（药物化学专业论文）酿酒酵母rck2蛋白的结构与功能研究.pdf

中文摘要 酿酒酵母s c r c k 2 是一个s 咖类蛋白激酶 作用于h o g 途径的下游 被 h o g l m a pk i n a s e 磷酸化而激活 在r c k 2 蛋白c 末端存在着一个h o g l 结合位点 t i l q r s 的r 5 9 0 k k v q r 5 8 9 a r 5 9 0 圾点突变无法介导m a p k kp b s 2 p 叻所引起 的致死作用 r c k 2 pc 末端1 2 3 个氨基酸残基包含激酶活性自主抑制序列 故缺 失该1 2 3 个氨基酸残基可以介导p b s 2 p 肋所引起的致死作用 同时缺失该段氨基 酸残基会抑 1 j r c k 2 p 在过量表达情况下的降解 为了进一步确定激酶活性自主抑 制序列的功能区域 我们构建了c 末端分别缺失2 7 6 0 和9 0 个氨基酸残基的突 变体s c r c k 2 p a 2 7 a a s c r c k 2 p a 6 0 a a 和s c r c k 2 p a 9 0 a a 将这些突变体分别与 p g a l p b s 2 d d 共转化至 j r c k 2 缺失菌株中 发现s c r c k 2 2 7 a a 无法介导m a p k k p b s 2 p 叻所引起的细胞致死作用 说明c 末端2 7 个氨基酸残基并未包含激酶活性 自主抑制序列 突变体蛋白过量表达结果表明 s c r c k 2 p a 6 0 a a 在过量表达情况 下发生降解 说明控s t j s c g c k 2 降解的功能区域存在于c 末端第6 0 个氨基酸残基 和第1 2 3 个氨基酸残基之间 关键词 酿酒酵母r c k 2 蛋白h o gm a p kp b s 2 d d a b s t r a c t r c k 2i sam i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e m a p k a c t i v a t e ds e r t h rp r o t e i n k i n a s e w h i c ha c t sd o w n s t r e a mo fh o gm a p kp a t h w a y i ti sp h o s p h o r y l a t e da n d a c t i v a t e db yh o g li ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e r c k 2 pc o n t a i n sam a pk i n a s e d o c k i n gs i t e t i l q r 5 8 9 r 5 9 0 k k v q li ni t sc t e r m i n a ls e g m e n t t h er c k 2d o u b l e m u t a n tr 5 8 9 a r 5 9 0 ae x p r e s s e df r o mac e n t r o m e r i cp l a s m i dw a sf u n c t i o n a l l y i n a c t i v ei nm e d i a t i n gt h et o x i ce f f e c to fp b s 2 p d d t h er c k 2d e l e t i o nm u t a n tl a c k i n ga c t e r m i n a l1 2 3a n l i n oa c i d sc o n t a i n i n gt h e d o c k i n gs i t eh a sc o n s t i t u t i v ek i n a s e a c t i v i t ya n dc o u l dn o ts u p p r e s st h et o x i ce f f e c to fp b s 2 p d d i na d d i t i o n m l n c a t i o no f t h ec t e r m i n a l12 3a m i n oa c i d sp r e v e n t st h er c l 2p r o t e i nf r o md e g r a d a t i o nw h e ni ti s o v e re x p r e s s e di ny e a s tc e i l s i no r d e rt od e f i n i t et h ep o s i t i o no ft h e s ef u n c t i o n a l m o t i f s w ec o n s t r u c t e dr c k 2d e l e t i o nm u t a n ta l l e l e sw i t ht r t m c a t i o n so fc t e r m i n a l 2 7 a a 6 0 a ao r9 0 a a r e s p e c t i v e l y w ei n t r o d u c e dt h e s ea l l e l e si n t ot h er c k 2d