不定根发生机制.doc

1.2.3 不定根发生机制的研究现状和发展趋势。 不定根发生机制的研究最早从形态学观察开始，随着显微技术的不断改进，人们逐步的了解了根在细胞水平的发生过程。同时生长素作用的发现及作用机制深入的研究，为从生理生化水平开展不定根发生机制的研究提供了理论依据。20世纪末特别是近年来，植物分子生物技术的发展和应用，又为其提供了新的研究手段，对不定根发生机制的认识深入到分子及基因水平。 1.2.3.1 不定根发生的解剖学研究。 不定根是植物按非正常的时序发生且发生部位不定的根，多发生于茎杆、叶子或老根等器官。多半是因为植物的器官或组织受到伤害、激素或病原微生物等刺激，而由根原始体经过细胞分裂、分化发育为根原基，再由根原基发育而成。大量研究表明，不定根发源于插穗内一些变成分生组织的细胞群，即根原始体。不定根的根原始体有“潜伏根原始体”和“诱发根原始体”6。潜伏根原始体在插条发育的早期未离体时，就已经产生，即在采条时已经存在。扦插前，它一直处于休眠状态，直至插穗离体后，在适宜的条件下才解除休眠，继续发育成根原基和不定根。潜伏根原始体多产于维管系统内的韧皮组织、形成层或髓射线中，芽隙、枝隙或叶隙常常是它的发生部位。而植物的插条扦插后才分化而成的根原始体，称为“诱发根原始体”，多产生于插穗下端0.10.3 mm 范围内，从维管形成层、韧皮薄壁组织细胞、韧皮射线、髓射线及其复合组织等部位都可产生诱发根原始体,也可在愈伤组织中产生。不定根形成的一个关键阶段是根原基的形成。Jarvis7等(1986)将不定根形成过程分为促进期、起始早期、起始晚期和生长分化期四个阶段。潘瑞炽认为不定根形成的步骤大致如下:薄壁细胞或维管束间细胞经过脱分化，形成潜在的根原始点，经过刺激开始细胞分裂，细胞增大，形成形成层，进一步形成根原基，根原基形成维管束并连接起来，生长，不定根露出表皮(潘瑞炽8，1998)。李小方9（2001）等将不定根原基分为3类，即形成于原位的根原基，向着插条基部但不是在原初细胞分裂点处形成的根原基和形成于基部愈伤组织的根原基。后两种情况根发生的最初解剖学事件之前需要细胞分裂。根原基发生于原位的情况，已经定义了4个明显的阶段：、新的分生组织位置的诱导； 、最初的细胞分裂；、后期细胞分裂形成有组织的根原基（分生组织）；、通过分生组织产生细胞并进行伸长生长完成根的发育。肖尊安等10 (2002)则将不定根的形成过程分为五个时期:脱分化期、诱导期、细胞分裂成类分生组织期、根原基形成期和根伸长期，认为各期时间随植物而异。不定根按其形成部位可分为皮层生根型、愈伤组织生根型和混合生根型三大类。皮层生根型表现在不定根由插穗皮层、形成层、韧皮部、木质部等处产生根原基;愈伤组织生根型表现在不定根从插穗切口处愈伤组织内产生;混合生根型表现在皮层和愈伤组织内都可以产生不定根(杨青珍等11，2006)。关于不定根发生机制的研究，多针对于扦插生根的研究，而其发生机理同样适用于压条繁殖，包括高压繁殖。1.2.3.2 不定根发生机制的生理生化水平的研究。 1.2.3.2.1 内源激素水平与不定根的发生。 一.生长素与不定根形成关系。 关于生长素与不定根发生的研究很多，结果不一，但大多数的研究表明：根形成阶段需要较高浓度的内源IAA。不定根形成过程中内源IAA变化规律为：插条离体后内源IAA含量降低，根原基形成阶段内源IAA含量上升，根的伸长阶段内源IAA含量又下降。徐继忠和陈四维12发现在桃硬枝插穗愈伤组织的根原基形成过程中，内源IAA含量先下降，随后上升，在不定根突出表皮前，内源IAA含量上升到高峰，根突出后又下降。在Maldinye(1986) 13等用番茄下胚轴进行的组培试验以及詹亚光14等的白桦大树伐根萌条扦插试验和秦新民15的白花泡桐茎切断组培试验中都发现内源IAA含量的升高与不定根原基的诱导几乎同时发生。此外张晓平16（2004）和迟彦17（2007）分别在杂交鹅掌揪夏季扦插过程中和测定芽变毛白杨及其亲缘种扦插生根过程中发现了IAA含量在不定根的促进期及表达期一直处于上升趋势。 