基因表达沉默技术.ppt

1 药学系药物基因组学教研室2010 06 18 基因表达沉默技术 2 教学内容及要求 1 2 3 4 反义核酸技术 核酶技术 基因敲除技术 RNA干扰技术 重点 熟悉 3 参考资料 基因工程及其分子生物学基础 基因工程分册 北京大学出版社 静国忠编自备材料 个人实践经验 4 第一节RNA干扰技术 5 掌握 RNA干扰 RNAinterference RNAi 由小双链RNA诱发的 同源mRNA高效特异性降解的现象 小干扰RNA 具有干扰功能的这种短双链RNA就称为小干扰RNA SmallinterferingRNA siRNA 6 注射 sense 秀丽线虫 antisense 1995年 7 反义RNA antisenseRNA 对基因抑制效应比较微弱 而双链RNA dsRNA 能够高效特异性阻断靶基因的表达 animportantfinding 1998年 8 CraigC Mello克雷格 梅洛 AndrewZ Fire安德鲁 菲尔 2006NobelPrizeinPhysiologyorMedicine 9 随后陆续发现RNAi也存在于水稻 烟草 果蝇 小鼠及人等几乎所有的真核生物中 10 靶 siRNA在ATP参与下形成RISC复合体 被RNA解旋酶解旋成单链 并由其中的反义链指导移至靶mRNA 靶mRNA被切割后诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应 外源长dsRNA在ATP作用下被RNase Dicer切割成21nt左右 由正义和反义链组成的siRNA 重点 11 siRNA 21nt 难点 12 1 靶序列的调出 http www ncbi nlm nih gov NationalCenterforBiotechnologyInformation 13 14 15 2 利用免费设计软件进行siRNA设计 InvitrogenTakaraOligoegine 16 软件的选择原则 1 选择可读框内 翻译起始位点之后50 100nt的序列作为靶序列 2 选择的靶位5 端之前的两个碱基为AA 3 GC含量控制在35 65 最好50 左右 4 碱基数目控制在19 21nt 5 避免连续3个或3个以上的相同碱基 6 避免重复序列或回文结构以免形成发夹状结构 7 靶序列同数据库进行BLAST同源性比对 17 我用的软件 siDirect 18 3 siRNA合成或表达 RNA聚合酶 启动子 包括U6或H1 转录起始点明确 转录生成小RNA 转录产物无polyA尾 转录终止为5个连续的U 19 20 21 22 3mg ml正向引物1 l3mg ml反向引物1 l 90 C4min 70 C10min 室温 订购合成的引物序列退火 23 4 siRNAworking 24 mRNA Real timePCRProtein Westernblot 17siRNAMock 25 5 合成or构建载体 化学合成siRNA 瞬时转染实验花费高使用的时候 要用二乙基焦碳酸酯 DEPC 处理过的灭菌蒸馏水溶解 这是因为siRNA易被RNA酶降解 B 载体 为了长期观察基因沉默后的影响 需要长期表达siRNA C 载体选择 易转染的细胞用质粒载体 难转染的细胞用逆转录载体或慢病毒载体 26 6 体外导入细胞 a 脂质体转染 具体操作步骤 按照脂质体说明书进行 27 b 电穿孔导入 28 c 病毒感染 以腺病毒为例 29 next 30 第二节反义核酸技术 31 1978年 Stephenson和Zamecnik首次报道了反义寡脱氧核苷酸可抑制劳斯肉瘤病毒RSV的复制现象 1984年 Izantweintraub提出了 反义核酸技术 的概念 InhibitionofRoussarcomaviralRNAtranslationbyaspecificoligodeoxyribonucleotide ProcNatlAcadSciUSA 1978 75 285 288 32 反义寡核苷酸概念 正义链互补的一段核苷酸序列 包括反义DNA和反义RNA 反义RNA技术 反义DNA技术 33 直接作用于靶mRNA的SD序列或部分编码区 直接抑制翻译 或与靶mRNA结合形成双链RNA 从而易被RNA酶H降解 反义核酸 mRNA RNaseH 34 论著超过 篇 基因功能研究 1994年流行 如抗病毒或抗肿瘤基因治疗研究等领域 35 1998年8月27日 美国食品药品管理局 FDA 正式批准了由ISIS公司开发的全球第一个反义药物 Vitravene 福米韦生 fomivirsen 在美国上市 该药抗病毒作用较强 是更昔洛韦的1000倍 用于治疗巨细胞病毒性视网膜炎和艾滋病人并发巨细胞视网膜炎 有效率高达80 90 Vitravene为注射剂 患者每月只需注射一次药物 利用专用针头直接注射进眼球内 不良反应有虹膜炎 玻璃体炎 发生率为25 用糖皮质激素治疗可缓解或消除其炎性反应 2 个硫代磷酸酯寡聚脱氧核苷酸组成 36 a 避免内源性核酸酶对其降解b 提高自身稳定性以及与靶分子的亲和力 H deoxyribose 提高有效性 技术难点 修饰 37 第一代硫代修饰 Phosphorothioate ResistingToNucleases ActivatingRNaseHpathways O 38 第二代修饰 2 O methyl 2 O methoxyethyl ResistingToNucleases notactivatingRNaseHpathways 39 2001主要用于治疗老年人中十分常见的视网膜黄斑退化症 Macugen哌加他尼 40 2003新一代抗HIV新药 属于病毒的融合阻止剂类药物 Fuzeon 20570 41 Tysabri 2004专治多发性硬化症 42 next 43 第三节核酶技术 44 核酶 ribozyme ribonucleicacidenzyme具有催化活性的RNA 化学本质是RNA 却具有酶的催化功能 45 切赫 T R Cech 1947 美国人 他独立地发现发现四膜虫转录产物rRNA前体 可切除自身的413个核苷酸的内含子 使两个外显子拼接起来 变成成熟的rRNA分子 ThomasR Cech 1982 46 S Altman研究发现发现大肠杆菌RNaseP的蛋白质部分除去后 留下RNA能够切割rRNA前体的5 端 1983 47 1989NobelPrizeinChemistry 核酶的发现改变了 所有酶都是蛋白质 的传统观念 48 有封闭切割RNA 1994年左右比较流行的研究工具 49 通常由60个核苷酸左右组成 底物部分 含有GU序列 保守序列 13个碱基 锤头状核酶结构示意图 50 next 51 第四节基因敲除技术 时间 80年代末功能 建立基因失活或缺失的动物模型 52 a 胚胎干细胞 embryonicstemcell ES 分离培养 取自小鼠受精卵发育第4 5天的胚胎细胞能在体外培养 保留发育的全能性 1981年 马丁 埃文斯 MartinJ Evans 从正常的小鼠囊胚中分离到了ES细胞 小鼠ES细胞的分离和应用是ES细胞技术发展的里程碑 53 同源重组 是指发生在减数分裂或者有丝分裂过程中相同或者相似DNA序列间的重组 通常通过一对同源分子非姊妹染色体间的断裂而产生新的重组片段 b 同源重组技术应用 54 1985年 奥利弗 史密塞斯 OliverSmithies 等首次报道在肿瘤细胞中实现了人工打靶载体和内源 球蛋白基因间的同源重组 55 1988年 卡佩基安德等发展了一种称为 正负筛选 的策略 将胸腺嘧啶激酶基因 tk 置于打靶载体的外侧 作为筛选的负性标记 这比单用阳性筛选正确克隆富集的倍数高3 10倍 真正使得同源重组技术得以应用 马里奥 卡佩基安德 MarioR Capechiand 丙氧鸟苷 56 MartinEvans马丁 埃文斯 Mar