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南京医科大学硕士学位论文 目目 录录 主要英文缩略语词表 1 长链非编码 RNA630 的发现及功能研究 2 中文摘要 2 Identification and Function Analysis of Long Non Coding RNA 630 4 Abstract 4 Objective Identification and function analysis of long non coding RNA 630 in T cell acute lymphoblastic leukemia cells 4 前 言 6 材料与方法 9 结果 27 讨论 39 结论 41 参考文献 41 综述 44 攻读硕士学位期间公开发表的学术论文 57 致谢 58 南京医科大学硕士学位论文 1 主要英文缩略语词表 英文缩写 英文全称 中文名称 DNA LB deoxynucleic acid Luria Bertani 脱氧核糖核酸 溶菌肉汤 FCM Flow cytometry 流式细胞计数 RT PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应 DEPC PBS RNA cDNA dNTP bp KDa mRNA LncRNA h min s siRNA L g l M Diethylpyrocarbonate Phosphate Buffered Saline Ribonucleic Acid complementary DNA deoxy ribonucleoside triphosphate base pair Kilo Dalton messenger RNA Long non coding RNA hour minute second small interference RNA Liter microgram microliter mol ml 焦碳酸二乙酯 磷酸盐缓冲液 核糖核酸 互补 DNA 三磷酸脱氧核苷酸 碱基对 千道尔顿 信使核糖核酸 长链非编码 RNA 小时 分钟 秒 小干扰 RNA 升 微克 微升 微摩尔每毫升 南京医科大学硕士学位论文 2 长链非编码长链非编码 RNA630 的发现及功能研究的发现及功能研究 中文摘要中文摘要 目的目的 急性 T 淋巴细胞白血病 Jurkat 细胞株中长链非编码 RNA630 的发现和功能 研究 方法方法 1 提取人急性 T 淋巴细胞白血病 Jurkat 细胞株 RNA 建立测序文库 用 Illumina HiSeqTM2000 测序仪进行全转录组深度测序 优化测序数据 运用生物 信息学方法将其与人类基因组数据库对比分析发现新的转录本 分析新转录本 的序列和结构 筛选出长链非编码 RNA630 序列 2 RT PCR 检测长链非编码 RNA630 在不同组织和细胞中的表达谱 3 设计靶向长链非编码 RNA630 的小 干扰 RNA 用脂质体 Lipofectamine 2000 转染人急性 T 淋巴细胞白血病 Jurkat 细胞 4 实时荧光定量 PCR 验证小干扰 RNA 对长链非编码 RNA630 的干扰作 用 5 CCK8 法检测细胞增殖 流式细胞仪测定细胞凋亡和细胞周期 6 构建 pEGFP C1 630 真核表达质粒并转染人急性 T 淋巴细胞白血病 Jurkat 细胞 7 罗丹明 123 蓄积实验比较高表达长链非编码 RNA630 前后 Jurkat 细胞药物敏感 性变化 结果结果 1 630 序列是一个新发现的长链非编码 RNA 在人急性 T 淋巴细胞白血病 Jurkat 细胞 人急性 T 淋巴细胞白血病 Jurkat E6 1 细胞 人早幼粒白血病细胞 HL60 细胞中高表达 在正常人多种组织 cDNA 文库 人横纹肌癌 A673 细胞 人鼻咽癌 CNE 细胞 人喉癌细胞 人食管癌 ECA109 细胞 人肺癌 A549 细胞 人原发性肝癌 HepG2 细胞 神经胶质瘤 LN229 和 U87 细胞中均不表达 2 小 干扰 RNA 可下调长链非编码 RNA630 的表达量 抑制 Jurkat 细胞的增殖 诱导 Jurkat 细胞的凋亡 但对细胞周期未见明显影响 3 长链非编码 RNA630 可使 Jurkat 细胞的耐药功能增加 结论结论 630 序列是一个定位于人类 3 号染色体正义链的新转录本 其在多种肿瘤 南京医科大学硕士学位论文 3 组织高表达 在正常组织不表达 是肿瘤相关性转录本 经生物信息学分析 证实 630 序列为一个新长链非编码 RNA 经过初步验证 长链非编码 RNA630 可能参与人急性 T 淋巴细胞白血病的发生 发展 使 Jurkat 细胞的耐药功能增 加 关键词关键词 Jurkat 细胞 长链非编码 RNA 细胞增殖 细胞耐药 南京医科大学硕士学位论文 4 Identification and Function Analysis of Long Non Coding RNA 630 Abstract Objective Identification and function analysis of long non coding RNA 630 in T cell acute lymphoblastic