水蛭的抗早孕有效成分研究(Ⅰ).doc

水蛭的抗早孕有效成分研究()【关键词】 水蛭摘 要 目的:探索水蛭抗早孕有效成分。方法:通过有机溶剂沉淀方法初步对水蛭水煎剂不同成分进行分离，经蛋白质定性实验、IR和薄层色谱鉴别，并对分离出的各成分进行小鼠抗早孕实验。结果:分离得到的成分() 是一种活性蛋白质，有抗早孕活性。 结论:水蛭中的抗早孕有效成分是一种蛋白质。 关键词 水蛭；抗早孕；有效成分；蛋白质Study on the effective constituents of antiearly pregnancy in Whitmina pigraYANG Jian,WANG Xian, HE yunjiao（Department of Pharmacy，The People Hospital of Wuhan University，Wuhan,Hubei 430060)Abstract Objective: To study the effective constituents of anti-early pregnancy in Whitminia pigra. Methods: The effective constituents in Whitminia pigra decoction were obtained through organic solvent precipitation and characterized by protein qualitative test,IR and TLC.Antiearly pregnancy experiments were conducted in rats. Results:Constituent () obtained from Whitminia pigra decoction was an active protein with antiearly pregnancy activity. Conclusion: The effective constituent of antiearly pregnancy in Whitminia pigra is a kind of active protein.Key words Whitminia pigra;antiearly pregnancy;protein水蛭是传统的中药，本草纲目记载其有破血、逐瘀、通经和堕胎作用。近年对水蛭破血、逐瘀、通经方面成分研究有较多报道1，水蛭素被认为是世界上最强的凝血酶抑制剂，其药效学、药代动力学、临床实验及毒副作用都进行了广泛的研究。目前国内水蛭成分研究还是空白，只有贾氏2等初步探讨过从活水蛭中提取抗凝血物质的方法，张氏1等对干水蛭进行了微量元素和氨基酸的分析3。水蛭水煎剂有较强的抗早孕作用，但至今其抗早孕作用的活性成分仍不清楚。本实验通过对水蛭水煎剂的化学成分进行分离，寻找其抗早孕的有效成分，对这一现象作出合理的解释，为开发新的抗早孕药物打下基础。1 实验材料1.1 药物 水蛭(购于刘有余药材公司,经鉴定为宽体金线蛭Whitminia pigra干燥全体),化学试剂均为分析纯。1.2 仪器 SHZ-D（）型真空泵 (巩仪英峪予华仪器厂)；RE-52C型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；JBZ-14H型磁力搅拌器（上海大中分析仪器厂）。由武汉大学测试中心测定。1.3 实验动物 3035 g成熟未生育的SD小白鼠（武汉大学医学院动物实验中心提供）。2 实验方法与结果 2.1 提取分离称取干燥水蛭200 g，研成细粉，于烧杯中用蒸馏水400 mL煎煮30 min，纱布过滤，合并两次滤液，80 浓缩为100 mL 溶液，离心，弃去沉淀。上清液放置过夜，次日再过滤，得滤液。向滤液中加等体积乙醇，有黑色粘稠沉淀（）析出，分离沉淀用50 mL蒸馏水溶解，抽滤。滤液再用适量乙醇沉淀，沉淀用蒸馏水反复冲洗，抽滤，真空干燥得黑色粉末（）2.4 g。上述滤液放置过夜，次日将上清液浓缩至20 mL，加入等体积丙酮，有淡黄色沉淀析出，抽滤，真空干燥得白色粉末0.76 g()。丙酮沉淀后滤液放置过夜，倾出上清液，加入4倍丙酮，有棕色沉淀析出，抽滤，真空干燥得1.5 g（），滤液放置过夜，将上清液浓缩至50 mL溶液（）。2.2 药理实验32.2.1 抗早孕活性成分筛选取体重3035 g未生育的成熟小鼠，以雌雄21合笼，每天上午做阴道检查。小鼠妊娠成期为20 d左右，15 d为着床期；69 d为妊娠早期；1014 d为妊娠中期；15 d后为妊娠晚期。以发现阴栓为受孕第1 d。于受孕第69 d给药，ip，bid，共1 d。次日观察阴道出血情况，然后尾静脉注射2.5%膀胺兰的生理盐水溶液，10 min后解剖检查子宫染成的着床点，凡无着床点且未出血的为空怀者。空怀者不列为观察范围。实验结果见表1。表1 水蛭不同成分对小鼠早期妊娠的影响略 2.2.2 成分（）抗早孕实验方法同前，选择不同剂量的成分（），对照生理盐水组，作抗早孕实验，实验结果见表2。结果表明该成分的作用随剂量增加而增加，在一定范围内呈剂量依赖性。2.2.3 成分（）急性毒性实验用1822 g小鼠随机分为4组，每组15只，腹腔注射不同剂量的成分（）,剂量按等比级数排列，13 d内观察小鼠死亡数，结果表明：最大剂量组（3.2 g?kg-1，大于40倍有效剂量）仍未出现小鼠死亡,提示该成分安全性很高，LD50目前无法测出，LD50可能大于3.2 g?kg-1。2.3 鉴别实验2.3.1 薄层层析成分检查4层析板的制备：取硅胶H（青岛海洋化工厂）4 g，加3倍体积的0.3%CMC-Na，铺成一块10 cm20 cm薄层板，凉干，105 活化1 h。薄层条件：将、的样品分别用毛细管点样于上述薄层板上,展开剂为(正丁醇冰乙酸水）=3.524.5，显色剂为=0.3%茚三酮正丁醇溶液，于烘箱中105 加热15 min，显紫红色斑点。显三个斑点，Rf值分别为0.78，0.60，046；显一个斑点，Rf值为0.78；显两个斑点，Rf值分别为060，0.46。2.3.2 定性实验2取成分()适量溶于水，分别做茚三酮实验、双缩脲反应结果均为阳性；另外做黄蛋白反应、Millon反应及乙醛酸反应均为阴性。上述结果表明成分（）为蛋白质，另外费林反应结果呈阴性，表明它可能不是糖蛋白。取成分()适量溶于水，作茚三酮实验,结果为阳性；双缩脲反应、黄蛋白反应、Millon反应和乙醛酸反应均成阴性，说明其成分中含两种无酚羟基直链氨基酸。2.3.3 红外光谱分析取适量用KBr压片，在4004000 cm-1扫描，见图1。从图1知，1657 cm-1为酰胺键的特征吸收峰，另有胺基的宽吸收峰，符合蛋白质的结构特点。图1 成分的红外图谱略3 讨论与小结本实验通过对水蛭水煎剂进行分离得到具有抗早孕活性的成分（），其含有（）和（），因（）水溶性较（）好，易溶于水，因而经过进一步分离从中得到成分（）。成分（）经定性实验证明为氨基酸混合物，抗早孕实验证实它无抗早孕作用。成分（）可初步确定为一蛋白质，其结构、氨基酸排列顺序，分子量等有待进一步研究认证。本研究已初步确认了成分（）的抗早孕作用，至于其对妊娠中期及晚期作用如何，以及作用机理，有待今后工作进一步研究。目前，临床上的抗早孕药物较少，且大都有一定的毒副作用。我们对水蛭中抗早孕有效成分的研究，分离得到的单体成分（）具有较强的抗早孕作用，而且其安全范围较大、治疗指数较高,有希望成为一种理想的抗早孕药物，有很好的研究开发前景。参考文献1 吕文海，王琦. 中药水蛭现代研究J. 中国中药杂志，1994，19（12）：755.2 郭义明，胡於鲁，王庭力. 水蛭有效成