实时荧光定量PCR技术及其在昆虫学研究中的应用.pdf

昆 虫 学 报 A c t a E n t o m o l o g i c a S i n i c a D e c e m b e r 2 0 0 8 5 1 1 2 1 2 9 3 1 3 0 3 实时荧光定量 P C R技术及其在昆虫学研究中的应用 王光华 赵伟春 程家安 1 浙江大学昆虫科学研究所 杭 州3 1 0 0 2 9 2 浙江中医药大学生物工程学院 杭州3 1 0 0 5 3 摘要 实 时荧 光定量 P C R r e a l t i m e fl u o r e s c e n t q u a n t i t a t i v e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n F Q P C R 是一种利用荧光信号实时 监测体外 D N A分子 P C R复制 过程中每个循环的扩增产物 从 而实现对 D N A模板进行 定量分析 的技术 具 有准确 快速 灵敏 特异等优点 在动植物基 因工程 动植物 检疫 微 生物鉴 定与分 类 食品安 全检测 和医学等领 域 中得 到 广泛应用 本文对实时荧光定量 P C R技术的原理 优缺点及近年来新的荧光探针的原理 类型进行了评述 并对实 时荧光定量 P C R技术在 昆虫学研 究中的应用 进行 了综述 关键词 D N A 实时荧光定量 P C R 荧光共振能量转移 探针 昆虫学 中图分类号 Q 9 6 6 文献标识码 A 文章编 号 0 4 5 4 6 2 9 6 2 0 0 8 1 2 1 2 9 3 1 1 Re a l t i me flu o r e s c e n t q u a nt i t a t i v e PCR t e c h n i q u e a nd i t s a pp l i c a t i o ns i n e n t o mo l o g i c a l s t u d i e s WAN G G u a n g H u a Z HA O We i C h u n CH E NG J i a An 1 I n s t i t u t e o f I n s e c t S c i e n c e s Z h e j i a n g U n i v e r s i t y H a n g z h o u 3 1 0 0 2 9 C h i n a 2 C o l l e g e o f B i o e n g i n e e ri n g Z h e j i a n g C h i n e s e Me d i c a l U n i v e r s i t y H a n g z h o u 3 1 0 0 5 3 C h i n a Ab s t r a c t Re a l t i me flu o r e s c e n t q u a n t i t a t i v e P CR i s a l a b o r a t o r y t e c h n i q u e f o r q u a n t i t a t i v e me a s u r e me n t o f t h e DNA t e mp l a t e c o n c e n t r a t i o n b y mo n i t o r i n g t h e flu o r e s c e n t s i g n a l i n e a c h o f DNA a mp l i fic a t i o n c y c l e Th i s t e c h n i q u e i s a c c u r a t e s p e e d y s e n s i t i v e a n d s pe c i fic h h a s b e e n wi d e l y u s e d i n s u c h fie l d s a s b i o e n g i n e e rin g q u a r a n t i n e mi c r o b e i d e n t i fi c a t i o n a n d c l a s s i f i c a t i o n f o o d s a f e t y i n s p e c t i o n a n d me d i c a l s c i e n c e I n t h i s a r t i c l e t h e p r i n c i p l e s c h a r a c t e ris t i c s a n d r e c e n t a d v a n c e s i n flu o r e s c e n t p r o b e s o f t h e r e a l t i me flu o r e s c e n t q u a n t i t a t i v e PC R a s s a y a n d i t s a p p l i c a t i o n s i n e n t o mo l o g i c a l s t u d i e s we r e r e v i e we d K e y w o r d s D N A r e a l t i m e fl u o r e