leukemia cells Methods 1 Extract total RNA from T cell acute lymphoblastic leukemia cells Deep sequencing was carried out with high throughput technology for transcriptome profiling in T cell acute lymphoblastic leukemia Jurkat cell New transcripts were discovered by bioinformatics comparative analysis upon the human genome data By analysising the sequences and structures of new transcripts some long non coding RNAs were eventually filtered out 2 A candidate long non coding RNA 630 was identificated in different tissues and cell lines by RT PCR 3 Small interfering RNAs were designed against long non coding RNA 630 Chemically synthesized siRNAs against long non coding RNA 630 were transfected into Jurkat cells 4 The mRNA level of long non coding RNA 630 was quantified by real time quantitative PCR 5 The cellular proliferations were evaluated by using CCK8 method The flow cytometry analysis was used to assess the cell cycle and apoptosis 6 The plasmid pEGFP C1 630 was constructed and transfected into Jurkat cells 7 Testing drug sensitivity of cells by observing the influence of pEGFP C1 630 on Rh123 accumulation in Jurkat cells Results 1 630 was a novel long non coding RNA which was not expressed in normal human cDNA library and not observed in some cell lines such as A673 CNE ECA109 A549 HepG2 LN229 and U87 The mRNA level of long non coding RNA 630 was significantly increased in Jurkat Jurkat E6 1 and HL60 南京医科大学硕士学位论文 5 Conclusion Long non coding RNA 630 is one of the novel transcripts in Jurkat cells which has been seen in a wide variety of tumor It may contribute to the process of T ALL Key words Jurkat cell long non coding RNA cell proliferation drug resistance 南京医科大学硕士学位论文 6 前前 言言 急性 T 淋巴细胞白血病 T ALL 是儿童时期常见的恶性血液疾病 由前体 T 淋巴细胞克隆性异常增殖所致 尽管近年来联合化疗 骨髓移植等治疗手段不 断改进 但其治疗效果和预后比更常见的 B 细胞系淋巴细胞白血病仍然要差很 多 1 目前 关于急性 T 淋巴细胞白血病的具体分子机制和调控机理还不清楚 研究表明长链非编码 RNA long non coding RNA lncRNA 在肿瘤的发生 发 展过程中发挥着促癌或抑癌作用 它们参与细胞凋亡调控 肿瘤浸润与转移等 过程 并可通过表观遗传调控的方式影响肿瘤细胞的生长 2 可能成为新型肿瘤 标志物或肿瘤治疗的靶点 在肿瘤的诊断和治疗方面显示出良好的临床应用前 景 长链非编码 RNA 是在真核生物中发现的一类长度大于 200 个核苷酸 没有 长阅读框架 但往往具有 mRNA 结构特征 帽式结构和 polyA 尾巴 的 RNA 3 lncRNA 在基因组中存在普遍的转录现象 但较之编码蛋白质的基因 往往表达 水平比较低 4 lncRNA 自身的表达水平也收到转录及转录后调控机制的严密调 节 它们都不编码蛋白质 被发现参与调节多种重要的细胞活动 如基因表达 招募染色质修饰物 调节 X 染色体失活 XIST 基因组印记 H19 蛋白质 折叠和蛋白质活性等 3 