提取DNA纯度.doc

试剂盒特点: 经过特殊处理的纯化柱能有效的去除杂质和腐殖酸。 兼容性强，适用于各种不同的粪便。 不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。 快速，简捷，单个样品操作一般可在60分钟内完成。 高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.71.9，长度可达50kb以上，可直接用于PCR，1.DNA 提取中会污染任何物质 蛋白 糖类 RNA等。其纯度一般用核算吸收OD260/OD280（蛋白质污染）分析判断，纯DNA比值为1.8。此外用OD280/OD230估计盐离子是不是太高。5.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不纯，含有蛋白质等杂质。在这种情况下，应加入SDS至终浓度为0.5%，并重复步骤28。你取出1微升或2微升，用EB稀释100倍或50倍到100微升，OD260/280的比值在1.8-2.0是比较理想的，代表你的DNA纯度很高。波长260nm时，1OD值相当于双链DNA浓度为50g/ml，算一下，再乘以你的稀释倍数，就是浓度了紫外吸收检测DNA浓度与纯度2007年11月13日 星期二 11:40目的： 了解紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原理，掌握测定方法。原理： 核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm，在波长260nm时，1OD值相当于双链DNA浓度为50g/ml，单链寡核苷酸的含量为30g/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值（OD260/OD280），估计核酸的纯度。纯净DNA的比值为1.8, RNA为2.0。若比值高于1.8说明DNA样品中的RNA尚未除尽，若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。 紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25g/ml的核酸溶液，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。试剂与仪器： 提取的质粒DNA，紫外分光光度仪。操作步骤：1) 分光光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。2) 取质粒DNA样品2l，用水稀释100倍，转入分光光度计的石英比色杯中。3) 在260nm和280nm分别读出样品光密度值。如果样品浓度单位为g/l，则样品DNA浓度为OD 值的10倍，即如OD260=0.1，则样品浓度即为1g/l。4) 若OD260/OD280大于1.8，说明仍有RNA，可以考虑用RNA酶处理样品，若小于1.8，说明样品中含有蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化DNA。先说下吸光度和比值的意义。A280nm 是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。比值=1.5相当于50蛋白质/DNA溶液；A230nm 是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA和 RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。A230产生负值主要是由于在很低DNA 浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。在下一个测定中，需要降低样品的稀释度，A230的负值会被校正。 A260/A280和A260/A230 是核酸纯度的指示值，纯度好的DNA，在pH7-8.5 下其比值应该在2.0 或2.5，A260 / A280的比值， 用于评估样品的纯度， 因为蛋白的吸收峰是280 nm。 纯净的样品比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。 A230是多肽、芳香基团、苯酚和一些碳氢化合物的吸光度，A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0 。A280是蛋白质的吸光度。 我的建议：将所提取的DNA跑琼脂糖凝胶电泳，然后回收纯化一下。 另提供一种CTAB改进法配方： 组份 Tris-HCl （pH8.0） EDTA （pH8.0） NaClCTABPVP40-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM1.4M 3%(W/V) 5%(W/V) 2%（V/V）使用前加入A260/A2801.8时，蛋白质含量偏高；1.8A260/A2802.0时，样品较纯； A260/A2802.0时，表明RNA或DNA碎片较多。PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。希望对你有所帮助！首先：可以通过分光光度计 A 260 / A 280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是 280 nm。纯净的样品，比值大于 1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于 1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A 230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸 A 260 / A 230 的比值大于 2.0。A 320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A 320 一般是 0。 