s c e n t q u a n t i t a t i v e P C R F Q P C R fl u o r e s c e n c e r e s o n a n c e e n e r g y t r a n s f e r F RE T p r o b e e n t o mo l o gy 实 时 荧 光 定 量P C R r e a l t i m e fl u o r e s c e n t q u a n t i t a t i v e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n F Q P C R 是 在 P C R技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定 量技 术 H i g u c h i 等 1 9 9 2 提 出 了实 时 P C R 的设 想 1 9 9 6年美 国 A p p l i e d B i o s y s t e m s 公 司首先推 出 了这 一 技术 该技术是在 P C R反应体系中加入荧光基 团 利用荧光信号以实时监测整个 P C R进程 最后通过 标准 曲 线 对 未 知 模 板 浓 度 进 行 定 量 分 析 实 现 了 P C R从 定性 到 定量 的 飞跃 由 于该 技 术具 有 准 确 特异 灵 敏 和快 速等 特点 短短 的几 年就被 广 泛应 用 到生物学 医学 农业 食品 环保等多个领域 涉及 到分 子检测 基因表达 核酸多态性分析和基因突 变分 析 等 方 面 的 研 究 本 文 对 实 时 荧 光 定 量 P C R 技术的原理 优缺点及近年来新 的荧光探针 的原理 和类型进行了评述 并对实时荧光定量 P C R技术在 昆虫 基础 生物 学 分类 检疫 种群生 态 抗 药性 和 生 物防治等研究 中的应用进行了综述 1 实时荧光定量 P C R的基本原理 实 时荧 光 P C R均 是 基 于荧光 共 振能 量转 移 fl u o r e s c e n c e r e s o n a n c e e n e r gy t r a n s f e r F R E T 原 理 F O s t e r 1 9 4 8 即当一个荧光基团与一个荧光淬灭 基团的距离邻近至一定范 围时 就会发生荧光能量 基金项 目 国家 自然科学基金项 目 3 0 7 7 1 4 2 0 作者简介 王光华 男 1 9 7 7年 1 2 月 生 博士研究生 研究方向为昆虫分子生态 学 E m a i l 通讯作 者 A u t h o r f o r c o r r e s p o n d e n c e E m a i l j a c h e n g z j u e d u e n 收稿 日期 R e c e i v e d 2 0 0 8 一 O 8 2 3 接受 日期 A c c e p t e d 2 0 0 8 1 0 3 1 昆虫学 报 A c t a E n t o m o l o g i c a S i n i c a 5 1 卷 转移 淬灭基团会吸收荧光基 团在激发光作用下的 激发荧光 从而使其发不出荧 光 荧光基 团一旦 与 淬 灭 基 团 分 开 淬 灭 作 用 即消 失 因此 可 以利 用 F R E T 选择合适 的荧光基团和淬灭基 团对核酸探针 或引物 进行 标记 利 用 核 酸 杂交 和 核 酸水 解 所 致荧 光基 团和 淬灭基 团结合 或 分 开 的 原理 建立 各 种 实 时荧光 P C R方 法 当 P C R反应时 利用荧光信号的变化实时监测 P C R扩增 反 应 中每 一 循环 扩 增 产物 量 的 变化 通 过 c t 值 c y c l e t h r e s h o l d C t 和标准曲线对起始核酸模 板进 行 定 量 分 析 C t 值 为 P C R扩 增过 程 中扩 增 产 物的荧光信号达到设定阈值时所经过的扩增循环次 数 它与模板起始拷贝数 的对数存在线性关系 模 板 D N A分子越多 荧光达阈值 的循环数越少 即 c t 值越小 利用 已知起始 D N A拷贝数 的标准 品可作 标准曲线 只要获得未知样品的 c t 值 即可通过标 准曲线 计算 出该样 品 的起 始 D N A拷 贝数 2 荧光染料和荧光探针 实时荧光定量 P C R是在普通 P C R的基础上加 入 荧光 化合物 得 以实现 这些荧 光化 合物 广义上 可 分为 荧 光 染 料 和 特 异 性 荧 光 探 针 两 大 类 Wi l h e l m a n d P i n g o u d 2 0 0 3 荧 光染 料是 利用 其本 身 特有 的 一 些理 化特征 来指示 扩增 产物 的增 加 探 针 是利 用 与靶 序列 特异 杂 交 的探 针来 指示 扩 增产 物 的增 加 包 括荧 光标 记探针 和荧光 标记 引物 前者 的优点 是 简便易行 后者因增加了探针的识别步骤 特异性更 强 2 1 荧光染 料 fl u o r e s c e n t a y e 荧 光染 料 检 测 只 能 简 单地 反 映 P C R反 应 体 系 中总的核 酸量 是 一 种非 特 异 性 的检 测 方 法 可 与 双链 D N A结合的嵌入型荧光染料 主要有溴化 