1996 年发现的人 Xist 基因就是这类 lncRNA 的代表 在女性中 它控制失活两条 X 染色体中的一条 使 X 染色体编码的蛋白质在两 性生物中的表达量趋向一致 根据 lncRNA 与蛋白质编码基因的位置关系 可以 分为 5 类 4 分别是 1 正义 2 反义 3 双向 4 内含子 5 基因间隔区 早期的研究阐明了 lncRNA 对临近基因位点有顺式调控的作用 比如 AIR XIST 和 Kcnqlot 它们招募染色体修饰物使临近的位点沉默 随着 lncRNA HOTAIR 的发现 lncRNA 的反式调控作用也得到了验证 3 除此之外 lncRNA 还可以作为分子伴侣调控蛋白质的构象和作为结构分子的锚定蛋白质在细胞内 的位置 lncRNA 调控基因表达的分子机制非常多样 不仅可以通过结合转录因 南京医科大学硕士学位论文 7 子来激活或抑制靶基因的表达 还能参与组蛋白修饰 mRNA 拼接等 虽然目 前已确定的 lncRNAs 很多 但绝大部分 lncRNA 在生命活动过程中的具体调控 机制及功能模式仍不清楚 有待进一步研究 它们的进化收到进化选择的限制 尽管这种表现相对较弱 5 蛋白质编码基因的进化速度和表达水平具有负相关的 关系 一般来说 高表达的基因比低表达的基因更为保守 这种负相关性在人 类和小鼠的 lincRNA 位于 intergnic 区的 lncRNA 又称 lincRNA 中得到了验 证 这种相关程度与具有相似序列保守性和大小的蛋白质编码基因是相似的 lncRNA 的突变和异常调节与人类疾病相关 6 lncRNA 一级结构 二级结构 表达水平的改变 以及同源的 RNA 结合蛋白是引发从神经退行症到肿瘤相关疾 病的基础 lncRNA HOTAIR 介导的染色质改变和癌症转移之间的关系进一步说 明了 lncRNA 与人类疾病之间的关系 HOTAIR 与 PRC2 polycomb repressive complex 2 的相互作用导致染色体的三甲基化状态改变而加快肿瘤细胞转移 7 这些 lncRNA 占了哺乳动物中非编码 RNA 的大多数 在非常多的重要生物过程 中起着极其关键的调控作用 8 有研究利用 lncRNA表达谱芯片分析了 BCR ABL 转化的人白细胞系 K562 中 lncRNA 的表达情况 发现 K562 细胞中存在多种 lncRNAs 的表达 干扰 BCR ABL 导致其中许多 lncRNAs 的表达水平发生显着 变化 研究发现 BCR ABL 能够抑制 lncRNA BGL3 在 K562 细胞和 CML 临床病 人白血病细胞中的表达 lncRNA BGL3 的过表达能够促进 ABL 转化细胞走向凋 亡 并且抑制细胞在裸鼠体内诱导的肿瘤生长 利用 lncRNA BGL3 过表达转基 因小鼠模型 发现 lncRNA BGL3 的过表达能够削弱 BCR ABL 诱导小鼠骨髓细 胞转化的能力 说明 lncRNA BGL3 是作为负调控因子参与到 ABL 诱导的白细 胞恶性转化过程 研究 lncRNA BGL3 的作用机理 发现 lncRNA BGL3 和 PTEN 具有相同的 miRNA 反应元件 两者都是 miR 17 miR 93 miR 20a miR 20b miR 106a 和 miR 106b 的靶基因 lncRNA BGL3 可以作为竞争性内源 RNA 竞争 性结合这些 miRNA 影响这些 miRNA 对 PTEN 的抑制作用 调控 PTEN 的表 达 从而影响细胞的存活 9 目前为止 与 T ALL 相关的 lncRNA 的研究较少 南京医科大学硕士学位论文 8 本研究利用深度测序技术对人急性 T 淋巴细胞白血病细胞系 Jurkat 细胞进 行了全转录组的高通量测序 获得了 1008 个新转录本 其中 630 序列经鉴定为 lncRNA lncRNA630 在人急性 T 淋巴细胞白血病 Jurkat 细胞 人急性 T 淋巴细 胞白血病 Jurkat E6 1 细胞 人早幼粒白血病细胞 HL60 细胞中高表达 提示其很 可能为肿瘤相关性 lncRNA 通过小干扰 RNA siRNA 技术降低 lncRNA630 的表 达水平能抑制细胞增殖 但对细胞凋亡及细胞周期的影响并不明显 lncRNA630 的过表达能够降低 Jurkat 细胞内罗丹明 123 的蓄积量 表明其与细胞耐药有关 本研究旨在揭示 lncRNA630 在人急性 T 淋巴细胞白血病发生 发展及治疗耐药 中的作用 为临床治疗白血病提供更多的理论支持 南京医科大学硕士学位论文 9 材料与方法材料与方法 一一 材料材料 1 1 细细胞系胞系 质粒质粒 菌株菌株 人急性 T 淋巴细胞白血病 Jurkat 细胞 人急性T 淋巴细胞白血病 Jurkat E6 1 细胞 人横纹肌癌 A673 细胞购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源 中心 人鼻咽癌 CNE 细胞 人喉癌细胞 人食管癌 ECA109 细胞 人肺癌 A549 细胞 人原发性肝癌 HepG2 细胞 神经胶质瘤 LN229 和 U87 细胞为本实验室 江 苏省人民医院组织与公共平台实验室 保存 pEGFP C1 质粒购自美国 Clontech 公司 DH5 感受态细胞购自美国 Promega 公司 1 2 cDNA 文库文库 