若要判断完整性-可以先做琼脂糖凝胶电泳，再做限制酶切（要求更高）(三）DNA定量和电泳检测1.DNA定量： DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50g/ml双链DNA。如用1cm光径，用 H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50OD260读数稀释倍数/1000。 DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。【摘要】目的提取高质量的高良姜基因组DNA，用于药材分子鉴定、分子系统分类和分子进化等下游分子生物学研究。方法在CTAB改良法基础上，采用4个方案提取DNA。结果用改良CTAB法方案4提取的基因组DNA 的OD260/OD280比值在1.82.0之间，产率为0.541.049 g/ mg干燥叶片。基因组DNA能被限制性内切酶EcoR和Mse 完全酶切，经AFLP分析，得到了条带清晰的DNA指纹图谱。结论 用改良CTAB法方案4提取的基因组DNA纯度高，符合分子生物学研究要求。 【关键词】高良姜； 基因组DNA； 提取Abstract:ObjectiveTo develop a method to prepare high quality genomic DNA of A. officinarum Hance for downstream molecubiological research. MethodsFour protocols based on modified CTAB method was performed to extract genomic DNA from A. officinarum Hance. ResultsThe OD260/OD280 ratios of genomic DNA extracted with the fourth protocol of modified CTAB method ranged from 1.8 to 2.0, the yields of DNA sample were in the range of 0.541.049 g/mg dried leaf tissue. DNA samples were completely digested with restriction enzymes ( EcoR and Mse ) and were successfully used for AFLP. ConclusionThe DNA samples extracted with the fourth protocol of modified CTAB method are with high quality and suitable for molecubiological research.Key words:Alpinia officinarum Hance; Genomic DNA; Extraction 高良姜Alpinia officinarum Hance是姜科山姜属植物，在中国主要分布于广东、海南、台湾、云南和广西(后两省为引种)。高良姜干燥的根茎是著名的十大南药之一，有一千多年药用历史，据中国药典记载，高良姜味辛、性热，归脾、胃经，具有温胃散寒、行气止痛和消食的功效1，研究表明高良姜还有广泛的药理作用2，在香料生产和水果保鲜上也有应用 3，4。长期的采挖和生态环境破坏，导致高良姜野生资源骤减，目前主要通过无性繁殖的方式进行人工栽培。近年来，国际市场对高良姜需求增大，国产高良姜远销中东和欧美，价格呈上升趋势，利益的驱动导致了混淆品和伪品的出现，影响了治疗效果，扰乱了市场，对高良姜的出口造成了负面影响。通过DNA分子标记技术建立高良姜的DNA指纹图谱，以及进行高良姜的分子系统分类、分子进化和遗传多样性研究，可以为高良姜的药材的分子鉴定和质量控制，以及高良姜种质资源保护和开发提供科学依据，而提取高质量的高良姜基因组DNA是进行下一步研究的前提条件。 植物含有丰富的次生代谢物，这些化合物的存在干扰了基因组DNA的提取，不同的植物含有的次生代谢物不一样，基因组DNA的提取方法有所不同，主要有CTAB法和SDS法两种基本方法，并在此基础上进行改良以适合不同的植物57。本研究根据常规的CTAB法8进行改良，比较了4个方案提取高良姜基因组DNA的效果，其中，方案4提取效果较好，DNA纯度和产率较高，可以用于下游的分子生物学研究。1 材料与方法1.1试剂和溶液CTAB，PVP-40，Tris为Genview分装，-巯基乙醇、RNAse A为sigma分装，EDTA、氯仿、异戊醇、异丙醇和无水乙醇为国产分析纯，EcoR和Mse 为NEB产品，Hind marker和DL2000 marker为Takara产品。 清洗缓冲液： 200 mmol/LTris-HCl (pH8.0)；50 mmol/L EDTA；250 mmol/L NaCl；2%PVP-40(W/V) 提取缓冲液A： 2%CTAB (w/v)；100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）；20 mmol/L EDTA（pH8.0）；1.4 mol/L NaCl；2% PVP-40(W/V) 提取缓冲液B：2%CTAB (w/v)；100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）；20 mmol/L EDTA（pH8.0）；4 mol/L NaCl；2% PVP-40(W/V) 提取缓冲液C：3%CTAB (w/v)；100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）；20 mmol/L EDTA（pH8.0）；1.4 mol/L NaCl；2% PVP-40(W/V) 10%CTAB溶液：10%CTAB；0.7 mol/L NaCl TE缓冲液：10 mmol/L TrisHCl（pH 8.0）；1 mmol/L EDTA（pH 8.0）以上溶液都经高压灭菌，备用。