e l e t i o n m u t a n tc o n t a i n i n gt h ep l a s m i dp g b d 21t h a tc a r r i e sp g a l p b s 2 叻 o u rr e s u l t s s h o w e dt h a tt h es c r c k 2 p a 2 7 a ac o u l dn o tm e d i a t et h et o x i ce f f e c to fp b s 2 p d d b u t t h es c r c k 2 p a 6 0 a aa n dt h es c r c k 2 p a9 0 a am u t a n t sc o u l dm e d i a t et h ep b s 2 p d dt o x i c e f f e c to fp b s 2 p 叻 t h e r e f o r e t h ef u n c t i o n a lm o t i fo fr c k 2 pm e d i a t i n gp b s 2 p d d t o x i c i t ys h o u l dp o s i t i o nb e t w e e nt h e2 7 t ha n dt h e6 0 t ha l n i n oa c i d si nt h ec t e r m i n a l s e g m e n t t od e t e r m i n et h ef u n c t i o n a lm o t i fd e t e r m i n i n gt h ed e g r a d a t i o no fs c r c k 2 w h e ni ti so v e re x p r e s s e d w eo v e re x p r e s s e dt h e s ei 沁k 2m u t a n ta l l e l e si nt h er c k 2 d e l e t i o nm u t a n t o u rr e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h es c r c l 2 p 6 0 a aw a sd e g r a d e d w h e no v e re x p r e s s e d w h i c hi n d i c a t e st h a tt h el a s t6 0a m i n oa c i d sd o e sn o tc o n t a i nt h e f u n c t i o n a lm o t i f r e g u l a t i n gr c k 2d e g r a d a t i o n k e y w o r d s s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e r c k 2 p h o gm a p k p b s 2 d d 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果 除了文中特别加以标注和致谢之处外 论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果 也不包含为获得苤鲞盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意 学位论文作者签名 听姆 签字日期 矽7 年多月 f i 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤垄盘堂有关保留 使用学位论文的规定 特授权苤鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索 并采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编以供查阅和借阅 同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘 保密的学位论文在解密后适用本授权说明 学位论文作者签名 许撕 l j 导师签名 签字日期 少雪7 年 月j 日签字同期 日 第一章引言 1 1 酵母及酿酒酵母简介 第一章引言 自然界广泛存在着条件致病真菌 随着疾病治疗方式的改变 导致人类免疫 力下降 从而引起真菌感染 有时难于诊断和治疗常引起病人死亡 真菌病是一 种常见病 多发病 对人类的主要致病真菌约有5 0 多种 根据感染部位分为浅部 真菌和深部真菌 前者主要侵犯表皮角质层 毛发和甲板 如毛发癣菌 表皮癣 菌 大或小孢子菌等 后者主要表现为侵犯皮肤和粘膜深处 内脏 脑和骨骼等 近年来 由于真菌引起的疾病的严重性而唤起人们对这类病原菌的关注 从而在 病原学 病理学 诊断方法和治疗方式等方面有了较深入的研究 真核生物具有很多种类 真菌是最重要的真核微生物 真菌具有自己独有的特 点 即无叶绿素 不能进行光合作用 一般具有发达的菌丝体 细胞壁多含有几 丁质 营养方式为异养吸收型 以产生大量无性和 或 有性孢子的形式进行繁 殖 陆生性较强 酵母菌是一类主要以单细胞形式存在 以细胞出芽或横裂的方 式进行繁殖的真菌的统称 1 