乙锭 H i g u c h i e t a 1 1 9 9 2 S Y B R G r e e n I Wi t t w e r e t Z 1 9 9 7 Ma c k a y e t a 1 2 0 0 2 Zi p p e r e t a 1 2 0 0 4 B E B O B e n g l s s o n e t a 1 2 0 0 3 及 S YB R G o l d 等 荧光染料 与双链 D N A结合 后 其 荧光大大增 强 在 P C R反应体系中 加入过量 S Y B R G r e e n I 荧 光染料 其特异性地掺入 D N A双链后并发射荧光信 号 而不掺入链 中的 S Y B R染料分子不会 发射任何 荧光信号 从而保证荧光信号的增加与 P C R产物的 增 加完 全 同步 图 1 A S Y B R G r e e n 工 在核 酸 的 实 时检测 方 面有 很 多优 点 且 价 格 较 低 灵 敏 度 较 高 但是 由 于 S Y B R G r e e n I 可 以 与 所 有 的 双 链 D N A相结合 因此假阳性高 非特异性强 并且 不适 合进 行多重 荧 光定 量 P C R反 应 如 果对 扩 增 产 物 进行熔 点 曲线分 析 R i r i e e t a 1 1 9 9 7 并 优 化 P C R 反应 条件 则可 以部分 消除非 特异 产物 的影 响 2 2荧光 标记探 针 fl u o r e s c e n t l y 1 a b e l e d p r o b e 2 2 1 T a q M a n探针 T a q Ma n p r o b e T a q Ma n探针 是 一 种水解型寡核苷酸探针 其 5 端标记荧光基团 3 端标记淬灭基团 分别与上游引物和下游引物之 间 的 目标 序 列 配对 H o l l a n d e t a 1 1 9 9 1 L e e e t a 1 1 9 9 3 当一个荧光基 团的发射光谱与另一个荧光 基团的吸收光谱相重叠时 能量可以从短波长 高能 量 的荧光基团传递到长波长 低能量 的荧光基团 即短 波长 的荧 光基 团所 释放 的荧 光 被 屏蔽 这 种 现 象便是 F R E T F R E T现象的发生与供受体分子的空 间距 离 紧密相 关 有效 距 离 一般 为 7 1 0 n m 当 完 整 的 T a q Ma n探针 与 目标 序列 配对 时 荧 光基 团发 射 的荧光因与 3 端的淬灭基团接近而被淬灭 在进行 延 伸反 应时 聚合 酶 的 5 一3 外 切 酶 活 性 将探 针 切 断 使得荧光基团与淬灭基团分离而发射荧光 一 分子的产 物生成 就伴随着一分子 的荧光信号 的产 生 随着 扩增 循环数 的增 加 释 放 出来 的荧光基 团不 断积 累 图 1 B 因此 T a q Ma n探 针 检测 的是 积 累 荧光 荧光强度与扩增产物的数量呈正 比关 系 常 用的 5 端 标 记 荧 光 报 告 基 团 有 6 一 羧 基 荧 光 素 F A M 六 氯一 6 一 羧 基 荧 光 素 H E X 和 C y 5等 常 用 的 3 端 标 记 淬 灭 基 团 为 6 一 羧 基 四 甲 基 罗 丹 明 T A M R A 或 4 4 一 恶 烷 氨 基 苯 偶 氮 苯 甲 酸 D A B C Y L 等 与 T A M R A相 比 D A B C Y L可以更有效 地减少 自发荧光信号 因此经常使用 T a q Ma n探针 具有特异性强 假 阳性低 适合多重荧光定量 P C R 等优点 但其线性结构导致了较高的背景荧光 即信 噪 比低 2 2 2 T a q Ma n M G B 探 针 T a q Ma n M G B p r o b e T a q Ma n MG B探 针 与 T a q M a n探 针原 理 相 同 不 同 的 是其 3 端标记的荧光淬灭基团是一种基本无荧光本 底 的小沟 结合 物 m i n o r g r o o v e b i n d e r M G B 取 代 了 常规可 发 光 的 T A M R A荧 光 标 记 使 得 荧 光 本 底 大 大降低 从而提高了分辨率 K u t y a v i n e t a 1 2 0 0 0 由于探针 3 端另结合 了 MG B结合物 使得探针 的 T m值提高了近 l 0 增加 了配对序列与非配对 序 列的差异 从而使探针 的杂交稳定性和特异性显著 增 强 探针 长度 缩短 一 般在 1 3 1 8 个 碱基 内 淬 灭 基 团与报 告基 团在 空 间位 置 上 更 加 接 近 实 验 结 果 更精 确 因 此一 些 难 于 设 计 常 规 T a q M a n探 针 的 1 2 期 王光华等 实时荧光定量 P C R技术及其在昆虫学研究 中的应用 A V l 峨强 j 峨 I 毫 峨蟹 基 基 团 一 荧光激发基团 光淬灭基团 ra q Ma n 探针 荧光激发基团 荧光淬灭基团 雠荧 受 体 荧 光 素 杂交探针 气 厂 L l 鋈 DN A聚 合酶 一 荧光基团 光基团 A g 探针 荧 光激 发 D NA聚 合酶 r V 图 1 主要荧光染料 荧光探针和荧光引物定量 P C R的基本原理 仿 K u b i s t a e t a 1 