1.2仪器115K高速冷冻台式离心机(Sigma)，D/U 530 DNA/Protein Analyzer (Beckman)，Model 200/210 Power Supply (BioRad)，DYCP31D型水平电泳槽(北京市六一仪器厂)，White/UV Transilluminator凝胶成像仪。1.3材料试验材料采自广东的广州、深圳和徐闻、海南万宁、广西南宁、云南西双版纳等地，经过中国科学院华南植物研究所邢福武教授鉴定为植物高良姜（A. officinarum Hance）。 采摘高良姜顶端嫩叶，剪为约2 cm长的小段，放入装有干燥硅胶的密封袋中进行快速干燥，硅胶与叶子的体积比大约为101，硅胶吸水变色时要更换硅胶，干燥叶片保存在密封的塑料袋中置于-20保存。1.4 提取DNA的步骤1.4.1称取50 mg左右的干燥叶片，剪碎后放入研钵中添加液氮研磨成粉末状，迅速转移到2 ml的离心管中。1.4.2加入800 l 65预热的CTAB提取缓冲液和20 l -巯基乙醇混匀，置65水浴1 h（每隔10 min颠倒G1次使溶液混匀），待溶液冷却置室温。1.4.3加入等体积的氯仿/异戊醇（241），充分颠倒混匀5 min，12 000 r/min离心10 min，用剪去尖端的1 ml吸头小心吸取DNA水相转入另一2 ml离心管中。1.4.4加入0.1体积10%CTAB溶液和等体积的氯仿/异戊醇（241），颠倒混匀， 12 000 r/min离心10 min，吸取DNA水相转入另一2 ml离心管。1.4.5重复步骤“1.4.3”，把DNA水相转入1.5 ml的Axygen离心管中。1.4.6加入0.6体积预冷的异丙醇，颠倒混匀，置于-20放置30 min，沉淀DNA， 6 000 r/min离心10min，去除上清液。1.4.7DNA沉淀先后用1 ml 70%乙醇和90%乙醇浸泡洗涤5 min，6 000 r/min离心10 min，去除上清液。1.4.8DNA沉淀在超净工作台中自然风干，用50 l TE溶解DNA，加入5lRNAse A（10 mg/ml）于37中水浴2 h以上，DNA样品保存于-20备用。1.5提取DNA的方案1.5.1方案1步骤“1.4.2”加入提取缓冲液A。1.5.2方案2步骤“1.4.2”加入提取缓冲液B。1.5.3方案3步骤“1.4.2”加入提取缓冲液C。1.5.4方案4在步骤“1.4.1”之后向离心管中加入1 ml清洗缓冲液，混匀并放置510 min，8 000 r/min离心10 min，去除上清液，然后步骤“1.4.2”加入取缓冲液A。1.6 DNA浓度、纯度的测定1.6.1紫外分光光度计检测把DNA溶液稀释20倍，用紫外分光光度计中测定其在230，260和280 nm的OD值，根据OD260/OD280、OD260/OD230判断DNA的纯度，计算DNA的浓度和产率。 DNA的浓度（ng/l）OD26050 ng/l稀释倍数 DNA产率DNA浓度（ng/l）DNA原液体积（l）/干叶重量/mg1.6.2琼脂糖凝胶电泳用超纯水把DNA稀释到50 ng/l，吸取5 l DNA 与1 l上样缓冲液混匀，在0.8%的琼脂糖凝胶上80 v电泳30 min，在UVP成像仪上观察和拍照。1.6.3限制性内切酶酶切取6 l基因组DNA（50 ng/l）用限制性内切酶EcoR和Mse 酶切3 h，在1.6%脂糖凝胶上100 v电泳30 min，然后在UVP成像仪上观察和拍照。1.6.4AFLP分析DNA经EcoR和Mse 双酶切后，与EcoR接头和Mse 接头连接，接着进行预扩增、选择性扩增、6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染，获得AFLP图谱，扫描保存图谱。2结果与讨论 从植物组织中提取DNA必须除去蛋白质、RNA、多糖、多酚等杂质，尤其是多糖和多酚，它们的存在会严重抑制限制性内切酶和TaqDNA聚合酶的活性9，10，影响后续的研究。DNA的纯度可以从OD260/OD280比值和OD260/OD230比值来判断。DNA在260 nm处有吸收峰，而蛋白质在280 nm处有吸收峰，理论上OD260/OD2801.8时表示DNA纯净，OD260/OD2801.8时表示有蛋白质污染，OD260/OD2801.8时表示有RNA污染，在230 nm处有吸收表示有多酚和色素污染11。 用4种方案提取的DNA经紫外分光光度计检测显示（表1），用方案1和方案4提取的DNA产率都比较高，在0.451.05 mg/g之间，方案1提取的DNA的OD260/OD280比值在1.8571.998之间，说明蛋白质去除得比较干净，而OD260/OD230比值在1.3491.843之间，表示有少量的多酚和色素的污染；方案4提取的DNA的OD260/OD280比值在1.8351.909之间，OD260/OD230比值在1.7662.285之间，表示蛋白质去除得比较干净，多酚和色素的污染极少；方案2和方案3提取的DNA的产率都很低，在0.020.08 mg/g 之间，OD260/OD280比值分别小于1.642和1.027，OD260/OD230比值的范围为0.3390.953，说明DNA有较多的蛋白质污染，多酚和色素污染严重。表1不同提取方案提取DNA的效果比较（略） 从琼脂糖凝胶电泳结果来看，方案1提取的DNA主亮带清晰且没有明显拖尾现象，但是加样孔较亮（图1 A），说明DNA较完整，但是多糖没有去除干净。方案2和方案3提取的DNA，未见有DNA亮带（图1 B），说明DNA含量很低，与分光光度计检测结果一致。方案4提取的DNA主亮带清晰，没有拖尾，加样孔比较干净（图1 C），表面DNA完整且纯度高。 用方案4提取的基因组DNA经EcoR和Mse 酶切，在1.6%脂糖糖凝胶上条带呈均匀的弥散状条带（图2），说明DNA被完全酶切，做AFLP分析能够得到清晰的多态性条带（图3），以上结果进一步表明，用方案4提取的DNA纯度较高，符合分子生物学研究的要求。 我们用方案4提取了采自广东、海南、广西、云南等地170多份高良姜的基因组DNA，都取得了较好的效果，OD260/OD280比值在1.82.0的范围内，OD260/OD230比值大部分大于1.7，小部分OD260/OD230比值在1.7以下，可能是由于野外采集时，用干燥硅胶处理样品时没有及时更换，导致叶片褐