mm x10mm的培养皿中约1.0-1.3ml/皿。 3， 成年猪骨髓间充质干细胞的培养与观察：（1）传代前细胞以分散的，集落克隆方式生长，涡旋状，贴壁细胞以圆形向纺锤形，多边形，星形靠拢；传代后细胞以分散均匀的辐射状平行排列，传代后细胞呈纺锤形纤维状；培养第三天除去未贴壁细胞后，细胞克隆开始形成，细胞呈成纤维细胞样生长，第七天，镜下观察到大小不一的克隆，即亮的，大圆的细胞为一个克隆，细胞培养到12-14天基本长满。（2） 原代细胞8-10天相邻集落融合达到80-90%，原代细胞在10天左右传代，之后每4-6天传代；接种24h有少量细胞贴壁生长，呈卵圆形或细小梭型，72h后贴壁细胞伸展，在4天内呈相对静止的潜伏期状态，从第5天细胞生长加快，呈克隆集落方式增殖， 7天后出现较大的克隆，多数呈长梭型细胞，偶尔宽大平坦的多边形细胞，经10-14天达到80-90%融合。15-17天之后细胞扩增进入停滞期，平均3-5天左右即可传代。4，成年猪骨髓间充质干细胞的鉴定： 分为细胞的形态观察鉴定；细胞组织化学染色法鉴定；细胞功能观察鉴定。 2006年，国际细胞治疗协会提出了关于间充质干细胞鉴定的最低标准，包括3方面内容：在标准培养条件下能贴塑造贴壁生长95%以上的细胞表达CD105、CD73、CD90，同时95%以上的细胞不表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19、HLA-DR能分化为骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞。（原出自：Dominici M, Le Blanc K, Mueller I,et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement .cytotherapy.2006;301(2):338:343）利用细胞免疫荧光染色方法：方法一：免疫荧光染色即将已知抗体或抗原标记上荧光素。用此特异性试剂，浸染含有相应抗原或抗体的组织细胞标本。借助抗原抗体的特异性结合，在抗原或抗体的存在部位出现荧光，从而可以定位标本内的抗原或抗体。间接免疫荧光法称双层法。即用未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在。（1）实验材料：0.01mol/l PH 7.2PBS：氯化钠8g,磷酸氢二钠1.15g,磷酸二氢钾0.2g.加蒸馏水至1000ml溶解后，调PH至7.2，0.5mol/l PH9.5碳酸氢盐缓冲液（CB）：称取NaHCO3 3.7g, Na2CO3 0.6g 加蒸馏水至100ml.溶解后调PH50%缓冲甘油：1份纯甘油加1份CB.伊文氏蓝溶液：称取1g伊文氏蓝，加100ml PBS中，溶解后加1ml 1%NaN3,过滤，配制的1%伊文氏蓝溶液在4保存。临用前取0.1ml，加入9.9ml PBS稀释呈0.01%浓度使用。硫酸重铬酸钾酸液：重铬酸钾：水：浓硫酸=1:2:8（m:v:v）配制的时候在耐强酸的搪瓷或塑料容器中，先称取重铬酸钾然后按比例加入蒸馏水使其溶解，然后按比例慢慢加入相应的浓硫酸，边加边搅拌。配制完成后待其冷却后，贮存到特殊的酸缸中备用。一抗二抗选择： （2）FITC标记荧光抗体的制备（Marsshall 氏法） 材料：抗体球蛋白溶液、0.5mol/l pH9.0碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、三角烧瓶（2550ml）、冰及冰槽（或1000ml烧杯）、电磁搅拌器、灭菌吸管、透析袋、玻棒、棉线及烧杯（500ml）、pH7.2或8.0的0.01mol/L PBS等。 方法及步骤： 抗体的准备：取适量已知球蛋白浓度之溶液，置入三角烧瓶中，加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后蛋白浓度为20mg/ml，缓冲液容量为总量的1/10，混匀，将三角烧瓶置冰槽中，电磁搅拌（速度适当以不起泡沫为宜）510min。 荧光素的准备：根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克蛋白加0.01mg 荧光素，用分析天平准确称所取所需的异硫氰酸荧光素粉末。 结合（或称标记）：边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻棒上（大约510min内加完），加毕后，继续搅拌1218h。结合期间应保持蛋白溶液于4左右，故须及时添冰去水；亦可将结合装置安放在4冰箱或冰库中。 