2 0 0 6 F i g 1 B a s i c p r i n c i p l e s o f r e p o r t e r s u s e d i n r e a l t i m e P C R a d a p t e d f r o m K u b i s t a e t a 1 2 0 0 6 A 荧光染料 F l u o r e s c e n t d y e B T a q Ma n探针 T a q Ma n p r o b e C 分子信标 M o l e c u la r b e a c o n D 杂交探针 H y b r i d iz a t io n p r o b e E A l l g l o探针 A l l g l o p r o b e F 蝎尾引物 S c o r p i o n p r i m e r 荧光激发基团 F l u o r e s c e n t r e p o r t e r 荧光淬灭基团 F l u o r e s c e n t r D N A聚合酶 D N A p o l y m e r a s e 供体荧光素 F l u o r e s c e n t d o n o r 受体荧光素 F l u o r e s c e n t a c c e p t o r 荧 光基 团 F l u o r o p h o r e 目的基 因片 段 也 可 以较 容 易 地 设 计 出 T a q Ma n M G B 探 针 并 具有 可行 性 强 信 噪 比高 适 合 单 核苷 酸 多 态性 s i n g l e n u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m S N P 检 测 等 多 种 检测方 式 的优点 2 2 3 分子信标 m o l e c u l a r b e a c o n 分 子信标是一 种在靶 D N A不存在时形成茎环结构 的双标记寡核 苷酸探针 环形部分设计为与靶核酸序列互补的探 针 茎形 部 分 由探 针 两 端 的互 补 序 列 的短 臂 退 火 形 成 一发 夹结 构 r r y a g i a n d K r a m e r 1 9 9 6 T y a g i e t a 1 1 9 9 8 两 臂 的末 端分 别共 价结合 一 个 荧 光基 团和 一 个 淬灭基 团 这种 发 夹 结 构 使 荧 光 基 团 和 淬灭 基 团紧挨 导致荧 光 能 量被 吸收 释 放 为 热 而不 发 出 荧光 当探针遇到靶核酸时 因探针的环形部分和 靶核酸杂交体 比茎杂交体更长 更稳定 迫使茎端 的 荧光 和淬灭 基 团相 互 分 离 从 而 恢 复 了荧 光 图 1 C T y a g i 等 2 0 0 0 在发明了传统 的分子信标后 又 设计 了一种 荧光 波长转 移型 分子 信标 E 1 n a j i e t z 2 0 0 1 M h l a n g a a n d Ma l m b e r g 2 0 0 1 这种分子 信标的一末端连接两个不同的荧光基团 荧光收集 基团 h a r v e s t i n g fl u o r o p h o r e 和荧光发射基团 e m i t t i n g fl u o r o p h o r e 分 子信 标 的另一末 端连 接淬灭 基 团 未结 合靶 分子 时 它 与传 统 的分子 信标 一样 荧 光 收 集 基 团吸收 的能 量 传 给 淬 灭基 团 然 后 能 量 以热 的 形式放出 不产生荧光 当与靶分子结合发生构象 变 化后 荧 光收集 基 团 的荧 光并 未恢 复 而是把 能量 以荧光 共振 能量 转 移 的 形式 转 移 给 荧 光发 射 基 团 荧光发射基团将能量 以荧光 的形式放 出 在单一光 源激发下 荧光发射基团可在可见光谱区发 出不 同 波 长的 荧光 这样 可 以通过 选择 不 同波长 的荧光 发 射基团 从而使分子信标按设计的要求发 出不同颜 色 的荧 光 N u t i u和 L i 2 0 0 2 发 展 了一 种 由三 分 子 组 成 的 三联分子信标 t r i p a r t i t e m o l e c u l a r b e a c o n s T MB 一 分子的寡核苷酸发夹结构 环部能与靶基因杂交 双 长臂不做荧光标记 另外两分子的寡核苷酸分别能 与发 夹 的双 臂杂 交 且 两 分 子分 别 标 记 荧光 淬灭 基 团和荧光报告基 团 这种三分子构成的分子信标 1 2 9 6 昆 虫 学 报 A c t a En t o mo l o g i c a S i n i c a 易于高通 量 的标记 尽管分子信标探针对探针与靶核酸的错配检测 非常敏感 但由于各含 4 5 n t 的侧臂序列 有随机 参与 D N A 一 靶核酸之间结合的趋向 从而可能 出现假 阳性结果 C r e y D e s b i o l l e s等 2 0 0 5 采用不 与天然 D N A和 R N A 交 叉 配 对 的 正 交 核 苷 酸 对 如 h o m o D N A构建分子信标 的茎 即可避免上述问题 M a r t i 等 2 0 0 6 设计了 MB F B分子信标 主要 以 2 氧 基 嘌呤 2 a m i n o