虽然根形成阶段伴随着较高浓度的IAA，但并不能说明内源IAA是影响根发生的唯一因素，另有一些研究发现内源IAA与不定根发生能力之间并非成简单的正相关关系。Isabel18 (1996)和谈宏鹤 19(2000)分别在研究胡桃树胚的三种不同材料（即子叶、子叶与胚轴连接区、胚轴 ） 以及甘蓝下胚轴不同切段的生根能力与内源IAA水平的关系时均发现，内源IAA水平与生根能力呈负相关或非正相关。在上述试验中，材料或取材部位不同，而仅分析内源IAA和生根能力关系，得出内源IAA水平与生根能力呈负相关或非正相关的关系。分析原因可能是较高水平的生长素对根的形成有抑制作用，内源IAA只在一定浓度范围内才与根的形成成正相关。但试验本身存在问题，IAA并非影响不定根发生的唯一因素，不同的材料和部位本身就存在着对诱导生根的刺激或信号的感受力和生根能力的差异，试验中生根能力差异很可能受到其他因子影响。 还有一些研究表明：生根率最高的无性系在扦插前IAA质量分数最低，在扦插过程中也维持低水平状态，说明IAA在扦插过程中对生根不起主要作用，只是起协同作用 (刘桂丰等20，2001)。对于不同植物，内源IAA所起作用大小可能不同，但是此研究也表明了内源IAA并非影响植物不定根发生的唯一因素。此外，最近有些研究显示通过施用外源激素，改变了不定根形成过程的内源IAA变化规律，但对不定根形成起到了促进作用。刘明国21等在研究北美香柏插穗生根过程中内源激素变化时，就发现了经过外源激素处理的插穗，在扦插后13天即不定根的诱导期，IAA含量出现峰值，在表达期下降，随后根原基逐渐伸出插穗，IAA含量又逐渐升高，而不施用外源激素的插条，生根过程中内源IAA变化符合一般的先升高后下降的规律。文中虽然没有对这个现象进行分析，但其出现表明了单从植物不定根发生过程中内源激素变化来确定不定根发生过程中各个时期内源激素与根形成的关系，其结果有不确定性。不定根伸长阶段，升高的内源IAA水平对根的形成没有起到抑制作用，甚至促进了根的伸长生长。其原因可能是插穗对内源IAA感受力低或内源IAA的水平未达到抑制生根的水平。也有可能影响插穗不定根发生的其他因子产生正作用大于内源IAA升高的负作用，表现出了根伸长期IAA升高，不定根易发生的假象。 二细胞分裂素与不定根形成关系。 相对于生长素来讲，细胞分裂素与不定根形成的关系研究的较少。一般认为，生根只需要较低的CTK水平，高浓度的细胞分裂素抑制不定根的形成。不定根形成过程中细胞分裂素的变化过程在不同的研究中结果相差很大，没有确定的研究结果。 一些研究发现根的起始早期，细胞分裂素水平很低，一旦根原基形成，含量则增加。如Bollmark22等(1986)发现，光下豌豆茎的基部，在根的起始早期，细胞分裂素水平低，一旦根原基形成，含量则增加，可能是满足活跃的细胞分裂的需要。徐志平23(2002)测定了绿豆下胚轴插条基部的CTK水平变化并发现根系切除后的第1天，ZR(细胞分裂素玉米素核昔)成分含量降低，当根原基形成后，ZR含量急剧增加，认为ZR对根原基的发生没有明显的作用，但在根原基的进一步生长发育阶段中可能发挥着重要作用。林士杰等24（2006）在研究黑林1号杨组培叶片不定根发生时，发现不定根发生过程中，ZR变化规律和徐志平等上述研究结果一致。但是另一些研究表明，细胞分裂素的含量和根原基发生同步，根原基的形成达到高峰期时，细胞分裂素含量也达到最高水平，以后明显下降。秦新民15等（1995）的白花泡桐组培实验和詹亚光14等（2001）的白桦扦插实验都有此方面的相关报道。此外刘桂丰20(2001)在落叶松杂种扦插试验中发现，在生根率较高的无性系插穗生根过程中，ZR的含量始终比生根率中等和生根率低的两组无性系的含量高，并且认为对插穗生根起主要作用。 三脱落酸与不定根形成关系。 ABA对不定根形成的影响，因植物种类和取材部位的不同而异，关于这方面研究很多，但研究结果却不一致，有些研究表明ABA抑制不定根的形成；郭素娟等25（2004）在白皮松插穗生根的生理生化试验中分析了ABA含量与不定根发生关系，得出ABA含量与生根率成负相关。于雪飞等26（2009）研究中美山杨组培生根过程激素变化时，发现初始的ABA含量与生根率成反比，影响着试管苗不定根形成，并且在根原基形成过程中ABA浓度均不断降低，待不定根生成后其含量在各无性系表现不同。