二元致孔剂微电渗流电泳柱的制备及性能考察.doc

二元致孔剂微电渗流电泳柱的制备及性能考察项目完成单位：国家色谱研究分析中心项目完成人：张凌怡 平贵臣 张丽华 张维冰 张玉奎摘 要 采用二元致孔剂原位聚合的方法合成了一种新型微电渗流毛细管电泳原位柱。与三元致孔剂的方法相比，它具有制备过程简单、重复性好以及柱床的孔径和孔结构易于调节等特点。得到的毛细管柱内部结构均匀，通透性好。系统地研究了各种参数对孔结构及电渗流的影响，结果表明制备的原位柱在较大pH值和有机改性剂浓度条件下，电渗流均能保持在较低值，可以适应不同电泳分离模式的需要。关键词 原位聚合；微电渗流毛细管柱；致孔剂；电渗流1 引 言整体材料是近年来发展起来的一种新型分离介质，已被应用于色谱、毛细管电泳等多种分离模式，被誉为第四代填料1。基于这种材料的原位柱技术已引起色谱工作者的广泛关注。原位柱分为聚合物原位柱2-19和硅胶原位柱20两类。聚合物原位柱在制备时选材范围广，可以使分离柱具有不同的选择性，并且适用的pH范围宽。较传统填充柱和开管柱具有诸多明显的优点。聚合物原位柱的制备通常是将单体、引发剂、致孔剂和电渗流产生剂等混合后置入内表面经过处理的毛细管中。在适当条件下引发反应，使其在毛细管内形成具有一定孔结构的整体床层，作为分离介质实现对不同性质样品的分离分析。然而电渗流的存在可能对分离产生负面影响。例如，在毛细管等电聚焦中，电渗流是导致聚焦区带展宽的主要原因之一。微电渗流整体柱是最近才提出的一种新型分离柱。2001年Wu等15在Anal. Chem.上发表了第一篇相关的研究论文，之后他们又对此作了系列的研究工作16-18。实际上，微电渗流柱即是在原来正常整体柱的基础上，在制备过程中不加入相应的电渗流产生剂而得到的具有特殊孔结构和表面性质的分离柱。我们最近的研究也表明19这种柱具有多种功能，可应用于毛细管区带电泳、毛细管电色谱、毛细管等电聚焦等多种分离模式。在正常整体柱的制备过程中，通常采用包括水在内的三元致孔剂。其中，水主要作为电渗流产生剂的载体。尽管微电渗流柱仍沿用一般整体柱的制备方法，但在制备过程中水的作用已无意义。同时由于水的强极性和可形成氢键的性质也可能会对微电渗流柱的功能产生影响。本文设计了一种采用无水的二元致孔剂制备微电渗流柱的方法。与三元致孔剂的方法相比，具有制备过程简单、重复性好的优点。此外，还能够通过调节致孔剂配比方便地改变柱床的孔径和孔结构。2 实验部分2.1 仪器与试剂Beckman P/ACE System 5010毛细管电泳仪（Beckman公司，美国）；熔融石英毛细管27cm（有效长度20cm）75m i.d.375m o.d.(河北永年光导纤维厂)。甲基丙烯酸丁酯（BMA），乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA），1，4-丁二醇（Fluka化学公司）；-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷正丙醇（MAPS） (Acros化学公司)；正丙醇（天津博迪化学试剂公司），偶氮二异丁腈（AIBN）（上海试剂四厂）；磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，丙酮，硫脲（沈阳联邦试剂厂）；乙腈（上海陆都实业有限公司）为色谱纯，其他试剂均为分析纯。2.2 电泳条件压力进样(0.5psi,20s)，温度20，检测波长214nm，操作电压10kV，数据采集频率16Hz。电渗流标记物采用硫脲和丙酮。2.3 毛细管的预处理采用文献2-4的处理方法，将毛细管柱依次用稀HCl、稀NaOH冲洗30min，再用水洗至中性。氮气吹干后，用30%(w/w)的-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷（丙酮溶液）充满。封口并放置24h后，用丙酮清洗除去过量的-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷，再用水清洗后氮气吹干备用。对毛细管内壁进行预烯基化处理，即在毛细管内壁上键合上一层带烯基官能团的硅烷化试剂。通过硅烷化试剂的双官能团将毛细管内壁上的硅羟基和原位柱柱床以化学键间接键合，达到固定柱床和尽量覆盖管壁上能够产生电渗流的硅羟基的目的。由于毛细管表面的硅羟基密度直接影响到电渗流的性质，因此在微电渗流柱的制备过程中，毛细管的预处理效果对最终结果的影响非常大。2.4 整体柱的制备参考文献59的方法制备整体柱。将双甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯、不同配比的二元或三元致孔剂混合，充入经双官能团试剂处理过的毛细管中。由偶氮二异丁腈（0.3%w/w）引发聚合反应，在60下反应20h。将聚合完成后的毛细管柱取出后切去两端，用乙腈冲洗，洗去柱内致孔剂和残余的反应试剂。更换流动相时，应先用流动相冲洗30min，再用分离电压平衡10min后进行测定。