p u r i n e A P 和 吡 咯脱 氧胞 苷 p y r r o l o d C P d C 作 为 荧 光 基 团 并 分 别 在 最 大 吸 收峰为 3 7 0 n m和 4 7 3 n m时发出荧光 但当其被结 合 到寡核 苷酸探 针 当 中以及 随着 探针 与模板 发生 杂 交而变成双链 D N A时 由于邻近碱基的堆积干扰作 用使其荧光大量减少 分子信标的优点是 特异性高 靶核酸即使 仅含 一个错 配 或缺 失 也 不 能使 荧 光 恢 复 该 特异 性 适合 S N P的检 测 荧 光 背景 低 与 T a q Ma n探 针 相 比 分子信标的突出优点是检测过程 中不必将探 针和靶杂交体与过量探针分离开 有效解决了淬灭 效率问题 其缺点是设计程序 比较复杂 成 功率低 T s o u r k a s e t a 1 2 0 0 3 2 2 4 T a q Ma n分子信标 T a q M a n m o l e c u l a r b e a c o n 孔德明等 2 0 0 3 设计的 T a q M a n分子信标 也是一种 性能良好的 P C R荧光探针 T a q M a n分子信标保 留 了经典分 子 信标 的茎 环结 构 不 同 的是 T a q Ma n分 子信标除环部序列外 其 5 端茎序列也被设计为探 针 的基 因识 别部位 当探针 与靶标 序列 发生 特异互 补 杂交 形成 双链 时 T a q酶的 5 一3 外切 活性 即被激 活 将探 针 5 端连 接 的荧光分 子从 探针 上切割 下来 从而使荧光 分子与淬灭分子彻底分开 荧光恢复 T a q M a n 分子信标集中了 T a q M a n探针和分子信标两 种 探 针 技 术 的 优 点 在 杂 交 和 探 针 降 解 过 程 中 T a q M a n 分子信标均能产生荧光信号 这使得 T a q M a n 分子信标具有更高的灵敏度 2 2 5杂 交探 针 h y b r i d i z a t i o n p r o b e 杂交 探针 由 两条相邻探针组成 其 中上游探针的 3 端标记供体 荧光素 下游探针的 5 端标记受体荧光素 C a p l i n e t z 1 9 9 9 在 P C R模 板退火 阶段 两探针 同时与 扩增产物杂交 形成头尾结合的形式 使供体和受体 荧光素距离非常接近 两者产生荧光共振能量转移 使受体荧光基团发出荧光 而当两探针处于游离状 态时 无荧光产生 图 1 D 由于杂交探针是靠近 发光 所以检测信号是实时信号 非累积信号 2 2 6 复合探针 c o m p l e x p r o b e 复合探针又称 为 双链 探针 由互 补 的两 条链 构 成 长 链 的 5 端标 记 报告基团 3 端磷酸化 短链的 3 端标记淬灭基团 没有靶核苷酸存在时 两条链形成复合体 荧光被淬 灭 当有靶 序 列 存 在 时 带 有报 告 荧 光 基 团的 长链 探 针 先 和 靶 核 苷 酸 结 合 发 出 荧 光 Wa n g e t a 1 2 0 0 2 K o n g e t a 1 2 0 0 3 2 2 7 置换 探 针 d i s p l a c e m e n t p r o b e 探 针 分 子 与 目标核酸链杂交时 自身 的空间构型可能发生改变 导致荧 光信号 发 生改变 基于 此原 理 L i 等 2 0 0 2 设 计 了置换探针 阴阳探针 利用核酸链之间的竞争 性杂交 实现 对 目标链 的分析 检测 置换探 针 由两条互 补 D N A链 组成 分 别标 记有 荧光基 团和淬灭 基 团 它们 的长 度在 2 0 2 5个碱 基 左右 其中与 目标序列相匹配的一条链 比另一条长 5 个 碱基左 右 在没 有 目标 D N A链存 在 时 探 针 分 子 的两条链 互相 杂交 荧 光 基 团 与淬 灭 基 团距 离 很 近 荧光 被淬 灭 当有 目标链存 在时 与 目标 序 列相 匹配 的探 针链 趋 向与之杂 交 形 成 更稳定 的杂 交体 此 时荧光 基 团与淬 灭基 团分离 荧光 不再被 淬灭 能 检测到较强的荧光信号 此探针原理简单 设计难 度小 标 记成 本 低 在 P C R定 量 分 析 中有 广 泛 的应 用前 景 C h e n g e t a 1 2 0 0 4 2 2 8 A l l g l o 探针 A l l g l o p r o b e A l l g l o 探 针 是美 国 A l l e L o g i c B i o s c i e n c e s 公 司 w w w a l l e l o g i c c o n 推 出 的最新 一代 荧光 定量探 针 G i b s o n 2 0 0 6 它 打 破 了 传统 T a q Ma n探针 的一端报告基团 一端淬灭基团的 限制 利 用 美 国 A l l e L o g i c B i o s c i e n c e s 公 司 研 究 开 发 的 获得 美 国专利 的几种 常用 波长 的特 制荧 光染料 包括 M A R J U P S A T T U R A 和 N E O 该 探针 两端标记相同的报告基 团 在与靶标序列杂交之前 或酶切探针之前 探针上标记 的荧光基团能够相互 淬灭 在 杂交 水解 之 后 