有些研究表明ABA促进根的发生；林士杰等24（2006）在研究黑林1号杨组培叶片不定根发生时，发现在整个不定根形成的过程中，内源ABA对不定根的形成是有利的，根原基的启动分化阶段与较高浓度的ABA相伴随，根原基的生长发育阶段与更高的ABA水平相关。还有些研究表明ABA对不定根的发生与其浓度有关 (徐志平25，2002;王金祥27，2002)；关于不定根发生过程中ABA变化，大多数研究认为ABA水平与IAA水平是此消彼长的关系。在根原基诱导期含量下降，在表达期含量上升。但是也有报道ABA含量在整个生根期持续下降。如桃硬枝插条的生根期间，ABA含量持续下降(徐继忠12，1989)；白花泡桐组培成年型材料中内源ABA呈逐步下降趋势(秦新民15等，1995)；易生根的芽变毛白杨、大官杨和难生根的普通毛白杨，其在扦插期间的ABA含量均呈下降趋势(迟彦17，2007)。 四 赤霉素与不定根形成关系。 多数的研究表明赤霉素抑制插条不定根的形成，尤其是抑制根原基的发生。Maldiney13(1986)在番茄生根试验中发现根原基的形成初期，高水平的GA抑制根原基的细胞分裂，阻碍根原基的形成。肖关丽28等(2001)对甘蔗继代培养绿苗中的内源激素进行测定分析，认为GA1/3与生根率呈显著的负相关。黑林1号杨组培叶片不定根的发生与内、外源激素关系的研究（刘世杰24等，2006）表明在不定根的整个形成过程中，低含量的GA3有利于不定根的发生。芽变毛白杨及其亲缘种扦插生根过程中内源激素含量的动态变化的研究（迟彦17等，2007）表明GA3抑制了毛白杨以及其亲缘种的插条不定根原基的发生。但另有很少的研究表明，对于一些植物，赤霉素不是影响不定根发生的主要因素或者它与不定根发生关系甚微25、26。 五乙烯与不定根形成的关系。通过施用外源乙烯或分析不定根发生过程中内源乙烯变化规律，现在的研究认为乙烯对不定根的作用表现为3个方面：（1）、乙烯可以促进不定根的发生；（2）、乙烯抑制不定根的发生；（3）、施用外源乙烯对不定根的发生不起作用，分析原因可能是乙烯对特定的一些植物不定根发生不起作用，也可能因为植物内源乙烯已满足不定根发生的需要。也有研究对不定根发生中乙烯表现的不同作用进行了分析，认为乙烯促进不定根发生可能有以下几个方面：（1）、插条对乙烯的敏感性是不定根形成的一个必要条件；（2）、乙烯通过增加生根组织对生长素的敏感性而不是通过改变内源生长素的含量而促进根生长；（3）、乙烯促进细胞周期蛋白基因的表达而促进不定根的发生；（4）、乙烯促进细胞分裂素类物质分解而促进生根。乙烯抑制生根可能是能促进生长素分解、延缓生长素的合成或抑制生长素极性运输而抑制生根。六IAA/ ABA、IAA/CTK、ABA/GA与不定根形成的关系。 随着不定根发生过程中内源激素变化的研究的发展，发现了单一的某种激素有时候与不定根发生的关系不明确，或者相同的内源激素对不同植物或材料不定根的发生表现出不同甚至相反的作用。但是越来越多的研究发现IAA/ ABA、IAA/CTK、ABA/GA与不定根形成的关系比较稳定。一般的研究都表明IAA/ABA比值高，生根率高，反之生根率低。郭素娟等25在研究白皮松插穗生根的生理生化基础时，发现单一的某种激素对白皮松插穗生根没有显著的影响，白皮松插穗能否生根主要受IAA/ABA以及总糖/总氮的影响，比值越大越有利于生根。陈雪梅29等认为IAA/ABA比值高有利于银白杨、毛白杨、山杨插穗生根。由于植物体内存在着多种激素，因而，决定生理效应的往往不是某种激素的绝对量，而是各激素间的相对含量，生根时期内源激素的动力学变化比特定时期的含量更为重要(肖尊安等10，2002)。在组织培养中生长素与细胞分裂素不同的比值影响根芽的分化。烟草茎髓部愈伤组织的培养实验证明，当细胞分裂素与生长素的比例高时，愈伤组织就分化出芽；比例低时，有利于分化出根；当二者比例处于中间水平，愈伤组织只生长而不分化，这种效应已被广泛应用于组织培养中(张昉30，2006)。