是真菌的重要组成部分 酵母菌一般呈卵圆形 球形或圆柱形 直径约为卜1 0u 弛细胞壁的成分以葡聚 糖为主 有些酵母菌的亲代与子代互相连接 形似菌丝 称为假菌丝 酵母菌具 有典型的细胞结果 除了有细胞壁 细胞膜 细胞质之外 还含有真正的细胞核 和线粒体 内质网 等细胞器 其细胞核有明显的核膜 2 酵母菌通常以出芽方 式繁殖 当酵母长到一定大小时 先在细胞的一端 或两端或多端 发生 d 突 起 并进行核分裂 分裂的核 一个留在母细胞内 一个进入小突起内 突起膨 大而成芽体 以后由于细胞壁的收缩 使芽体与亲体隔离 芽细胞可以继续生长 成为新个体 如果在母细胞的多个方向出芽 则称为多边芽殖 这时细胞都是圆 形 椭圆形 腊肠形 大多数酵母菌均如此 如果在细胞两端出芽 称为二端芽 殖 此时细胞多为柠檬形 如果在三端出芽 细胞则呈三角形 这种情况较少 酵母菌属于兼性厌氧微生物 在有氧或无氧的状态下都能够生存 酵母茵分 布很广 在含糖较多的蔬菜 水果表面分布较多 在空气土壤中较少 酵母菌形态虽然简单 但生理却比较复杂 酵母菌能分解碳水化合物产生酒 精和二氧化碳 是重要的发酵素 几乎各种酵母都能发酵葡萄糖 果糖和甘露糖 生成酒精和甘油 其中有一些也能发酵半乳糖 其应用也是多方面的 在工业上 第一章引言 用于酿酒 酵母菌将葡萄糖 果糖 甘露糖等单糖吸入细胞内 在无氧的条件下 经过内酶的作用 把单糖分解为二氧化碳和酒精 此过程称为发酵 在医药上 因酵母菌富含维生素b 蛋白质和多种酶 茵体可制成酵母片 治疗消化不良 并可从酵母菌中提取生产核酸类衍生物 辅酶a 细胞色素c 谷胱甘肽和多种 氨基酸的原料 早在二十世纪3 0 年代 w i n g s 和他的同事们就开创了酵母遗传学研究 大 约1 0 年以后 l i n d e g r e n 和他的同事们也开始了全面的研究工作 这两个研究小 组的工作揭示了酵母遗传学的基本原理和基本方法 今天 酵母被广泛认为上一 种理想的用于生化和遗传学研究的真核微生物 尽管酵母比细菌的遗传性状复杂 的多 但许多用于原核微生物及其病毒的分子遗传学技术同样适用于酵母研究 酵母特别适用于遗传学研究的一些属性包括 存在稳定的单倍体和二倍体细胞 生长快速 无性繁殖 简单的平板影印 突变体分离以及通过微解剖四分体子囊 从而分离得到减数分裂的每一种单倍体产物的能力 酵母已经被成功地用于遗传 学研究的各个领域 例如 诱变 重组 染色体分离 基因表达和调控以及一些 明显不同于真核生物系统的方面 酵母菌有6 0 个属 约5 0 0 个种 常用于科研的典型菌种有酿酒酵母 s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a u e 裂殖酵母 s c h i z o s a c c h a r o m y c e sp o m b e 白念珠 菌 c a n d i d aa l b i c a n s 等 本课题所采用的菌种属于酿酒酵母 它又称啤酒酵母或芽殖酵母 b u d d i n g y e a s t 属于半知菌亚门 芽孢茵纲 隐球酵母目 隐球酵母科 酵母属 细胞 呈圆形或椭圆形 以出芽方式生长 能形成子囊孢子 在实验室培养时 绝大部 份菌落呈乳白色 表面平滑 稍显光亮 部份菌株菌落粗糙具皱折f 3 随着酿酒酵母基因组序列的成功破译 对于酵母的研究已经进入了基因功能 研究的时代 1 9 9 6 年4 月 在国际互联网的公共数据库中公布了酿酒酵母的完 整基因组序列 h t t p w w w y e a s t g e n o m e o 珂 它被称为遗传学上的里程碑 酿 酒酵母1 2 0 6 8 k b 的全基因组序列中含大约5 8 8 5 个o r f s q p e n a a m gf r a l l a e 4 j 它们分布在1 6 条染色体上 这是人们第一次获得真核生物基因组的完整核苷酸 序列 今天 酿酒酵母被广泛认为是一种理想的用于生化和遗传学研究的真核微生 物 作为一种模式生物在实验系统研究方面具有许多内在的优势 首先 酿酒酵母是一种单细胞生物 能够在基本培养基上生长 使得研究人 员能够通过改变物理或化学环境条件控制其生长 5 1 其次 酿酒酵母在单倍体和 二倍体的状态下均能生长 并能在实验条件下较为方便地控制单倍体和二倍体之 间的相互转换 对其基因功能的研究十分有利 如在单倍体状态下 只需一次基 第一章引言 因替换 就能得到某个特定基因缺失的菌株 而对于一些缺失后致死的基因 人 们可以在二倍体菌株中对其中一个等位基因进行基因替换 获得杂合子 h e t e r o z y g o t e 嘲 此外 酿酒酵母繁殖一代大约需要2h 很适合用于遗传学 分析 更重要的是 目前已发展了一些非常有效的技术使得酿酒酵母基因组中 6 0 0 0 个基因中的任何一个基因均能被突变的等位基因取代 甚至从基因组中完 全缺失 这种方法具有很高的效率和准确性 7 j 酿酒酵母作为高等真核生物特别是人类基因组研究的模式生物 其最直接的 作用体现在生物信息学领域 当人们发现了一个功能未知的人类新基因时 可以 迅速地从酿酒酵母基因组数据库中检索与之同源的功能已知的酿酒酵母基因 并 获得其功能方面的相关信息 从而加快对该人类基因的功能研究 研究发现 有 许多涉及遗传性疾病的基因均与酿酒酵母基因具有很高的同源性 研究这些基因 编码的蛋白质的生理功能以及它们与其它蛋白质之间的相互作用将有助于加深 