两端 标 记 的染 料 又全 部 变 为 报告基 团 大大 提 高荧 光 增 量 该 系 列染 料 标 记 在 寡 聚核 苷酸两 端 相 互为 报 告 及 淬灭 基 团 并 含 有 特 殊的可以大大提高 T m值 的化学基 团 提高了探针 的特异 性 图 1 E 2 3荧光标 记 引物 fl u o r e s c e n t l y l a b e l e d p r i me r 荧光标记引物的作用原理是荧光标记引物与扩 增 产物 结合 后发 出 荧光 进 而实现 准确 定量 的技术 它是从分子信标的概念变化而产生的一种联合分子 探 针 系统 它把荧 光基 团标 记 的发 夹 结构 的序 列 直 接 与 P C R引物 相结合 从 而使 荧 光标 记 基 团直 接 掺 入 P C R扩增 产 物 中 目前 主要 有 日出引物 蝎尾 引 物 L U X引物 和 P l e x 0 r T 检测方 法 等 l 2期 王光华等 实时 荧光 定量 P C R技术 及其 在昆虫学研究 中的应用 2 3 1 日出引物 s u n ri s e p ri m e r 13出引物 又 叫发 卡式引物 h a i r p i n p ri m e r N a z a r e n k o e t a 1 1 9 9 7 是 对分子信标的发展 在延伸时整合进它们的特异扩 增 子 产 生荧 光信 号 其 特 异性仅 依赖 于 引物 序列 此法 能将所 有扩 增 产 物 均 标 记 上 荧 光分 子 因 此 荧 光信号响应快 但无法区分特异和非特异扩增是 13 出引物 最 大的不 足 2 3 2 蝎 尾 引 物 s c o r p i o n p ri m e r 蝎 尾 引 物 Wh i t c o m b e e t a 1 1 9 9 9 是 对 日出引 物 的进 一 步 改 进 该技术在引物与分子信标探针之间连接一个间 隔臂 使 P C R延伸反映时不能延伸到分子信标 这 样 非特异扩增产物便无荧光信号 当有特异扩增产 物时 即可与分子信标进行杂交 产生荧光信号 图 1 F 既解 决 了非特 异性方 面 的问题 又 保 留了 响 应快的特点 但仍存在有 问题 即杂交 时探针不能 完全与模板匹配 且探针合成复杂 2 3 3 L U X 引 物 1 i g h t u p o n e x t e n t i o n p ri m e r L U X p r i m e r 根据分子信标 的原理 I n v i t r o g e n公 司设计 了 L U X引 物 N a z a r e n k o e t a 1 2 0 0 2 该 对 引 物 中 的一条 引物 3 端用 荧 光报 告 基 团标记 在 没 有 单链 模板的情况下 该引物可 以 自身配对 形 成发夹结 构 使荧光淬灭 在模板存在的情况下 引物与模板 配对 发夹结构 打开 产生荧光信号 使 用 L U X引 物进行实时 P C R扩增 不需要专 门设计 探针 既节 省了成本又给实验设计提供了宽松 的条件 由于没 有探 针控 制特 异性 因此 它 的特异 性较探 针 技术 低 但非 特异性 扩增 或 引 物 二 聚体 没 有 影 响 所 以其 特 异 性要 强 于 S Y B R G r e e n I 2 3 4 P i e x o r T 检测 方法 只用 一条 单 标 记 引 物 该 引物 的 5 端连 接 有 I S O C及 荧 光 激 发 基 团 检 测 体 系 中 含 有 标 准 的 d N T P 及 D A B C Y L标 记 的 I S O d G T P 利用 G淬灭荧光的原理 单标记 的引物与模 板杂交时可 以观察到反应体系荧光 的减弱 J o h n s o n e t a 1 2 0 0 4 S h e r r i l l e t a 1 2 0 0 4 所 以这 种检 测方 式 与其他 的荧 光增 强 的方法 正好相 反 除 以 上 各 种 荧 光 探 针 外 还 有 如 A m p l i s e n s o r Wa n g e t a 1 1 9 9 5 Amp l i f o u r U e h a r a e t a 1 1 9 9 9 L i g h t U p I s a c s s o n e t a 1 2 0 0 0 S v a n v i k e t 0 Z 2 0 0 0 C y c l i c o n s Ka n d i ma l l a a n d A g r a w a l 2 0 0 0 S i m p l e P r o b e I T B i o C h e m U n i v e r s a l p r o b e l i b r a r y L N A 1 o c k e d n u c l e i c a c i d s Wa h l e s t e d t e t a 1 2 0 0 0 等一 些 探 针 的报道 使用探针法定量时 为了达到最高的扩增效率 设计 扩增 目的片段 的 长度 应尽 可能 的短 上 下 游 引 物之间的扩增片段长度在 6 0 1 2 0 b p比较合适 而 在使用 S Y B R G r e e n I 染料 法的时候 可以将扩增 的 目的片段 设计 得稍 长些 一般 在 1 0 0 4 0 0 b