关于IAA/CTK的研究，大多数认为根原基形成前比值高，出现后比值低，二者协调调控根原基的发育，根原基诱导期比值高的植物品种易生根。关于不定根发生过程中的ABA/GA的研究，认为较高水平的ABA/GA3有利于根原基形成的启动分化和不定根的生长发育（冯昕31，2004）。不定根发生是一个多种激素多种因子调控的复杂的过程，在其他因子影响不能确定的情况下，只从单激素或两种激素比列来研究激素与不定根发生的关系，注定了研究结果只能作为一般规律而具有不确定性，控制不定根发生过程中单一因素的变化，来研究不定根发生过程有利于阐明该因素与不定根发生的关系，而研究多种不同激素在不定根发生过程中的相互关系是研究重点和突破对不定根发生机制实质性认识的必由之路，并且便于为难生根树种无性繁殖的工作提供基础理论。 1.2.3.2.2不定根发生机制的酶调节研究。 不定根形成的过程是一系列的复杂的生理生化过程的复合体，不定根形成过程必然发生细胞分裂和分化，也必然受到酶调节。国内外很多研究已经发现了一些与不定根发生关系比较密切的酶。其中研究的比较多和受到重视的酶有过氧化物酶、IAA氧化酶、多酚氧化酶等。一不定根形成与过氧化物酶关系。不定根形成与过氧化物酶关系的研究相对较多，但研究结果却不一致。目前关于过氧化物酶与不定根形成关系主要有以下两种说法：（一）、不定根形成过程中，过氧化物酶活性升高；Kieliszew32(1989)发现黑松苗的胚用生长素处理后，随着生根的进程，POD的活性升高。蒋小满33（1998）以“艾西丝”南瓜组培苗为试验材料，发现其不定根形成前，POD活性处在较低的水平，而当不定根形成时，POD活性迅速升高，以后一直维持在较高水平。Tohit GUNES34测定了黑杨、银白杨、欧洲山杨在扦插生根过程中过氧化物酶和IAA氧化酶活性的动态变化，发现尽管3个树种的插穗生根能力不同，但在根发生或根原基形成过程中，过氧化物酶活性均上升，但没有发现过氧化物酶活性和生根能力有显著的相关性，因此认为过氧化物酶活性不影响插穗生根能力和生根率，但对细胞分裂起作用。（二）、不定根发生过程，POD活性下降，难生根植物具有较高的POD活性，POD抑制不定根发生。黄卓烈等（2002）用NAA35或IBA36处理桉树插条后，发现难生根的品种的POD活性比易生根的品种POD活性高。于亚军37（2005）也发现，难生根的芽变毛白杨插条内的POD活性比易生根的高，芽变毛白杨组培苗在生根过程中总体呈下降趋势。以上研究如果不考虑其他因素对不定根的影响，或者认为POD活性为主要影响因子的话，可以表明高浓度POD抑制了不定根发生。二不定根形成和IAA氧化酶关系。 IAA氧化酶与IAA关系密切，多数研究表明它通过降解IAA，调节IAA在植物体内的水平，进而影响植物的生长发育。有的研究表明难生根植物体内IAA氧化酶活性高，IAA水平低38，在不定根的形成期间体内IAA氧化酶活性下降，而IAA含量上升39。但有些更为深入的研究发现IAA氧化酶的活性在根形成过程中并非成简单的下降趋势，都存在一个上升的阶段，尽管在不同研究这个上升阶段所对应的不定根形成期不同。黄卓烈等40(2002)用不同生长素对按树无性系插条进行处理后发现，在生根的愈伤组织促进阶段，IAAO活性均大幅度上升，到了不定根形成期，酶活性上升速度放慢，甚至稍有下降，到新根伸长期，各酶活性又上升。在光叶褚扦插生根过程中，愈伤组织形成期IAAO活性呈上升趋势，不定根促进期达到高峰，而根伸长期IAAO下降(宋丽红等41，2005)。另外Tohit GUNES34 测定了黑杨、银白杨、欧洲山杨在扦插生根过程中的过氧化物酶和IAA氧化酶的活性，发现IAA氧化酶在根发生和根原基形成期具有活性，在未生根的欧洲山杨中则无活性，由此推测IAA氧化酶与插穗生根有关，并且可以通过IAA分解来影响根的形成，即在根的形成期IAA氧化产物会促进不定根的形成。三、多酚氧化酶与不定根形成关系。 高等植物中普遍存在多酚氧化酶，这种酶不仅在植物生长、发育中起重要的作用，而且对不定根的形成十分重要（黄卓烈等42，2003）。现在大多研究都认为多酚氧化酶促进不定根的发生，尤其是影响根原基的形成和生长。Albarazi43等(1984)研究发现，多酚氧化酶主要分布在不定根起源部位的附近。