16 种人正常组织 cDNA 文库为美国 Clontech 公司产品 由江苏省人民医院 周国平教授赠送 2 试剂试剂 RPMI 1640 培养基和胎牛血清购自美国 GIBCO 公司 青霉素 链霉素双抗购自美 国 Hyclone 公司 脂质体 Lipofectamine 2000 和 TRIzol 购自美国 Invitrogen 公 司 氯仿 异丙醇 无水乙醇为上海试验试剂有限公司产品 引物及核酸序列 测序由上海英骏生物技术有限公司完成 DL1 000DNA Marker ExTaqDNA 聚合 酶 dNTP RNA 反转录试剂盒及实时定量 RT PCR 试剂盒购自大连 TakaRa 公 司 Cell Counting Kit 8 CCK 8 购自碧云天生物技术研究所 高纯度质粒小提中 量试剂盒为碧云天公司产品 二甲基亚砜 DMSO 购自美国 Sigma 公司 RACE 试剂盒购自瑞士 Roche 公司 siRNA 购自广州市锐博生物科技有限公司 罗丹 明 123 购自美国 Sigma 公司 3 主要仪器主要仪器 CO2细胞培养箱 美国 Thermo Forma 公司 倒置显微镜 日本 OLYMPUS 南京医科大学硕士学位论文 10 公司 超净工作台 苏州净化设备公司 移液器 德国 Eppendorf 公司 电 热恒温水槽 美国 LKB 公司 纯水系统 美国 Millipore 公司 压力蒸汽灭菌 器 德国 MELAG 公司 制冰机 美国 Grant 公司 常温台式水平离心机 德 国 Sigma 公司 高速冷冻离心机 德国 Hereeus 公司 磁力搅拌器 国华85 1 电子天平 瑞士 Precisa 公司 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction PCR 热循环仪 美国 ABI 公司 恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司 核酸 电泳仪 上海西巴斯 DT A 凝胶成像仪 BIO RAD 荧光定量 PCR 仪 StepOnePlusTMReal TimePCR Sytem 美国 ABI 公司 ChemiDOCTMXRS 型凝 胶成像仪 美国 BIO RAD 公司 全自动酶标仪 美国 Thermo 公司 二二 实验方法实验方法 一一 人急性人急性 T 淋巴细胞白血病细胞系淋巴细胞白血病细胞系 Jurkat 细胞全转录组高通量测序及细胞全转录组高通量测序及新新 转录本转录本分析分析 1 细胞培养细胞培养 1 Jurkat 细胞的复苏 从液氮罐中取出细胞冻存管 迅速置于预先设置的37 温水中 快速晃动 直至细胞冻存液完全溶解 1min 钟内完成 用含75 乙醇的棉球擦拭冻存管 将细胞悬液移至无菌的10ml 玻璃离心管中 加入5ml RPMI1640培养液 轻轻吹 吸混匀 1000rpm 离心5min 弃上清 加入1ml 含10 胎牛血清及1 青霉素及 链霉素的 RPMI1640细胞培养液 轻轻吹吸混匀 转移至 T 25细胞培养瓶 并 加入适量的含10 胎牛血清的培养液培养 在37 5 CO2恒温恒湿的细胞培养 箱培养 2 细胞的传代 倒置显微镜下观察细胞形态和细胞密度 细胞长满后 反复吹打细胞悬液 将细胞悬液转移至10ml 离心管 1000rpm 离心5min 弃上清 加入1ml 含10 胎牛血清的 RPMI1640细胞培养液 轻轻吹吸混匀 细胞计数后按比例转移至细 南京医科大学硕士学位论文 11 胞培养瓶 并加入适量的含10 胎牛血清的培养液培养 在37 5 CO2恒温 恒湿的细胞培养箱培养 3 细胞的收集 3 1 收集处于对数生长期的 Jurkat 细胞 至无菌无 DNA RNA 酶的15ml 离心管 中 1000rpm 离心5min 3 2 弃上清液 用预冷的 1 PBS 缓冲液洗涤细胞 1000rpm 离心 5min 弃上 清 3 3 重复操作 3 2 3 4 按照每 106个细胞加入 1ml TRIZOL 的比例裂解细胞 用移液器 去 RNA 酶的 TIPS 轻轻地来回吹吸裂解细胞 将 TRIZOL 试剂裂解后的细胞全部转移 至无菌无 RNA 酶的 1 5ml EP 管中 对细胞裂解液进行标记 并将获得的 Jurkat 细胞裂解液保存于干冰中 运送至深圳华大基因公司 2 人急性人急性 T 淋巴细胞白血病细胞系淋巴细胞白血病细胞系 Jurkat 细胞全转录组测序细胞全转录组测序 由深圳华大基由深圳华大基 因公司完成因公司完成 1 实验流程 南京医科大学硕士学位论文 12 提取样品总 RNA 后 用带有 Oligo dT 的磁珠富集真核生物 mRNA 加入 fragmentation buffer 将 mRNA 打断成短片段 以 mRNA 为模板 用六碱基随机 引物 random hexamers 合成第一条 cDNA 链 然后加入缓冲液 dNTPs RNaseH 和 DNA polymerase1 合成第二条 cDNA 链 在经过 QiaQuick PCR 试剂盒纯化并 加 EB 缓冲液洗脱之后做末端修复 加 polyA 并连接测序接头 然后用琼脂糖凝 胶电泳进行片段大小选择 最后进行 PCR 扩增 建好的测序文库用 Illumina HiSeqTM2000 进行测序 2 信息分析流程 南京医科大学硕士学位论文 13 