糖基化终产物对人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子mRNA及蛋白表达的影响.doc

糖基化终产物对人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子mRNA及蛋白表达的影响【摘要】目的研究糖基化终产物(AGEs)对人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子(VEGF)mRNA及蛋白表达的影响，探讨AGEs在糖尿病动脉粥样硬化中的作用。方法将人脐静脉内皮细胞株ECV304用BSA及不同浓度的AGEs孵育24 h及400 mg/L的AGEs孵育0、12、24及36 h，采用原位杂交及Western blot方法检测VEGFmRNA及蛋白的表达。 结果人脐静脉内皮细胞在100、200及400 mg/L AGEs孵育24 h后，VEGF mRNA及蛋白表达均显著高于BSA对照组(P005)，在用400 mg/L AGEs分别孵育12、24及36 h后，各组内皮细胞VEGFmRNA及蛋白表达量也明显高于0 h对照组(P005)。结论AGEs可增加人脐静脉内皮细胞VEGFmRNA及蛋白的表达，且与浓度和时间呈正相关。 【关键词】 糖基化终产物；人脐静脉内皮细胞；血管内皮生长因子；动脉粥样硬化大血管病变是2型糖尿病患者主要致残、致死的原因，其病理基础是动脉粥样硬化(AS)形成1，其确切机制不详。终末糖基化终产物(AGEs)是生物胺与还原糖在无酶条件下经复杂的重排、脱水及缩合而成的不可逆的共价产物，研究证实糖尿病动物及患者体内有大量AGEs堆积。血管内皮生长因子(VEGF)是目前已知最强、最主要的诱导血管发生的生长因子，在AS的形成中起着重要的作用。它除了通过诱导内膜微血管形成而参与AS损伤以外，还可通过改变内皮通透性及其表面黏附分子的表达、诱导单核细胞趋化迁移等多种途经促进AS的形成2。本研究以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)为实验对象，采用原位杂交和Western blot从AGEs对人脐静脉内皮细胞VEGF mRNA及蛋白表达的影响角度探讨AGEs在糖尿病AS中的作用。1 材料与方法11 材料 人脐静脉内皮细胞株ECV304(中科院上海细胞所)，1640培养基(GIBCO)，新生牛血清(郑州)，VEGF原位杂交试剂盒、兔抗VEGF抗体、DAB显色试剂盒(武汉博士德)，DAPDH(上海康成)，胰蛋白酶、D葡萄糖、牛血清白蛋白(BSA)(华美)。12 AGEs的制备 参照Horiuchi等3的方法将16 g BSA与30 g D葡萄糖溶于10 ml 05 mol/L(pH 74)PBS中，022 μm微孔膜滤过除菌，37孵育90 d，然后用05 mol/L(pH 74)PBS透析去除未结合的葡萄糖。对照组中BSA中不含葡萄糖，余条件一致。本实验制备的AGEBSA经荧光分光光度计鉴定，其AGEs含量为872 kU/g，对照组为21 kU/g。13 细胞培养及分组 人脐静脉内皮细胞ECV304用RPMI 1640+10%56灭活的新生牛血清，于37、5%CO2的条件下培养，隔天换液。将传代的ECV304内皮细胞调整细胞数在1×108L-1，每孔2 ml接种于预先放置有灭菌盖玻片的6孔培养板中培养，每隔1 d换液1次，细胞生长至融合状态后，无血清培养液饥饿24 h，然后随机分为实验组和对照组。实验组又分为两组：不同浓度组分别于含100、200及400 mg/L AGEs的无血清培养液培养24 h，不同孵育时间组于400 mg/L AGEs的无血清培养液分别培养0、12、24及36 h；对照组加含未修饰BSA的无血清培养液培养。所有实验均重复3次。14 原位杂交 杂交所用探针序列为5′GCTCT ACCTC CACCA TGCCA AGTGG TCCCA3′。按照VEGF原位杂交检测试剂盒使用说明书进行操作。将培养于盖玻片的各组内皮细胞用01 mol/L PBS(pH 74)洗2 min×3次，用4%多聚甲醛01 MPBS(pH 7274)，含有1/1 000 DEPC，室温固定20 min。新鲜配制05%H2O2/甲醇室温处理30 min。3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶室温消化60 s。37预杂交液4 h，37杂交过夜。以2×SSC、05×SSC及02×SSC洗片，封闭液37封闭30 min，生物素化过氧化物酶37孵育20 min，SABC 37孵育20 min，DAB显色，苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明，封片。镜下观察，并采用Metamorph/DP10型细胞图像分析仪进行VEGF mRNA的半定量分析，阴性对照用预杂交液替代探针工作液。15 Western blot 于不同时间点收集细胞，加细胞裂解液，4裂解1 h，415 000 r/min离心30 min，提取上清并测定蛋白。每个样品取50 μg用15%SDSPAGE电泳转移至硝酸纤维素膜上。用5%脱脂奶粉封闭1 h后，分别加入兔抗VEGF及鼠抗GAPDH一抗(稀释浓度分别为1300及15 000)，常温下过夜，用TTBS洗涤后，加入二抗常温下作用2 h(稀释浓度为1500)，显色后用GDS8000成像分析仪照像并定量。用各样品与其内参照GAPDH的比值代表其蛋白的相对水平。16 统计学处理 计量数据以xs表示，采用SPSS100统计软件中的SNK检验和单因素方差分析进行统计学处理。2 结果21 人脐静脉内皮细胞VEGF mRNA的表达 VEGF mRNA主要分布在胞浆中，为棕黄色颗粒。各组内皮细胞中VEGF mRNA的表达量见表1及表2。100、200、400 mg/L AGEs 孵育24 h后显著增加 VEGF mRNA的表达；400 mg/L AGEs孵育0、12、24及36 h后，内皮细胞中VEGF mRNA的表达也明显增高。