透析：结合完毕后，将球蛋白的溶液离心（2500r/min）20min，除去其中少量之沉淀物，装入透析袋中后再置于烧杯中，用pH8.0缓冲盐水透析（04）过夜。过柱：取透析过夜的标记物，过葡聚糖凝胶G-25或G-50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。（3） 单层生长细胞准备与固定盖玻片使用之前的处理：首先泡酸过夜，之后用无水乙醇泡30min,再用双蒸水漂洗干净，最后高压灭菌，如果用24孔板最好买1cm边长的小玻片。如果用6孔板则买20x20mm（18x18mm）的盖玻片。取对数生长F1，F3代细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，接种到预先放置几张铺有7x22mm盖玻片的6孔培养板（孔径34.8mm）或培养瓶或35mm培养皿中，37，5%CO2培养箱培养2天，待细胞接近长成单层，取出盖玻片，浸入PBS（0.01mol/l PH7.4）清洗3遍，然后选择适当的固定剂固定细胞，常用的固定剂有4%多聚甲醛（固定20min），95%酒精（固定10-30min）,丙酮（固定5-10min）。（4） 细胞爬片的细胞通透及封闭（对比观察，一个用通透剂一者不用）首先用PBS稀释tritonX-100，使其终浓度达到0.5%。然后用0.01M PBS冲洗固定后的细胞爬片，然后用tritonX-100对细胞进行通透处理，处理10-20min，然后用PBS 清洗3次，每次3min.之后加入山羊血清工作液或1%BSA封闭室温处理30min。（5） 染色和洗涤观察Hoechest细胞核染色及荧光观察：将已封闭处理的细胞吸去或甩去多余的液体，然后用毛细滴管吸取经适当稀释的特异性抗CD45，CD105，CD90和CD34的一抗（1:100，联科生物公司）加在其上，37保温30-60min或1.5h,（或4冰箱中过夜，拿出之后在37条件下复温45min）,之后PBS洗4次，每次5min,然后加稀释的FITC标记二抗（1:100，联科生物公司，用0.01%伊文氏蓝溶液稀释），避光，在湿盒中，37孵育1h，PBS洗3次，每次5min，然后用Hoechest33342避光染色细胞核，5min,然后用PBS冲洗3次。最后用50%缓冲（0.5mol/l碳酸盐缓冲液 ph9.0-9.5）甘油封固，荧光显微镜观察。 DAB显色及苏木素复染荧光观察：将已封闭处理的细胞吸去或甩去多余的液体，然后用毛细滴管吸取经适当稀释的特异性抗CD45，CD105，CD90和CD34的一抗（1:100，联科生物公司）加在其上，37保温30-60min或1.5h,（或4冰箱中过夜，拿出之后在37条件下复温45min）,之后PBS洗4次，每次5min,然后加稀释的FITC标记二抗（1:100，联科生物公司，用0.01%伊文氏蓝溶液稀释），避光，在湿盒中，37孵育1h，PBS洗3次，每次5min，避光条件下滴加DAB显色液，光镜下观察，一旦细胞被染色或者出现浅棕色本底时即可冲洗，大概1分钟范围。（一般DAB显色时间越短则封闭的时间短或一抗的浓度高，DAB显色时间越长则封闭的时间长或者一抗的浓度过低）自来水冲洗2次，每次1min.苏木素进行复染，然后进行冲洗1次，5min. 接着用盐酸酒精分化1-2s.放入自来水浸泡3-5min,再进行酒精脱色（依次为80% 1次，95% 2次， 100% 2次），接着用二甲苯透明，分别在二甲苯和二甲苯中各浸泡10min.最后用中性树胶封片，镜下观察拍照。 方法二：（来自：猪骨髓间充质干细胞分离培养及其核移植胚胎发育潜能研究）用0.25%胰蛋白酶消化第3代细胞，接种铺有盖玻片的6孔培养板中，37，5%CO2培养箱培养2天，PBS清洗3遍，经4%多聚甲醛固定20min后，PBS洗2次，0.25%triton-PBS液作用20min，清洗，室温下1%BSA封闭30min，吸去液体后，加PBS稀释的一抗（1:100博士德公司），37 1.5h，PBS洗4次，每次5min，加稀释的二抗（1:100中山公司），避光室温孵育1h,PBS洗3次，每次5min，hoechst33342避光染色细胞核5min,PBS洗3次，荧光显微镜观察。采用细胞免疫荧光染色法对所培养的pMSCs进行检测，结果如下图可以看出pMSCs表面标志Vimentin和CD105标记呈阳性，而CD45标记呈阴性。通过荧光显微镜观察到猪骨髓间充质干细胞表面标志的阴性和阳性。阳性部位出现荧光，依照荧光素种类不同呈现不同颜色的荧光。如异硫氰酸荧光素呈黄绿色荧光，罗丹明B200呈橙红色荧光。标本染色后应及时观察并照相。若无时间立即观察标本，可把标本放入4冰箱保存。但应注意，过夜后特异性荧光减弱30%，一周后则减弱50%，如果用聚乙烯醇封片，可保存较长时间。