3 测序数据经 去除含 adaptor 的 reads 去除 N 的比例大的 reads 去除低 质量 reads 质量值 Q 10 的碱基数占整个 read 的 50 以上 去重复 duplication 处理 从潜在 gene model 中挑选出长度大于 150bp 且平均覆盖度 大于 2 的 gene model 再从中找出位于基因间区域 一个基因 3 端下游 200bp 到下一个基因 5 端上游 200bp 之间的区域 的潜在 gene model 作为候选的新转 录本 Novel Transcript Unit Novel TU 进行生物信息学分析 使用 GRCh37 hg19 数据库对新转录本进行定位 数据库最后更新时间为 2009 年 2 月 然后 利用 RNAFold 软件对其进行深层次的分析 预测 RNA 二级结构 使用 NCBI 的 ORF Finder 软件寻找其开放阅读框架 Open Read Frames ORFs 二二 长链非编码长链非编码 RNA630 的鉴定及在组织和的鉴定及在组织和多种多种细胞系的细胞系的表达谱表达谱 1 细胞培养细胞培养 1 细胞的复苏 方法同二 一 1 1 部分 2 细胞的传代 南京医科大学硕士学位论文 14 2 1 悬浮细胞的传代 Jurkat 细胞 Jurkat E6 1 细胞 HL60细胞为悬浮细胞 传代方法同二 一 1 2 部分 2 2 贴壁细胞的传代 脐血管内皮 HUVE 细胞 人胚肾 293T 细胞 人鼻咽癌 CNE 细胞 高分 化 和 CNE2 细胞 低分化 人喉癌细胞 人食管癌 ECA109 细胞 人肺癌 A549 细胞 人原发性肝癌 HepG2 细胞 横纹肌肉瘤 A673 细胞 神经胶质瘤 U87 和 LN229 细胞为贴壁细胞 显微镜下观察细胞长满后 吸弃细胞培养液 加入 3ml 1 PBS 洗涤 2 次 向细胞培养瓶中加入 1 0ml 0 25 胰蛋白酶液 晃动培养瓶后置于 37 细胞培养 箱中消化 1min 显微镜下观察细胞形态 少部分细胞变为圆形后立即加入 3ml 含 10 胎牛血清的高糖或低糖 DMEM 培养液以终止消化 用吸管反复吹打培养 瓶的底部以悬浮细胞 细胞计数后 将细胞悬液移至细胞培养瓶中 加入适量 的含 10 胎牛血清的高糖或低糖 DMEM 培养液 置于 37 5 CO2细胞培养 箱培养 2 引物的设计与合成引物的设计与合成 使用 Primer5 0软件设计引物 引物的序列如下 RT PCR 1 630 上游引物序列 5 TGTCAATGGATGGAGGGT 3 630 下游引物序列 5 CCAGGGTGTAAGAAGGGT 3 2 GAPDH 上游引物序列 5 GGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCG 3 GAPDH 下游引物序列 5 CCTCCGACGCCTGCTTCACCAC 3 实时荧光定量 PCR 1 630 上游引物序列 5 TGGTGCATGATCGCCGAATA 3 南京医科大学硕士学位论文 15 630 下游引物序列 5 AGCTGCTTTTATCTCGTGGC 3 2 actin 上游引物序列 5 ACTGGAACGGTGAAGGTGAC 3 actin 下游引物序列 5 AGAGAAGTGGGGTGGCTTTT 3 3 细胞细胞总总 RNA 的抽提的抽提 A 悬浮细胞 用吸管吹打细胞悬液 转移至 15ml 无 RNA 酶的离心管 1000rpm 离心 5min 弃上清 1 PBS 洗涤 1 次 吸弃 1 PBS 细胞沉于管底 按照每 106 个细胞加入 1ml TRIZOL 的比例裂解细胞 B 贴壁细胞 吸弃细胞培养液 1 PBS 洗涤 1 次 吸弃 PBS 按照每 106个细胞 加入 1ml TRIZOL 的比例裂解细胞 C 组织标本 称量病人肿瘤组织及癌旁组织 用去 RNA 酶的剪刀剪碎组织 将 组织转移至去 RNA 酶的 1 5mlEP 管 冰浴 按照 100mg 组织加入 1ml TRIZOL 的比例加入 TRIZOL 试剂 使用预先用 DEPC 处理的匀浆器对加入 TRIZOL 后 的组织在冰浴条件下进行彻底匀浆 1 将含 TRIZOL 的细胞或组织裂解液的 1 5mlEP 管 于室温静置 5min 2 按照 TRIZOL 氯仿体积比 5 1 的比例加入氯仿 剧烈摇晃 15s 冰浴 10min 3 4 条件下 12 000rpm 离心 15min 4 转移上层水相至去 RNA 酶的 1 5mlEP 管中 然后加入等体积的预冷的异丙 醇 轻轻颠倒混匀 室温静置 10min 4 条件下 1 2000rpm 离心 10min 离心后 RNA 沉淀可见于管底部或侧壁上 5 吸弃上清 加入 75 乙醇 与加入的 TRIZOL 试剂等体积 轻轻颠倒混匀 4 条件下 7 500rpm 离心 5min 6 吸弃乙醇溶液 室温下干燥 5 10min 7 根据 RNA 沉淀量 加入 20 50 l DEPC 水溶解沉淀 轻轻吹打混匀 室温 助溶 10min 至完全溶解 8 检测 RNA 的浓度和纯度 使用 NANODROP2000 测定 RNA 的浓度和纯度 南京医科大学硕士学位论文 16 A 滴加 2 0 l DEPC 水至测量基座的表面 轻轻的盖上仪器的上基座 点击 Blank 