p比较 合适 以 便 在定 量 时能 有 更多 的 S Y B R G r e e n I 染 料结合到扩增产物上 产生更强的荧光信号 目前 以 S Y B R G r e e n I T a q M a n探 针 T a q M a n M G B探针 分子信标 S c o r p i o n引物以及杂交探针应 用较 为广 泛 荧光染 料 S Y B R G r e e n I 主要 应 用 于 单重荧光定量 P C R检测 但通过设计物种特异性引 物 熔 解 曲 线 分 析 也 可 用 于 多 重 荧 光 定 量 检 测 G u b a l a 2 0 0 6 B e r r y e t a 1 2 0 0 8 T a q M a n探 针 T a q M a n MG B探针 分子信标具有特异性强 假 阳性 低 适 合 S N P检测 多 重荧 光 定量 P C R等 V e r w e ij e t n f 2 0 0 4 G u b a l a a n d P r o l l 2 0 0 6 Ve r w e i j e t a 1 2 0 0 7 3 实时荧光定量 P C R的定量方 法 模 板定 量有 绝对 定量 和相 对定 量两种 前 者是 用 已知 的标 准 曲线来 推算 未知 样 本 的量 后 者是 一 定样 本 中 的靶 序 列 相 对 于 另 一 参 照样 本 的 量 的 变 化 常 用 的方 法 主要有 2种 3 1 标 准 曲线法 的绝 对定 量 用一系列 已知浓度的标准品制作标 准曲线 在 相 同的条 件下 将 目的基 因测 得 的荧光信 号量 同标 准 曲线 进行 比较 从 而 得 到 目的 基 因 的量 该 标 准 品 可以是纯化的质粒 D N A 体外转 录的 R N A 或者是 体外合成 的单 链 D N A 标准 品的量可根据 2 6 0 n m 的吸 光值并 用 D N A或 R N A的 分子 量 来转 换 成其 拷 贝数来 确定 L i u e t a 1 2 0 0 8 3 2 比较 C t 法 的相对 定量 比较 C t 法 与 标 准 曲线 法 相对 定 量 的不 同之 处 在于 c t 法运用 了数学公式来计算相对量 前提是 假设每个循环增加一倍 的产物数量 在 P C R反应的 指数期得到 c t 值并以此反映起始模板 的量 一个循 环 C t 1 的不 同相 当 于起 始 模 板 量 2倍 的差 异 参照 最 常 用 的看 家 基 因 有 G A P D H a c t i n 1 8 S R N A和 2 8 S R N A等 它 们 在 所 有 的 细胞 和 组 织 中都 稳定表达 但是有一些文献报道它们 的表达水 平有 时也 有 大幅 的波 动 B u s t i n 2 0 0 2 R a d o n i 6 e t a 1 2 0 0 4 因此 某 个看 家基 因表 达是 否稳 定 是 否 可 以 用作参照基因 应该通过实验来验证 但是此方法 以靶基 因和看家 基 因扩 增 效 率基 本 一 致 为前 提 效 率的偏移将影响实际拷贝数的估计 P f a f fl 2 0 0 1 和 昆虫学 报 A c t a E n t o m o l o g i c a S i n i c a 5 1 卷 V a n d e s o m p e l e等 2 0 0 2 分别提 出了基于靶基因和看 家基因扩增效率不一致情况下的单个看家基因和多 个 看家 基 因的相 对定量 计算 方法 4 实 时荧 光定量 P C R 技 术在 昆虫 学 研究 中的应用 4 1在 昆虫基础 生物 学研 究 中的应 用 家蝇 Mu s c a d o m e s t i c a是 1 0 0多 种人 和 动 物疾 病 病原物的载体 与人类的生活和健康密切相关 全面 了解 家蝇 基 因组 D N A序列组 成 是控 制 家蝇 预 防疾 病 的基础 在对 家蝇 基 因组进 行测 序 以前 有 必要对 家 蝇 整 个 基 因 组 的 大 小 进 行 测 定 G a o和 S c o t t 2 0 0 6 通 过 S Y B R G r e e n I 对 家蝇 单 拷 贝 基 因 C y p 6 d l T o m i t a e t a 1 1 9 9 5 和 黑 腹 果蝇 D r o s o p h i l a m e l a n o g a s t e r单 拷 贝 基 因 C y p 6 a 2 Wa t e r s e t a 1 1 9 9 2 A d a m s e t a 1 2 0 0 0 进 行 定量 运 用 基 因碱 基 数计 算公 式估 算 家蝇 基 因组 为 2 9 5 1 0 M b 黑 腹 果 蝇基 因组为 1 8 4 M b 大规模基因组测序结果表 明黑 腹果蝇 为 1 8 0 Mb 家 蝇 基 因 组 的 大 小 为 黑 腹 果 蝇 的 1 6倍 研 究表 明家 蝇基 因组 D N A规 模 较 小 适 合完全测序 可以作为基 因组分析研究 的模式生物 Wi l h e l m e t a 1 2 0 0 3 4 2 在 昆虫分 类和鉴 定 中的应 用 B型和 Q型烟 粉虱 B e m i s i a t a b a c i G e n n a d i u s 具 有不 同的抗药 性 快 