用0.01%伊文氏蓝的0.01mol/l ph7.2 PBS稀释荧光抗体，可将背景细胞和组织染色，呈红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明的对比，减少了非特异性荧光，宜作常规应用。伊文氏蓝一般先配制成1%溶液，保存在4，用前再稀释至0.01%用以稀释荧光抗体。并且用胰酶消化组织片或10%牛血清蛋白BSA封闭法等也可消除非特异性染色，提高特异性染色。方法三：利用Ficoll-paque（Ficoll-paque, Amersham biosciences, Uppsala,Sweden）密度梯度离心,将猪骨髓间充质干细胞从100ml采集的猪骨髓细胞悬液中分离出来，然后放入到巴克斯特袋子（baxter bag, Baxter healthcare,Ltd, Thetford, Norfolk, UK）中,储存在4。然后将收集的细胞以50000个/cm2接种到-MEM培养基中，其内不含有核苷酸，但是含有10%FCS,2mmol/l l-谷氨酸盐，青霉素，链霉素，另外增加有1ng/ml FGC（fibroblast growth factor2）,细胞在汇合度达到75%，用胰蛋白酶消化并以1000个/cm2的密度接种。为了进一步鉴定MSCs，将消化传代的细胞培养在含有CD45的培养基中。（来自：serial noninvasive in vivo positron emission tomographic tracking of percutaneously intramyocardially injected autologous porcine mesenchymal stem cells modified for transgene reporter gene expression.） 5，成年猪骨髓间充质干细胞的生长曲线及倍增时间测定： 细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法，只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。因而在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观察中，生长曲线的测定是最为基本的指标。细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。 在生长曲线上细胞数量增加1倍时间称为细胞倍增时间，可以从曲线上换算出。细胞倍增的时间区间即细胞对数生长期，细胞的传代、实验等多应在此区间进行。（1） 利用96孔板测定细胞生长曲线：取F1代数细胞，调整细胞浓度为2x104/ml后，接种到96孔培养板，每孔细胞悬液200l, 置37，5%CO2,饱和湿度培养箱培养后，用胰酶-EDTA进行消化，用台盼蓝拒染法计数活细胞，每天取12孔，共7天；根据计数结果绘制细胞生长曲线。记录测量的结果，即培养潜伏期，多长时间进入对数生长期，对数增殖期持续时间，铺满皿底所需时间，细胞进入平台期多长时间，停止生长多长时间。（2） 利用35mm培养皿测定细胞生长曲线：取生长状况良好的F2代细胞，用0.25%胰酶+EDTA消化液在37培养箱中消化3min，制成单细胞悬液，然后以5x104个/ml密度接种到30个直径为35mm的培养皿中，每个皿1ml,随机分成10组，每组3皿，每天检测一组中每皿的细胞总数，细胞数=(4个大方格细胞数/4)x104，取3个皿的均值,如此至第10组结束，即共用10天，每代30个皿。以培养时间（time of culture）为横坐标，以三天的细胞数平均值为纵坐标绘制生长曲线。（3） 以24孔板测定细胞生长曲线：取F2代MSCs,在对数生长期，消化计数，用MSCs培养基制成细胞悬液5x104个/ml, 0.5ml/孔，在24孔板中培养，每天取3个孔，连续7天，台盼蓝染色计数活细胞数，计算平均值，连续观察6天，以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，绘制生长曲线。采用血球计数板计数法计数每孔的细胞数，计算公式：细胞数/毫升原液=（4个大方格细胞数之和/4）x 104绘制生长曲线。（4） 细胞群体倍增时间的计算方法：第一种，作图法即在细胞生长曲线的对数生长期找出细胞增加一倍所需的时间，即倍增时间。第二种，按照细胞倍增时间计算细胞群体倍增时间。细胞群体倍增时间（PDT）=(t-t0)lg2/(lgNt-lgN0) t0为培养起始时间，t为培养终止时间，N0为培养初始细胞数，Nt培养终止细胞数。 