进行调零 B 然后滴加 2 0 l RNA 样品至测量基座的表面 轻轻的盖上仪器的上基座 点击 Measure 液滴自动在上下基座之间形成液柱并自动完成检测 RNA 浓度及 纯度的各种参数将在电脑中生成文件 C 一次检测完成后 用吸水纸擦去上下基座表面残留的 RNA 液 进行下 一个样本的检测 D 纯度检测 RNA 溶液的 A260 A280 的比值范围在 1 96 1 98 之间 表 示 RNA 没有被污染或降解 浓度为 906 9 1199 3ng l 9 RNA 溶液保存于 80 待用 4 长链非编码长链非编码 RNA630 的的 5 RACE 1 合成第一链 cDNA 1 在 Microtube 中配制反应体系 试剂 使用量 CDNA Synthesis Buffer vial 1 4 l Deoxynucleotide mixture vial 3 2 l CDNA Synthesis primer SP1 12 5 M 1 l Poly A RNA or total RNA 0 2 2 g 1 l For control reaction Control primer neo1 rev vial 10 1 l Control neo RNA vial 7 1 l Transcriptor reverse transcriptase vial 2 1 l Double distilled water 9 l Total volume 20 l 2 轻轻混匀后 置于 PCR 仪进行逆转录反应 反应条件如下 55 60min 反转录反应 85 5min 反转录酶失活反应 4 结束 获得 南京医科大学硕士学位论文 17 第一链 cDNA 2 用 High Pure PCR Product Purification Kit 进行 cDNA 的纯化 1 向 20 l单链 cDNA 中加入 100 l粘合缓冲液并混合均匀 2 使用高纯度滤过管和收集管 用移液管将样品加入上面的管中 3 离心 30sec 6000 8000 xg 4 弃掉收集管中的上清 重新装上滤过管 5 在滤过管中加入 500 l的洗涤缓冲液 6 离心 30sec 6000 8000 g 7 确保滤过管中是空的 弃掉收集管中的上清 重新装上滤过管 8 在滤过管中加入 200 l的洗涤缓冲液 9 离心至少 2min 最大转速约 13000 g 第二步洗涤是为了更纯净 10 弃掉收集管中的上清 11 将滤过管插入 1 5ml 的灭菌管中 向滤过管中加入 50 l的洗脱缓冲液 离心 30sec 6000 8000 g 12 1 5ml 管中现存纯净的 cDNA cDNA 立刻用于末端转移酶加尾步骤 用分光光度计在 260nm 和 280nm 下测 PCR 产物的浓度和纯度 滤过管中的玻璃纤维会被洗脱进 cDNA 中 影响吸光度的测量 因此 将 cDNA 高速离心 2min 并小心的从表面吸取 3 用末端转移酶和 dATP 在第一链 cDNA 的 3 末端加上多聚 A 尾 1 在 Microtube 管中配制反应体系如下 试剂 使用量 Purified cDNA sample 19 l Reaction buffer 10 x conc vial 5 2 5 l 2mM dATP vial 4 2 5 l 2 轻轻混匀 94 3min 冰上冷却 3 混合物离心 加入 1 l的末端转移酶 80U l vial 6 混合均匀 37 20min 孵育时间可以增加到 30min 4 70 10min 激活末端转移酶 简单离心后置于冰上 加尾 cDNA 可以直 接用于 PCR 扩增 南京医科大学硕士学位论文 18 4 第一次 PCR 1 在 Microtube 管中配制反应体系如下 试剂 使用量 dA tailed cDNA 5 l Oligo dT Anchor primer vial 8 1 l SP2 12 5 M 1 l Deoxynucleotide mixture vial3 1 l Expand high fidelity enzyme mix 0 75 l Expand high fidelity buffer 10 x with 15mM Mgcl2 5 l Double distilled water 36 25 l Total volume 50 l 2 PCR 扩增条件 94 预变性 2min 然后 94 变性 15s 55 退火 30s 72 延伸 40s 热循环 变 性 退火和延伸 30 次 最后 72 延伸 7min 4 3 PCR 产物可以保存在 4 5 第二次 PCR 1 按照 1 20 的比例将第一次完成后的产物稀释 10 l 2 在 Microtube 管中配制反应体系如下 试剂 使用量 Diluted or undiluted PCR product 1 l PCR anchor primer vial 9 1 l SP3 12 5uM 1 l Deoxynucleotide mixture vial3 1 l Expand high fidelity enzyme mix 0 75 l Expand high fidelity buffer 5 l Double distilled water 40 25 l Total volume 50 l 3 PCR 条件同第一次 