Upadhyaya44等(1986)用多效唑处理菜豆的插条，发现在其生根量大大增高的同时，体内多酚氧化酶活性也大幅提升。Bhattacharya等39（1989）曾证明多酚氧化酶催化生长素代谢，促进不定根的起源和发育。Hayrullah YILMAZ45等22研究了葡萄的3个品种(Vitis vinifera L.cvs. Musca, t Cardinal and Perlelte) 插穗生根过程中多酚氧化酶 (Polyphenol oxidase)活性的动态变化，Muscat和Perlelte两个品种在扦插第30 d出现根原基，第35 d不定根发生，这期间多酚氧化酶的活性与根形成呈正相关关系，根形成后多酚氧化酶活性持续下降。Cardinal品种生根慢，第75 d才有不定根发生,在另外两个品种不定根发生前，Cardinal多酚氧化酶活性始终较低，Hayrullah YILMAZ等结合前人的研究结果分析认为，多酚氧化酶影响细胞分裂、分化及根原基的形成和生长。 1.2.3.2.3不定根发生机制的多胺水平的研究。 对多胺与不定根发生的关系，国外研究的比较多。从目前的研究来看，不同种类的多胺对不定根发生产生不同的影响。一些研究表明在诱导不定根阶段，腐胺浓度会上升一段时期，而在根出现阶段，多胺浓度降低，并且认为腐胺和不定根诱导密切相关，腐胺的分解也有利于根的形成和伸长。但另有些研究表明，使用外源多胺并没有促进不定根发生，反而抑制了不定根的发生。RaAnanFriedman46等研究了几种多胺及其前体生化物(precursor)和一些代谢抑制物(metabolic inhibitor)对绿豆胚轴不定根发生的影响，结果使用外源多胺并未促进不定根的发生：L-刀豆氨酸(L-canavanine)和L-刀豆酸(Lcanaline)抑制了根的发生，而L-精氨酸(L-arginine)和L-鸟氨酸(L-ornithine)则能削弱这些抑制作用；作为S腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase)与多胺生物合成产物的丙脒腙(Methylglyoxalbis),也对根的发生具抑制作用。关于不定根发生过程中多胺变化与外源IBA关系也有不一致的结果。有些研究人为IBA不影响不定根发生过程腐胺变化。有些研究结果表明多胺的变化是由IBA浓度和物种不同而定。不定根发生过程是一个多因子影响过程，单考虑其中一个或几个因子必然为研究结果带来不确定性，其结果只能作为一般规律去认识。 1.2.3.2.4 营养物质与不定根发生关系。 植物生命活动需要能量，能量代谢是不定根发生过程所必需的，关于不定根发生过程中营养物质变化，尤其是糖类物质和C/N的研究很多。郭素娟等25的白皮松插穗生根的生理生化研究表明，总糖、总氮以及C/N与不定根发生均呈正相关，其中总糖和C/N与不定根发生的关系更为密切。Kromer等47在苹果砧木M7无菌苗茎段生根过程中观察到葡萄糖、果糖、山梨醇、肌醇升高。生根诱导期的前10天可溶性糖水平升高与茎基部细胞分裂旺盛一致，并发现果糖含量与生根能力密切相关。在根原基分化和根伸长期，可溶性糖恢复到原有的水平，同时也观察到根原基形成时可溶性蛋白质和酯类化合物略有升高。Thomas48报道，葡萄砧木插条的叶面积、重量和着生位置影响根的发生和发育，带小叶的插条在诱导培养基上不定根出现迟，且根质量差,茎生长弱和芽早期萌发；而带大叶的插条相反，不定根发生早，根活力强，茎生长健壮和芽无早期萌发。生根1月后，根鲜重与原插条上的叶鲜重、叶面积和插条总鲜重显著相关。并且Thomas49比较了4种插条即无叶柄和叶、无叶、带叶柄和部分叶以及带叶柄和全叶的生根诱导差异。在无生长素和蔗糖的培养基上，有叶插条能为生根提供生长素和蔗糖;但是在较高生长素IAA、蔗糖和右旋葡萄糖的培养基上无叶插条的生根率和茎生长仍然低于带叶柄和全部叶的插条，说明叶片具有产生其它生根因子的作用，生根过程是多因子作用的结果。 1.2.3.2.5 不定根发生机制生理生化水平研究的总结和分析。 现在关于不定根发生机制的生理生