6，成年猪骨髓间充质干细胞的细胞周期及细胞贴比率测定： （1） 细胞贴壁率又称接种存活率。适用于观察贴壁附着生长细胞。主要反映细胞的生存能力（因为只有活细胞才贴壁）和部分第五材料的生物相容性。 方法：首先取对数生长期细胞，用消化法制成细胞悬液，计数后按检测细胞生长曲线的接种细胞原则接种培养瓶（浓度要相对较高）一般接种12-15瓶。 其次，每2h取出一瓶细胞，倒掉培养液（其中含有未贴附细胞）。然后加入胰酶消化已贴壁细胞，计数已贴壁细胞，用下面的公式诸葛计算每个时间组的贴壁率。一般观察24h,分12次进行。 贴壁率%（接种存活率）=（贴壁存活细胞数/接种细胞数）x 100%.（2）细胞活力的MTT(四唑盐)比色试验检测：四唑盐比色试验是一种检测细胞存活和生长的方法。试验所用的显色剂四唑盐是一种能接受氢原子的燃料，化学名3-（4,5-而甲基噻唑-2）-2,5-二苯基私单做溴盐，商品名是噻唑蓝，简称MTT.活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物（formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。此试验的特点是灵敏度高，重复性好，操作简单，经济，快速，易自动化，无放射性污染。试验材料：MTT溶液， 称取250mgMTT,放入小烧杯中，加50mlPBS(0.1mol/l, PH7.4)在电磁力搅拌机上搅拌30min,用0.22m的微孔滤器除菌，分装。4保存。两周内有效。 含有10%胎牛血清的L-DMEM培养液，0.25%胰蛋白酶，二甲基亚砜（使用分析纯的产品）。 96孔培养板（单层生长的细胞选用平底型培养板，悬浮生长的细胞选用圆底型培养板），可调移液器，吸管，离心管，计数板。CO2培养箱，显微镜，震荡混合仪，酶联免疫检测仪。实验步骤：接种细胞， 用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清的L-DMEM制成单个细胞悬液，以每孔103-104个细胞接种在96孔培养板中，每孔体积200l.培养细胞，将培养板移入CO2培养箱中，37，5%CO2及饱和湿度条件下，培养3-5天。（培养时间取决于实验目的和要求。）呈色， 培养第3-5天后，每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20l，37，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮生长的细胞，需要离心（1000rpm,5min）,然后弃去孔内培养液。每孔加入150l DMSO,震荡10min,使结晶物充分溶解。比色， 选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。注意事项：选择适当的细胞接种浓度。在一般情况下，96孔培养板的一个孔内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后所占面积差异很大，因此，在进行MTT实验前，对每一种细胞都应测其贴壁率，倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线。然后确定实验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止时不致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成的量与细胞数呈良好的线性关系。 避免血清干扰。用含有15%胎牛血清培养液培养细胞时，高浓度的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于实验本底增加，会降低试验敏感性。因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。 设空白对照。与试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔。其他实验步骤保持一样。最后比色时，以空白孔调零。 7，成年猪骨髓间充质干细胞的诱导分化及冻存： （1）诱导向脂肪分化的培养基：L-DMEM培养液，10%胎牛血清，100iu/ml青霉素，100mg/ml链霉素，10g/ml胰岛素（sigma公司），1M地塞米松（sigma公司），0.5mM 1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤（calbiochem公司），100M吲哚美辛。（来自：2002骨髓间充质干细胞的培养与鉴定）（2）诱导向成