对这些遗传性疾病的了解叫9 1 0 1 1 1 此外 人类许多重要的疾病 如早期糖尿 病 小肠癌和心脏疾病 均是多基因遗传性疾病 揭示涉及这些疾病的所有相关 基因是一个困难而漫长的过程 酿酒酵母基因与人类多基因遗传性疾病相关基因 之间的相似性将为我们诊断和治疗这些疾病提供重要的帮助 随着更多高等真核生物遗传信息的获得 人们将会发现有更多的与高等真核 生物基因具有同源性的酿酒酵母基因 因此酿酒酵母基因组在生物信息学领域的 作用会显得更加重要 这同时也会反过来促进酿酒酵母基因组的研究 与酿酒酵 母相比 高等真核生物具有更丰富的表型 从而弥补了酿酒酵母中某些基因突变 没有明显表型改变的不足 酿酒酵母作为模式生物的作用不仅是在生物信息学方面 它为高等真核生物 基因提供了一个可供检测的实验系统 即通过同源基因与酿酒酵母基因的功能互 补来确证该同源基因的功能 1 2 1 在酿酒酵母中进行功能互补实验无疑是一种研究 人类基因功能的捷径 如果一个功能未知的人类基因可以补偿酿酒酵母中某个具 有已知功能的突变基因 则表明两者具有相似的功能 而对于一些功能己知的人 类基因 进行功能互补实验也有重要意义 例如与半乳糖血症相关的三个人类基 因g a l k 2 半乳糖激酶 g a l t u d p 半乳糖转移酶 和g a l e u d p 半乳糖异构酶 能分别补偿酿酒酵母中相应的g a l l g a l 7 g a l l 0 基因突变 1 引 在进行互补 实验以前 人类和酿酒酵母的乳糖代谢途径都已十分清楚 对有关几种酶的活性 检测方法也十分健全 随着人类三个半乳糖血症相关基因的克隆分离成功 功能 互补实验成为可能 从而在遗传学水平进一步确证了人类半乳糖血症相关基因与 酿酒酵母基因的保守性 人们又将这一成果予以推广 利用酿酒酵母系统进行半 乳糖血症的检测和基因治疗 如区别真正的突变型和遗传多态性 在酿酒酵母中 第一章引言 模拟多种突变型的组合表型 或筛选基因内或基因间的抑制突变等 13 1 这些方法 也同样适用于其它遗传病的研究 利用同源基因与酿酒酵母基因的功能 还能使酿酒酵母成为其它生物基因的 筛查工具 通过使用特定的酿酒酵母基因突变株 对人类c d n a 表达文库进行筛 选 从而获得功能互补的克隆 如t u g e n d r e i c h 等利用酿酒酵母的细胞分裂突变型 c d cm u t a n t 分离到多个在人类细胞有丝分裂过程中起作用的同源基因 利用此方 法 人们还克隆分离到了农作物 家畜和家禽的多个基因 14 1 为了充分发挥酿酒 酵母作为模式生物的作用 除了发展酿酒酵母生物信息学和健全同源基因在酿酒 酵母中进行功能互补的研究方法外 建立酿酒酵母最小基因组 s a c c h a r o m y c e s c c r c v i s i a eb a r em i n i m a lg e n o m e 也是一个可行的途径 酿酒酵母最小基因组是指 允许酿酒酵母在合成培养基中生长所需的最小基因数目的基因组 1 5 1 6 1 人类 c d n a 克隆与酿酒酵母中功能已知基因缺陷型进行遗传互补可以确定人类新基因 的功能 但是这种互补实验可能会受到酿酒酵母基因组中其它丰余基因的影响 如果构建的酿酒酵母最小基因组中所保留的基因可以被人类或者病毒的d n a 序 列完全替换 那么替换后的表型则完全依赖于外源基因的功能 这将成为一种筛 选抗癌和抗病毒药物的分析系统 1 2 酿酒酵母h o gm a p k 途径及s c r c k 2 蛋白作用 1 2 i 酿酒酵母h o gm a f k 途径 在酿酒酵母中存在着多种信号转导途径i 细胞内很多生物学过程 尤其是与 生长 发育相关以及基于外界环境和压力变化进行的调控过程都受到m a p k 促 分裂原活化蛋白激酶 信号转导途径的调控 2 m a p l 己途径包括了三个顺序反应的激酶 即m e 毛m e k 和m a p k 以上被 成为m a p k 模块 8 2 0 l m e k k s 是通过其上游序列相互作用以及丝氨酸 苏氨 酸 酪氨酸的磷酸化来激活的 被激活的m e k k s 可以通过磷酸化m e k 的丝氨酸 苏氨酸残基来激活m e k 而被激活的m e k 又可以通过磷酸化m a f k 上的苏氨酸 和酪氨酸残基来激活m a p k 需要注意的是m a f k 的全活性需要这两种残基均被 磷酸化 2 1 在h o g l 蛋白中分别为m 1 7 4 和t y r l 7 6 h o g 途径通过诱导渗透压保护因子的表达使酵母可以在高渗的环境下生 长 这个途径的上游包括两个分支 见图1 一1 其中一个分支是一个包含两个 组分的信号系统 包括s l n l y p d l 和s s k l 基因组学和生物化学资料显示了这 条途径的激活途径 以下加以介绍 s l n l 是质膜结合h i s a s p 激酶 它在缺少压 第一章引言 力的情况下会被磷酸化 渗透压会引起s n l 的去磷酸化 进而导致y 口d l 一种 h i s 檄酶 和s s k l 一种a s p 激酶 的去磷酸化 脱磷酸的s s k l 通过结合m e k k s s s k 2 和s s k 2 2 n 末端的抑制区来激话它们 它对s s k 2 的这种作用表现为诱导一个 t h r 娃基的自主磷酸化和激酶反应 活化的s s