PCR 反应 南京医科大学硕士学位论文 19 4 PCR 扩增产物在 1 琼脂糖凝胶上电泳鉴定 5 通过通过 RT PCR 验证验证长链非编码长链非编码 RNA630 的组织和细胞的组织和细胞表达谱表达谱 1 合成第一链 cDNA 反应体系及反应条件如下 1 在 Microtube 中配制下列混合液 试剂 使用量 Oligo dT Primer 50 M 1 0 l dNTP Mixture 10mM each 1 0 l 模板 RNA 5 0 g 4 0 l RNase Free dH2O UP to 10 0 l 2 65 保温 5min 后 冰上迅速冷却 注 上述处理可使模板 RNA 变性 提高反转录效率 3 在 1 步骤的 Microtube 管中配制下列反转录反应液 总量为 20 0 l 试剂 使用量 上述变性后反应液 10 0 l 5 PrimeScript Buffer 4 0 l RNase Inhibitor 40U l 0 5 l 20U PrimeScript RTase 200U l 1 0 l 200U RNase Free dH2O UP to 20 0 l 4 缓慢混匀 5 按下列条件进行反转录反应 42 60min 95 5min 冰上冷却 6 第一链 cDNA 保存于 20 备用 2 PCR 反应体系和条件如下 1 在 Microtube 管中配制反应体系如下 试剂 使用量 南京医科大学硕士学位论文 20 Premix Ex Taq 12 5 l 1st Strand cDNA 1 0 l 上游引物 20 M 1 0 l 下游引物 20 M 1 0 l RNase Free dH2O 9 5 l Total volume 25 0 l 2 PCR 扩增条件 长链非编码 RNA630 98 预变性 1min 然后 98 变性 30s 64 退火 30s 72 延伸 2min 热循环 变性 退火和延伸 35 次 最后 72 延伸 7min 4 GAPDH 98 预变性 1min 然后 98 变性 30s 58 退火 30s 72 延伸 1min 热循环 变性 退火和延伸 35 次 最后 72 延伸 5min 4 3 PCR 扩增产物在 1 2 琼脂糖凝胶上电泳鉴定 三三 长链非编码长链非编码 RNA630 的功能研究的功能研究 1 靶向长链非编码靶向长链非编码 RNA630 的小干扰的小干扰 RNA 的设计与合成及细胞转染的设计与合成及细胞转染 1 使用 Clontech Corporation的在线设计程序设计 5 条靶向长链非编码 RNA630 的小干扰 RNA 寡核苷酸序列 寡核苷酸链由广州锐博生物技术有限公司合成 siRNA 1 sense5 CCGAGGUUAGAACACACAA dTdT 3 antisense5 UUGUGUGUUCUAACCUCGGTdTd 3 siRNA 2 sense5 CCUUUACAAGUGUCUGUAA dTdT 3 antisense5 UUACAGACACUUGUAAAGGTdTd 3 siRNA 3 sense5 GGCCGCUAAGCACUUGAAA dTdT 3 antisense5 UUUCAAGUGCUUAGCGGCCTdTd 3 siRNA 4 sense5 GGUGCAUGAUCGCCGAAUA dTdT 3 antisense5 UAUUCGGCGAUCAUGCACCTdTd 3 siRNA 5 sense5 GCAUGAUCGCCGAAUAAAU dTdT 3 antisense5 AUUUAUUCGGCGAUCAUGCTdTd 3 2 每 1nmol 的 siRNA 冻干粉加无菌无 RNA 酶的水稀释成 20 M 的储存液 分 装后于 20 保存 备用 南京医科大学硕士学位论文 21 3 小干扰 RNA 转染 Jurkat 细胞 用脂质体 Lipofectamine 2000 进行转染 参照转染试剂说明书优化转染条件 具体转染步骤如下 1 转染前 24 小时细胞全量换液 细胞培养液不含抗生素 转染当天收集 Jurkat 细胞并计数 用 RPMI1640 培养液调节细胞密度为 4 105 ml 接种于 6 孔板 每 孔加 1 5ml 细胞悬液 2 配制 siRNA 脂质体溶液 A 液的配制 10 l 的 Lipofectamine 2000 240 l 的 RPMI1640 培养基 B 液的配制 5 l 的 siRNA 250 lRPMI1640 培养基 轻轻混匀 B 液配制 5min 后与 A 液充分混匀 室温静置 20min 3 将步骤 2 中混合液均匀滴加至细胞培养孔 置于 5 CO2 37 细胞培养箱培 养 4 转染后 6 小时细胞换液 细胞超净台中紫外灯下照射保鲜膜 20min 保鲜膜将六孔板包紧 然后将六 孔板置于水平离心机 室温 1000rpm 离心 5min 小心的将六孔板从离心机中 取出 去除保鲜膜 75 乙醇擦拭六孔板表面 于细胞超净台中轻轻的吸掉 RPMI1640 培养液 每孔加入 2ml 含 10 胎牛血清的细胞培养液 轻轻吸吹 悬 浮细胞沉淀 将六孔板置于 5 CO2 37 细胞培养箱培养 分别于转染 24 48h 后收细胞进行 mRNA 表达量的检测 转染 48h 后流式细胞仪检测细胞凋亡 细 胞周期 2 实时荧光定量实时荧光定量 PCR 