AGEs以时间及浓度依赖性促进内皮细胞VEGF mRNA的表达(P005)(图1、图2)。图1 不同浓度AGEs孵育24 h后各组内皮细胞中VEGF mRNA的表达(×400)（略）图2 400 mg/L AGEs孵育0、12、24及36 h后各组内皮细胞中VEGF mRNA的表达(×400)（略）22 人脐静脉内皮细胞VEGF蛋白的表达 Western blot图像经用Gelworks 1D软件分析后，人脐静脉内皮细胞在100、200及400 mg/L AGEs孵育24 h后，各组VEGF蛋白的表达量逐渐增高，分别为BSA组的141倍、196倍及255倍(P005，图3)；400 mg/L AGEs孵育0、12、24及36 h后，各组VEGF蛋白的表达量也明显增高，分别为0 h组的191、282及347倍(P005，图4)。上述结果显示，AGEs以时间及浓度依赖性促进人脐静脉内皮细胞VEGF蛋白的表达。表1 不同浓度AGEs孵育24 h后各组内皮细胞中VEGF mRNA的表达（略）与BSA组比：1)P005；与100 mg/LAGEs组比：2)P005；与200 mg/LAGEs组比：3)P005表2 400 mg/L AGEs孵育0、12、24及36 h后各组内皮细胞中VEGF mRNA的表达（略）与0 h组比：1)P005；与12 h组比：2)P005；与24 h组比：3)P005A从左至右为BSA对照组及100、200、400 mg/L AGEs组;B为相应GAPDH内参照图3 不同浓度AGEs孵育24 h后各组内皮细胞中VEGF蛋白的表达（略）A从左至右为400 mg/L AGEs孵育0、12、24及36 h组;B为相应GAPDH内参照图4 400 mg/L AGEs孵育0、12、24 h及36 h后各组内皮细胞中VEGF蛋白的表达（略）3 讨论 研究表明，糖尿病性AS与血管内皮损伤、内皮依赖性舒张功能障碍、血凝纤溶失衡与血小板高敏感性导致血栓形成、以及内皮下基质产生与构成紊乱等内皮功能障碍、平滑肌细胞增生、氧化应激增加等因素密切相关4。近来，对各种细胞因子在AS发生发展中的作用开展了大量的研究，其中VEGF备受注目。VEGF是最强、最主要的血管生成因子，它通过与血管内皮的特异性受体结合，具有强大的促内皮增强，促血管生成作用。研究表明，VEGF在AS的形成中起着重要作用。Chen等5应用原位免疫组织化学方法研究证实，在AS斑块中，平滑肌细胞及巨噬细胞中都有VEGF的强表达，VEGF阳性细胞数目与内膜血管化程度呈正相关，且VEGF阳性细胞数目的分布与新生血管的分布高度一致，即主要位于斑块肩部与纤维帽部位。除缺氧外，几乎所有参于AS发生发展的生长因子和细胞因子都能上调平滑肌细胞、巨噬细胞和其他细胞中VEGF的表达。VEGF是目前已知最强最主要的诱导血管发生的生长因子，能诱导其他促进血管发生的细胞因子表达增强及表达VEGF受体的单核细胞的迁移，这在AS的发生、发展中具有十分重要的意义。Moulton等6研究发现应用抑制血管发生的药物TNP470和endostatin(内皮抑素)作用于载脂蛋白E/小鼠，结果斑块部位的血管发生受到明显的抑制，斑块的体积也随之缩小，但血液中胆固醇水平无变化。对照组的斑块中血管发生和斑块体积无明显改变，提示血管发生直接参与AS。 糖尿病患者发生AS危险性较正常人增加34倍，内皮细胞损伤是AS发生的始动因素。研究表明高血糖可损伤血管内皮，且血糖控制越差、病程越长者，内皮细胞损伤越严重。本实验以长期高血糖状态下蛋白质非酶糖化形成的AGEs为干预因素，模拟人体病理状态AGEs的浓度等。结果显示：(1)AGEs能刺激培养的人脐静脉内皮细胞表达VEGF增多，原位杂交结果显示VEGF mRNA增多，而Western blot结果显示其表达的蛋白也增多，说明AGEs能在分子生物学水平上促进人脐静脉内皮细胞内VEGF的表达。(2)AGEs的这种刺激作用与人脐静脉内皮细胞暴露于AGEs的时间及浓度呈正相关。因此，可以推测AGEs可能通过刺激人脐静脉内皮细胞表达VEGF等多种细胞因子及趋化因子等，介导内皮和基底膜损伤，促进单核细胞、淋巴细胞与内皮细胞的相互作用并迁移至内皮下间隙从而导致AS病变的发生和发展。这在一定程度上对糖尿病者易患AS的机制提供了可能的解释，也提示临床上如能有效控制体内血糖和 AGEs水平，开发出有效减少 VEGF mRNA及蛋白表达的药物，则可能有助于防治AS。【参考文献】 1American Diabetes AssociationScreening for type 2 diabetesJDiabetes Care，2000;23:s2032Celletti FL，Waugh JM，Amabile PG，et alVascular endothelial growth factor enhances atherosclerotic plaque progressionJ，Nat Med，2001;7(4):42593Horiuchi S，Araki N，Morino YImmunochemical approach to characterize advanced glycation end products of Maillard reactionJJ Biol Chem，1991;266:7329324Schror KBlood vessel wall interactions in diabetesJDiabetes，1997;suppl 2:11575Chen YX，Nakashima Y，Tanaka K，et alImmunohistochemical expression of vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor in atherosclerotic intimas of human coronary artrriesJA