k 2 和s s k 2 2 可以激活m e k 日i p b s 2 这种作用是通过磷酸化其t 环上的s e r 和t h r 残基来实现的 被激活的p b s 2 可以磷 酸化m a p k h o g l 磷酸化环上的t h r 和t 参加来使之澈活 h o g 途径的另一条 分支是有渗透压因子s h o l 檄活 它是s t e 2 0 s t e 5 0 和s t e l l 的激括信号 然后激 活p b s 2 当其中任意一条分支途径被激活均可引起h o g l 的t h r l 7 4 和t y r i 7 6 双磷 酸化 并从细胞质向细胞核转移 调控核转录园子h o t l m s n 2 m s n 4 s k o l 和 s m p l 进而调节胁迫响应基因的表达 利用d n a 微阵列分析技术表明在高渗 胁迫下 h o g l 进入细胞核内后可以调控6 0 0 多个基因的表达 酿酒酵母至少存在五条m a p k 信号转导选径 细胞壁结构维持的细胞完整性 途径 孢子形成途径 菌丝形成和侵袭生长选径 信息素应答逢径以及h o g h i g h o s m o l a n t yg 1 y c e r 0 1 高渗透甘油 选径t 研究发现裂殖酵母 s c h i z o s a c c h a r o m y c e sp o m b e 中也存在与酿酒酵母 h o g m a p k 篮 径同源的s t y lm a p k 的选径 易被渗透胁迫 热休克 d n a 损伤 和氧化胁迫所激活 2 3 以往的研究只发现酿酒酵母h o g m a p i c 途 径能被渗透胁 迫檄活 但最新研究发现h o g l 也能被氧化胁迫激活 并通过r c k 2 起作用 f i l d e 一 工 二ar i l 蔓 一 一 图i l 酿酒酵母h o g m a p k 途径示意圉 f i g l 1h o g m a p k p a t h w a yo f y e a s t 1 2 2 酿酒酵母r c k 2 蛋白功能的研究进展 酿酒酵母r c k 2 r a d i a t i o ns e n s i t i v i t yc o m p l e m e n t a t i o nk i n a s e 基因毋初由 瑞典科学家d a h l k v i s t 等在研究酿酒酵母对紫外线的敏感性时发现的 2 4 1r c k 2 基 第一章引言 因位于酿酒酵母第1 2 号染色体上 其o r f 包含1 8 3 0 个碱基 编码一个6 5 k d a 的蛋 白 在细胞中丰量表达 r c k 2 所编码的蛋白属于受胞内第二信使调控的s e r t h r 蛋白激酶家族 但它跟c a c a m c a m o d u l i n 调控的蛋白激酶家族的同源性也 非常高 在酿酒酵母中分别缺失这个基因后 细胞仍能够存活 说明它属于非必 须基因 最初的研究表明r c k 2 基因可能与细胞的生长和分裂有关 d a h l k v i s t 等 在研究中发现酿酒酵母r c k 2 基因能抑止裂殖酵母 s c h i z o s a c c h a r o m y c e sp o m b e 的细胞周期关卡基因突变瞄j b i l s l a n d 等在2 0 0 0 年发表的研究中指出 r c k 2 p 属于m a p k 激活的蛋白激酶 m a p k a p k 作用于h o g m a p k 途径的下游 是h o g l 的底物 2 6 j 他们通过免 疫共沉淀分析和以h o g l 为 饵 的酵母双杂交分析发现h 0 9 1 能与r c k 2 p 的c 端结 合 h 0 9 1 在胞内和胞外都可以磷酸化r c k 2 p l 拘s 5 1 9 i qs 5 1 9 的磷酸化能够导致r c k 2 p 激酶活性增加 过量表达r c k 2 p 可以部分抑制h o g l a 或p b s 2 a 细胞对外界高渗透环 境的敏感 h o g m a p k 途径过渡激活造成的细胞毒性反应可以被r c k 2 的敲除所 压制 在野生型酿酒酵母细胞中过量表达r c k 2 p 的激酶缺陷型突变体r c k 2k 2 0 1 r 能够降低细胞对外界高渗环境的耐受程度 而在h o g l a 细胞中却无此现象 t e i g e 等的研究也表明r c k 2 p 需要经磷酸化而被激活 2 7 1 在渗透胁迫条件下或 h o g m a p i 隘 径过度激活的条件下 r c k 2 p l 约磷酸化水平瞬间增加 他们的实验 证明磷酸化的r c k 2 p 可以激活翻译延长因子2 e f 一2 的活性 在细胞中过量表达m a p k k m a pk i l l a s ek i n a s e p b s 2 的持续激活型突变体 p b s 2 p d d 可以过渡激活h o g m a p l 遴径 导致细胞致死表型 而缺失r c k 2 基因 可使细胞对这种毒性作用有所抵抗 2 引 这种作用可能与r c k 2 p 的激酶活性有关 而与其c 末端自主抑制序列无关 因为在r c l c 2 a 缺失株中表达全长或c 末端缺失 1 2 3 个氨基酸残基的r c k 2 p 能够互补上述毒性降低的过程而其激酶缺陷型突变体 r c k 2k 2 0 1 r 则不能 r c k 2 pc 