3 结果与讨论3.1采用二元与三元致孔剂制备的原位柱的性能对比由于所要制备的原位柱由不能够解离的BMA和EDMA共聚而成，未加入产生电荷的电渗流产生剂，孔表面不带电荷，电渗流只能够通过柱管表面的残余硅羟基产生，从而得到极小电渗流的分离柱。在三元致孔剂中水是用来溶解作为电渗流产生剂的带电有机聚合单体的溶剂，而制备微电渗流柱时无须加入电渗流产生剂，因此可以将三元致孔剂简化为二元。通过改变致孔剂的比例得到不同孔径大小和孔分布的微电渗流整体柱。聚合反应完成后，多孔聚合物充满了毛细管通道，其端面扫描电镜图如图1、2所示。由图可以看出，虽然正丙醇的比例相同，但是由于致孔剂的组成不同，三元致孔剂中水由1，4-丁二醇代替后，所得到的聚合物呈小颗粒形成的团状。与三元致孔剂所得柱床相比较具有不同的孔径分布、孔结构和比表面积，导致电渗流的不同，甚至可能影响分离过程中溶质和固定相之间的相互作用。图1 三元致孔剂（56%正丙醇）制备原位柱扫描电镜图（5000倍）图2 二元致孔剂（56%正丙醇）制备原位柱扫描电镜图（5000倍）不同致孔剂配比所制备的原位柱电渗流情况如图3所示。由图3可以看出，对于采用三元和二元致孔剂制备的原位柱，随着致孔剂中正丙醇比例的增加，电渗流都逐渐减小，但减小的趋势逐渐减缓，这可能是聚合物柱床的孔径变化造成的。这是由于随着正丙醇比例的增加，聚合物孔径变小，比表面积增大，因而柱内管壁上的硅羟基位点密度变小，进一步导致电渗流减小。当正丙醇比例达到一定数值时，毛细管内表面的硅羟基已基本全部被覆盖，所以电渗流减小的趋势相应减缓。另外随着孔径的减小，毛细管柱内阻力增大也会导致电渗流的减小。然而柱床孔径的减小，会导致通透性下降，操作困难，同时测量电渗流需要的时间较长，误差增大。 图3 三元和二元致孔剂中正丙醇比例对电渗流的影响（柱：75m i.d.20cm/27cm；流动相：乙腈/水=80:20（V/V），1.0 mmol/L；磷酸缓冲溶液，pH 9.8；紫外检测波长：214nm；电压：10kV。）3.2柱长对电渗流的影响根据双电层理论，电渗流的大小与柱长无关。相同分离条件下，正丙醇含量为48%（w/w）二元致孔剂制备的原位柱，柱长为20cm和40cm（有效长度分别为27cm和47cm）的毛细管柱电渗流分别为33.110-10m2v-1s-1和30.810-10m2v-1s-1。这进一步证实了相同条件下电渗流大小与柱长基本无关。电渗流标记物的迁移时间与柱长成正比。尽管长柱的分离能力强，样品负载大，但是对于普通的填充柱来说柱长的增加会导致反压增大，清洗困难。然而原位柱具有良好的通透性，使用长柱，可以获得较高的柱效。3.3毛细管内径与电渗流的关系理论研究表明，电渗流与电势成正比。在其它条件不变的情况下，电势也正比于毛细管壁表面上的电荷密度。不同内径毛细管柱（含56%w/w正丙醇的二元致孔剂制备）的电渗流情况如图4所示，电渗流在11.5510-10 m2v-1s-1-13.2710-10 m2v-1s-1范围内变化。这说明不同管径的毛细管所制备的原位柱电渗流基本相同。 图4 毛细管半径对电渗流的影响（柱：75m i.d.20cm/27cm，二元致孔剂含56%正丙醇，34%1，4-丁二醇；流动相：乙腈/水=80:20（V/V），0.4 mmol/L磷酸缓冲溶液，pH 9.8；紫外检测波长：214nm；电压：10kV。）电泳过程中，热效应是影响分离的一个重要因素。一般来说管径越大，沿管径的温度梯度越大，焦耳热的影响越大。毛细管中心和管壁之间的热梯度与半径的平方成正比，同样电压下，毛细管孔径越小，电流越小，产生的焦耳热越小，表面积与体积的比越大，散热效果越好。管径增大，径向热梯度急剧增大，分离度下降。由图5可以看出管径在50mm-100mm范围内，电流的增加并不显著，而随着管径的继续增大，电流显著增加。这一结论与毛细管区带电泳的规律一致。但是由于聚合物的散热性能较差，毛细管的内径大于100mm时，温度梯度的影响已十分明显，因此一般只能采用内径50mm 和75mm的毛细管柱。图5 毛细管内径与电流的关系（柱：75m i.d.20cm/27cm，二元致孔剂含56%正丙醇34%1,4-丁二醇；流动相：乙腈/水=80:20（V/V），1.0mmol/L磷酸缓冲溶液，pH 9.8；紫外检测波长：214nm；电压：10kV。）3.4 重复性与应用 电渗流测定结果表明同一批次和不同批次的微电渗流原位柱电渗流相对标准偏差分别小于4%和7%，重复性另人满意。 此类微电渗流柱在电色谱中主要应用于带电样品的分离。由于固定相不带电荷，减少了溶质和固定相之间的非特异性相互作用，但是除了电场中的电泳迁移外，溶质在固定相和流动相之间的分配作用仍然存在。图6是使用此种微电渗流柱在电泳驱动下分离六种酸性化合物的分离谱图。从图中可以看出，六种酸性化合物在7min内达到基线分离。图6 六种酸性化合物的电色谱分离谱图4 结 语采用二元致孔剂原位聚合的方法合成了一种新型微电渗流毛细管电泳原位柱。与三元致孔剂的方法相比，具