验证验证 siRNA 转染后转染后 Jurkat 细胞细胞长链非编码长链非编码 RNA630mRNA 水平表达量的变化水平表达量的变化 1 于转染后 24 提取各实验组细胞总 RNA 基本步骤同 二 3 部分 2 第一链 cDNA 的合成 1 在 Microtube 中配制反应体系 试剂 使用量 南京医科大学硕士学位论文 22 5 PrimeScript Buffer 2 0 l Total RNA 1 0 l RNase Free dH2O 7 0 l Total volume 10 0 l 2 轻轻混匀后 置于 PCR 仪进行逆转录反应 反应条件如下 37 15min 反转录反应 85 5sec 反转录酶失活反应 4 结束 获 得的第一链 cDNA 保存于 20 备用 3 实时定量 PCR 反应体系和 PCR 条件如下 1 在冰上配制 PCR 反应体系 试剂 使用量 SYBR Premix EXTaqTM 2 10 0 l PCR Forward Primer 10 M 0 4 l PCR Reverse Primer 10 M 0 4 l ROX Reference Dye 50 0 4 l cDNA 模板 稀释后 2 0 l ddH2O 灭菌蒸馏水 6 8 l Total volume 20 0 l 2 轻轻的混匀 瞬时离心 一个样品设置 5 个副孔 3 PCR 反应条件 95 0 预变性 30sec 95 0 变性 5sec 60 0 退火 30sec 共 40 个循环 最后 95 0 15sec 60 0 1min 95 0 15sec 结束 4 实时定量 PCR 检测各实验组长链非编码 RNA630 mRNA 的表达水平 5 各组样品分别进行 Real time PCR 反应 以 actin 做为内参照 利用溶解曲线 验证 PCR 反应的特异性 读取 CT 值 根据 2 CT法计算靶基因的扩增比例 CT 值 目的 CT 值 actin CT 值 3 CCK8 法检测转染法检测转染 630 siRNA 对对 Jurkat 细胞增殖的影响细胞增殖的影响 1 实验分组如下 1 空白对照组 Control 2 630 siRNA 组 南京医科大学硕士学位论文 23 2 细胞转染 1 转染当天取对数生长期的 Jurkat 细胞 使用 RPMI1640 培养基调整细胞密度 为 8 104 ml 每孔 50 l 细胞悬液接种于 96 孔板 2 按以下步骤准备混合液 a 稀释 siRNA 用 25 l RPMI1640 培养基稀释 0 5 l 20 M 的 siRNA 储存液 轻轻混匀 室温孵育 5min b 稀释 Lipofectamine 2000 用 25 l RPMI1640 培养基稀释 0 25 l Lipofectamine 2000 轻轻混匀并室温孵育 5min 3 将 a 与 b 的混合液加入含有细胞的 50 l 培养基的培养孔中 轻轻混匀 每 组设置 4 个复孔 4 空白对照组加入 50 lRPMI1640 培养基 轻轻混匀 设置 4 个复孔 5 96 孔板的最外一周孔中加入 100 l 的无菌 1 PBS 缓冲液 6 然后将 96 孔板置于置于 5 CO2 37 细胞培养箱培养 6 小时 6 小时后换 含有 10 胎牛血清的细胞培养液继续培养 3 分别于转染 24h 48h 和 72h 后从培养箱中取出一块 96 孔板 每孔加入 10 l CCK8 试剂 轻轻混匀 37 条件下孵育 2h 孵育时间到后 用全自动酶标仪 检测 A450 的吸光度 OD450 值 计算细胞增殖能力 4 流式细胞仪检测流式细胞仪检测细胞凋亡细胞凋亡 1 实验分组及转染方法同 8 1 2 部分 每个实验组设 3 个复孔 2 转染 48h 后 收集各实验组 6 孔板中的细胞悬液至 2 0mlEP 管 1000rpm 离 心 5min 弃上清 3 用预冷的 1 PBS 缓冲液洗涤细胞 2 次 调整细胞密度至 1 105个 ml 100 l 细胞悬液中加 5 l AnnexinV APC 和 5 l 放线菌素 D 7AAD 混匀 避光 室 温放置 15min 后每个样品加入 400 l Binding buffer 振荡混匀后上机检测细胞凋 亡率 5 流式细胞仪检测流式细胞仪检测细胞细胞周期周期 南京医科大学硕士学位论文 24 1 实验分组及转染方法同 8 1 2 部分 每个实验组设 3 个复孔 2 转染 48h 后 收集 6 孔板中的细胞悬液至 2 0mlEP 管 1000rpm 离心 5min 弃上清 3 1 PBS 缓冲液洗涤细胞 2 遍 4 弃上清 加入 1ml75 乙醇固定 5 20 条件下 固定 24h 6 1500rpm 离心 3min 弃上清 7 加入 1ml 1 PBS 洗涤 1 次 加 100 l 1 PBS 缓冲液重悬细胞 然后加入 1 0 l 10mg l 的 RNaseA 37 孵育 30min 8 加入 300 l 浓度为 50 g ml 的 PI 染色 20min 上机检测 6 长链非编码长链非编码 RNA630 过表达对过表达对 Jurkat 细胞耐药的影响细胞耐药的影响 1 pEGFP C1 630 真核表达质粒的构建 由广州市锐博生物科技有限公司完成 设计 PCR 扩增引物 PCR 扩增基因的 CDS 序列 割胶纯化回收目的片段 酶切后