末端存在着一个潜在的m a pg i n a s e 结合位点 t i l q r 5 8 9 r 5 9 0 k k v q r c k 2 pr 5 8 9 a r 5 9 0 a 突变体不能与h o g l p 结合 故 r c k 2 pr 5 8 9 a r c k 2 pr 5 9 0 a 单点突变 r c k 2 pr 5 8 9 a r 5 9 0 a 双点突变均可在一 定程度上抑制p b s 2 p 叩所引起的致死作用 r c k 2 突变体虽然缺失了c 末端1 2 3 个氨基酸残基 即缺失了与h o g l 蛋白的结合位点 但这1 2 3 个氨基酸残基中所 包含的自主激酶活性抑制序列也同时被缺失 该突变体的激酶活性升高 故同样 不能抑制p b s 2 p 叩所引起的致死作用 r c k 2 蛋白5 2 0 位的丝氨酸被经证实是r c k 2 的磷酸化位点 r c k 2 ps 5 2 0 e 可以部分抑带u p b s 2 d d 的致死作用 有趣的是 3 7 9 位的苏氨酸虽然是未被证实的磷酸化位点 但是r c k 2 pt 3 7 9 e 可以在很大程度上 抑制p b s 2 p d d 所引起的致死作用 且这一作用在过量表达r c k 2 pt 3 7 9 e 蛋白时也 不会有所改变 第一章引言 b i l s l a n d 等继续对r c k l 基因和r c k 2 基因的功能进行研究并在2 0 0 4 年发表 的文献中指出 r c k l r c k 2 和h o g m a p i 隧 径共同作用于酵母细胞对外界氧 化胁迫应激的应答 2 9 酵母细胞处于氧化胁迫环境下时 h o g l 和r c k 2 的磷酸化 水平上升 h 0 9 1 从细胞质迁移到细胞核 而且这个过程与r c k 2 有一定的关联 r c k 2 a 缺失株在c d 2 z n 2 和t b o o h 等多种氧化胁迫环境下存在生长缺陷 此外 他们还利用r c k l p 和r c k 2 p 为 饵 进行酵母双杂交分析鉴定了多种与抗氧化胁迫 有关的蛋白 例如r c k l p 能和转录因子y a p 2 相互作用而r e k 2 p 贝 u 可以与z n 2 转运 蛋白z r c l 相互作用 s w 眦血a 吐1 a n 等研究发现了r c k 2 p 在高浓度z n 2 条件下的迅速 降解 3 0 在正常条件下r c k 2 p 在酵母细胞内的半衰期为6 0 m i n 以上 而当酵母细 胞暴露于5 m mz n 2 条件下时 r c k 2 p 在5 m i n 内完全降解 这个过程可以被p e p 4 缺失或外加的p m s f p h e n y lm e t h y l s u l p h o n y lf l u o r i d e 所造成的囊泡降解途径 的抑制所阻止 该研究还发现r c k 2 p 的降解只由z n 2 造成的氧化胁迫引起 而与 由c d 2 和m o o h 造成的氧化胁迫无关 酿酒酵母r c k 2 发挥抗氧化胁迫功能可能在氧化胁迫存在条件下通过调节 蛋白质翻译状态和m r n a 的力n z i i 过程来实现的 3 4 氧化胁迫可以导致多核糖体解 离 在氧化胁迫条件下r c k 2 a 细胞中多核糖体的解离程度要远高于野生型细胞 过量表达激酶缺陷型r c k 2 p 突变体r c k 2k d 能够导致细胞对氧化胁迫的高度敏 感 虽然细胞中多核糖体解离程度降低 但是细胞内蛋白质表达水平却与野生型 细胞相似 这说明此时的多核糖体为非活化状态 对r c k 2 a 细胞中总m r n a s 和多 核糖体相关m r n a s 进行微阵列分析显示了该细胞调控机制的主要改变 这些改 变包括胞浆核糖体蛋白的转录以及核糖体的加工与装配 与野生型比较 在r c k 2 a 细胞中 结合力差的m r n a 过多的与多核糖体结合 这与细胞中e f 2 的下调是 一致的 而上述结果表明细胞在氧化胁迫条件下的多核糖体重组需要r c k 2 的参 与 1 3 本论文的研究内容 l j i a n g 等的研究发现 在酿酒酵母细胞中过量表达m a p k k m a pk i n a s e k i n a s e p b s 2 的持续激活型突变体p b s 2 p d d 可以过渡激活h o g m a p k 途径 导致 细胞致死表型 而缺失尺c 磁基因可使细胞对这种毒性作用有所抵抗 z 引 这种作 用可能与r c k 2 p 的激酶活性有关 而与其c 末端自主抑制序列无关 r c k 2 突变 体虽然缺失了c 末端1 2 3 个氨基酸残基 即缺失了与h o g l 蛋白的结合位点 但 这1 2 3 个氨基酸残基中所包含的自主激酶活性抑制序列也同时被缺失 该突变体 的激酶活性升高 故同样不能抑制p b s 2 p d d 所引起的致死作用 图1 2 第一章引言 r c k 2 蛋白在过量表达的情况下会发生降解情况 而其c 末端1 2 3 个氨基酸 残基缺失后则不发生降解 图1 3 这说明在r c k 2 蛋白c 末端的1 2 3 个氨基 酸中存在一个或几个氨基酸决定r c k 2 蛋白在高表达情况下的降解 为了研究发现决定r c k 2 蛋白降解的关键序列和r c k 2 蛋白激酶活性自主抑 制序列的具体位置 本论文的研究主要设计到三个方面 1 酿酒醉母s