速 而 又 准确 地 对 烟 粉 虱生 物 型 进行鉴 定是 烟粉 虱 抗 性 监 测 和 治理 的关键 近 来 已经建立 了 以 P C R技 术 为基 础 的 B型 烟 粉 虱 鉴 定 方法 罗晨等 2 0 0 2 臧连生等 2 0 0 6 但此方法需 要扩增 后处 理 浪费 时间 也增 加 了工作 量 J o n e s 等 2 0 0 8 在两种生物型线粒体细胞色素氧化酶亚基 I m t C O I 基因 S N P的基础上 设计制备 了两种生物型 的 T a q M a n M G B探针 建立了 T a q M a n MG B等位基因 特异 的 P C R方法 并对 已知生 物 型 的烟 粉 虱进 行 检 验 结 果 鉴 定 准 确 率 为 1 0 0 这 种 快 速 高 通 量 的 鉴定方 法 在 B型 和 Q型烟粉 虱 的常规 检测 和研究 B 型烟粉虱的入侵方面具有重要的应用意义 B a s s 等 2 0 0 7 和 Wa l k e r 等 2 0 0 7 报道 了两种建 立 在 T a q M a n单核 苷 酸 多 态性 基 础上 的高 通量 鉴 定 冈比亚 按蚊 A n o p h e l e s g a m b i a e复合种 分类 的方 法 但均有不足之处 为了克服缺点 增加检测通量 降 低成本 B a s s 等 2 0 0 8 制备 了三重荧光探针 该方法 同样建立在 T a q M a n单核苷酸多态性基础上 仅利用 干燥蚊子的足就可同时鉴定传播疟疾的两种按蚊及 其姊 妹种 运 用该 方 法 对 撒 哈拉 南 部 非洲 l 3个 国 家 收集 的 4 5 0头 冈 比亚 按 蚊进 行 分 析 证 明该 多 重 荧光定量方法具有很高的特异性和灵敏性 4 3 在 昆虫检 疫 中的应 用 红火蚁 S o l e n o p s i s i n v i c t a是极具破坏力的入侵性 生物 是世界范围的潜在性外来入侵生物 M o r r i s o n e t a 1 2 0 0 4 陈岩等 2 0 0 5 根据 G e n B a n k上发 表 的火蚁 属 S o l e n o p s i s C O I 基 因序 列 设 计 了检 测 红 火 蚁 的引物 与 T a q M a n特 异 性 探针 建 立 了 T a q M a n探 针检测体系 该体系可以准确鉴定各种虫态 的红火 蚁 三叶草 斑 潜 蝇 L i r i o m y z a t r if o l i i B u r g e s s 和 美 洲 斑潜蝇 L s a t i v a e B l a n c h a n d是 严重 为害蔬 菜 和观 赏 植物 的两种 重要 害 虫 正 确 区 分这 两 种 害 虫是 检 疫 和 防治 的基础 目前 的鉴 别方 法 主要 是通 过其 外部 形态及雄虫外生殖器 但二者 的幼虫 蛹形态相似 对快速准确鉴定造成了一定的困难 F e n g等 2 0 0 7 通过 中国台湾和广东 日本 菲律宾 以色列 德 国 美国 洪都拉斯和墨西哥等地 三叶草斑潜蝇 的 C O I 部分 基 因 与 G e n B a n k上 美 洲 斑 潜 蝇 C O I 基 因 的 比 对 依 据 三叶草 斑 潜蝇 的保 守 区序列 设 计 了一 对 引 物与特异性 T a q Ma n探针 建立 了三叶草斑潜蝇实时 荧光 定量 P C R鉴定体 系 该 体 系 可 以准 确鉴 定 各种 虫 态 的三 叶草斑潜 蝇 Y u等 2 0 0 4 根据辣椒实蝇 B a c t r o c e r a l a t if r o n s 的 m t D N A C O l基 因 序 列 筛 选 出 种 特 异 性 引 物 l a t i l l a t i 2 建立 了 S Y B R G r e e n实 时荧 光 P C R快 速鉴 定辣 椒 实蝇 的方 法 该 方法 通 过 7个 浓 度梯 度 检 测 了 该反应体系的灵敏度 表明其检测 阈值为 l P g模板 D N A 最适 D N A模 板量 为 1 2 0 n g 不 同虫 态 的辣 椒 实蝇 成虫 幼虫 和蛹 扩增 曲线 一致 分 别 以熔 解 曲线 分 析 和琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 确 定 上 述 产 物 的 特 异 性 得 出其 平 均熔 解 温 度 为 7 7 5 0 1 并 获 得 一 段 3 6 6 b p的特 异 性 目标 片 段 表 明该 S Y B R G r e e n 实 时荧 光 P C R方法 适 于辣椒 实蝇 幼 虫 蛹 和成 虫 的 快 速鉴 定 余道坚 2 0 0 5 利用扩增的实蝇 m t D N A C O l 基 因 片段 序 列 设 计 和筛 选 了 4对 种 特异 性 引 物 和 4条 T a q M a n MG B种特 异性探 针 在 A B I 7 7 0 0定 量 P C R仪 上分 别 建 立 了地 中海 实 蝇 C e r a t i t i s c a p i t a t a 辣 椒 实 蝇 三带实蝇 B u m b r o s a和瓜实蝇 B c u c u b i t a e等 4 种在植物检疫上有代表性 的实蝇 的 T a q M a