c r c k 2 基因的亚克隆 构建可以表达缺失不同数量c 末端氪基酸残基r c k 2 蛋白的表达载体 2 将这些表达载体转化到酿酒酵母r c k 2 凸缺失株中 通过w 髂t e m b l o t 检 测其表达情况 3 将这些表达载体与p g l p b s 2 叩同时转化到酿酒酵母删 缺失株中 在用半乳糖作为碳源的s c l e u u r a 培养基上观察其生长情况 e j 一 l 1 孬 途i 羔 y 图1 2 s c r c k 2 在含葡萄糖的培养基上生长三天 和在含半乳糖的培养基上生长六天的情况 f i g l 2g r o w t h w 器r e c o r d e da f t e r 3d a y so i l g l u c o s e m e d i u m a n d a 腑6d a y so n g a l a c t o s e z 能喾参救痞 罱定胃 鬲五百一 峄 器 一n s 图1 3 突变体r c k 2 蛋白的表达及降解情况 f i g l 一3 e x p r e s s i o na n dd e g r a d a t i o n o f m u t a t e d r c k 2 p 躁 第二章实验材料 2 1 菌株 第二章实验材料 本实验中用到的菌种见表2 1 表2 1 本实验中用到的菌株 t a b l e2 1s t r a i n su s e di nt h i sw o r k e c o l i t o pl o u 1 6 f m c r a m r r h s d r m s m c r b c 8 0 l z 本实验室 m 1 5l a c x 7 4 他c a l 锄1 3 9 m l 伽 7 6 9 7g a l u 保存 g a i kr p s l s t r r 即d a ln u p g m a t ah i s 3a 1l e u 2 a 0l y s 2 a 0u r a 3 a 0 r c k 2 n a t m x 4c a n lm f a l m f a l p r h i s 3 纠ah i s 3 a 1l e u 2 a om e t l 5 0u m 3 a o r c k 2 k a n m x 4 9 j i a n ge ta l 2 0 0 4 j i a n ge ta l 2 0 0 4 第二章实验材料 2 2 质粒 本实验中用到的质粒见表2 2 表2 2 本实验中用到的质粒 仉山l e2 2p l a s m i d su s e di nt h i sw o r k 质粒名称 说明来源 p r s 3 1 6 p v a 3 p v a 3 p v a 7 p v a 8 p x d l p x d 2 p x d 3 p x d 4 p x d 5 p x d 6 u r a 3 a m p r c k 2 h a i n p h a c l l l r c k 2 h a a1 2 3 a ai np h a c i1i r c k 2 h ai np h a c l 8 1 r c k 2 h a 1 2 3 a ai np h a c l 8 1 r c k 2 h a a 6 0 a ai np h a c l l l r c k 2 h a a 9 0 a ai np h a c i l l r c k 2 一h a a 2 7 a ai np h a c 111 r c k 2 h a a 6 0 a ai np h a c l 8 1 r c k 2 一h a a 9 0 a ai np h a c l 8 1 r c k 2 h a a 2 7 a ai np h a c181 1 0 本实验室保存 j i m l ge ta 1 2 0 0 4 j i a n ge ta 1 2 0 0 4 j i a a ge ta 1 2 0 0 4 j i a n ge ta 1 2 0 1 n 本工作 本工作 本工作 本工作 本工作 本工作 第二章实验材料 2 3 主要实验仪器 本实验中用到的主要仪器见表2 3 表2 3 本实验中用到的主要仪器 t a b l e2 3 i m p o r t a n ta p p a r a t u su s e di nt h i sw o r k 2 4 培养基 l b 培养基 蛋白胨1 0 9 酵母提取物5 9 n a c l1 0 9 溶于ll 双蒸水 1n n a o h 调p h 至7 0 o 1 m p a 灭菌2 0 m i n 配固体l b 时外加1 2 9 琼脂粉 l b a m p 培养基 l ll b 培养基中加入1m l5 0 m g m l 的a m p 母液 第二章实验材料 y p d 培养基 蛋白胨2 0 9 葡萄糖2 0 9 酵母提取物1 0 9 溶于1l 双蒸 水 固体培养基外加2 0 9 琼脂粉 0 i m p a 灭菌2 0 m i n s d l c u 培养基 酵母氮源6 7g 葡萄糖2 0g 加双蒸水至9 0 0m l 固体 培养基外加琼脂粉2 0 9 0 i m p a 灭菌2 0 分钟 5 5 加过滤除茵的1 0 x a m i n oa c i d m i x l e u1 0 0 m s d u m 培养基 酵母氮源6 7 9 葡萄糖2 0 9 加双蒸水至9 0 0 m i 固体培 养基外加琼脂粉2 0 9 0 i m p a 灭菌2 0 分钟 5 0 加过滤除菌的1 0 a m i n oa c i dm i x u r a1 0 0 m l s c l 眦一u m 培养基 酵母氮源6 7 9 葡萄糖 或半乳糖 2 0 9 加双蒸水至 9 0 0 m l 固体培养基外加琼脂粉2 0 9 0 i m p a 灭菌2 0 分钟 5 0 加过滤除菌的 1 0 x a m i n oa c i dm i x l e u u r a1 0 0 n 1 1 2 5 试剂 表2 4 本实验中用到的主要试剂 t a b l e2 4 i m p o r t a n tm a t e r i a l su s e di nt h i sw o r k 药品名称生产厂家 氢氧化钠 氢氧化钠 无水氯化钙 e d t a 无水乙醇 异丙醇 盐酸 冰醋酸 葡萄糖 甘油 氯化钠 氯化镉 氯化锌 过氧化氢 酸洗玻璃珠 琼脂粉 天津市化学试剂一厂 天律市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 天律市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 天津市光复精细化工研究所 天津市光复精细化工研究所 天津市光复精细化工研究所 北京鼎国生物技术发展中心 北京鼎国生物技术发展中心 1 2 第二章实验材料 p e j 4 0 0 0 蛋白胨 琼脂糖 酵母提取物 呵b 酵母氮源 s d s l i t h i u ma c e t a t e t r i sb a s e p c r 胶回收试剂盒 限制性内切酶 l i g a s e c 御 过硫酸铵 d t t 卫田廊 聚丙烯酰胺 甲叉一双丙稀酰胺 1 3 一巯基乙醇 溴酚兰 p r o t e i ns t a n d a r d 甘氨酸 甲醇 脱脂奶粉 吐温 2 0 一抗 二抗 显色底物 显影液 定影液 北京鼎国生物技术发展中心 北京鼎国生物技术发展中心 上海y i t o 生物试剂有限公司 o x o i dme n g i a n d g e n v i e w 分装 联星生物 s i g m a n o v o n 上海生工生物工程有限公司 上海生工生物工程有限公司 晶美生物工程有限公司 上海生工生物工程有限公司 北京鼎国生物技术发展中心 北京鼎国生物技术发展中心 北京鼎国生物技术发展中心 b b l 分装 上海生工生物工程有限公司 上海生工生物工程有限公司 上海生工生物工程有限公司 晶美生物工程有限公司 上海生工生物工程有限公司 天津市光复精细化工研究所 雀巢脱脂奶粉 天津市光复精细化工研究所 天津润泰生物工程有限公司 天津润泰生物工程有限公司 p i c r s e 柯达 柯达 a r 分析纯 b r 幸 生化试剂 1 3 第二章实验材料 2 6 常用溶液与缓冲液 a m p i c i l l i n 母液 1 0 0 m g m 1 溶解l ga m p i c i l l i n 于足量的水中 最后定容 至1 0 m l 使用0 2 2 9 i n 滤膜 注射器在超净台上进行滤膜过滤灭菌 分装成小份 于 2 0 贮存 5 m 氯化钠 n a c l 溶解2 9 2 9 氯化钠于足量的水中 定容至1 0 0 m l 1 0 n 氢氧化钠 n a o h 溶解4 0 0 9 氢氧化钠颗粒于约0 9 l 水的烧杯中 磁 力搅拌器搅拌 氢氧化钠完全溶解后用水定容至l l 1 0 s d s 十二烷基硫酸钠 称取1 0 0 9 s d s 慢慢转移到约含0 9 l 的水的烧 杯中 用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解 用水定容至1 l 1 m 氯化镁 溶解2 0 3 9m g c l 2 6 h 2 0 于足量的水中 定容到1 0 0 m l 1 m 氯化钾 溶解7 4 6 9 氯化钾于足量的水中 加水定容到1 0 0 m l 3 m 乙酸钠 溶解4 0 8 9 的三水乙酸钠于约9 0 m l 水中 用冰乙酸调溶液的 p h 至5 2 再加水定容到1 0 0 m l 1 0 m g m l 溴化乙锭 小心称取1 9 溴化乙锭 转移到广1 3 瓶中 加1 0 0 m l 水 用磁力搅拌器搅拌直到完全溶解 用铝箔包裹装液管 于4 c 贮存 h s 缓冲液 将1 2 l g 的t r i s 碱溶解于约o 9 l 水中 加4 6 m l 浓盐酸 1 1 6 n 用水调整终体积至1 l 则p h8 0 加6 6 m l 浓盐酸 1 1 6 n 用水调整终体积至 1 l 则p h7 6 0 5 me d t a 配制等摩尔的n a u e d t a 和n a o h 溶液 0 5 m 混合后形成e d t a 的三钠盐 或称取1 8 6 1 9 的n a 2 e d t a 2 h 2 0 和2 0 9 的n a o h 并溶于水中 定容 至l l t e 缓冲液 用于悬浮和贮存d n a 成分及终浓度 配制1 0 0 m l 溶液各成分的用量 1 0 m mt r i s h c l l m m e d l a 水 l m l1 mt r i s h c i p h 7 禾8 0 2 5 c 2 0 0 l1 0 5 m e d t