比较头颅部降温与全身降温对脑缺血再灌注的保护.doc

开题报告家兔头颅局部降温对脑损伤保护作用的探讨02级法文班徐呈 兰晓曦 庞文璟 解轶声 林盟菲 孟晋 方原 吴贻明指导老师 李稻一、实验目的：急性脑外伤的病例在临床上较常见，如何降低脑外伤后继发性脑组织坏死，为治疗争取时间一直是令人感兴趣的事。本实验通过人工冬眠法和物理方法进行头颅的人工降温，比较两种方法对减轻急性前脑缺血时组织损伤的疗效，观察实验动物的中枢神经系统功能变化和全身的代谢状态。二、实验原理：本实验通过三动脉结扎法1（即结扎兔左侧椎动脉和两侧的颈总动脉）来复制急性前脑缺血再灌注模型。在复制病理模型的基础上，经过颅部局部降温和人工冬眠法全身降温处理后，观察动物中枢神经系统的损伤性反应和全身变化。人工冬眠法主要是通过氯丙嗪抑制下丘脑体温调节中枢，使体温调节失灵，从而实施全身的亚低温状态；头颅局部降温法是通过物理方法从外部对脑进行局部降温。在低温处理后，利用中枢兴奋剂尼可刹米兴奋延髓呼吸中枢作用，观察局部和全身的亚低温状态下中枢的应激反应，以及脑组织损伤程度。国内外通常将低温划分为4种不同水平：轻度低温(3235)、中度低温(2832)、深低温(1727)、超深低温(216)，又将轻、中度低温称之为亚低温。目前认为低温对于脑损伤保护主要的作用机制有5-7：(1)减少脑组织蛋白破坏，促进脑细胞结构和功能修复；(2)保护血脑屏障，减轻脑水肿，降低颅内压，改善缺血后低灌注及防止过度灌注损伤；(3)抑制自由基生成，促进自由基的清除；(4)减少兴奋性氨基酸递质(特别是谷氨酸)的释放，抑制兴奋毒性2。 三、技术路线图：Group A（comparison）Without disposalGroup BSelective brain coolingGroup CWinter sleepReperfusion(30 min)Injection of NikethamideModel preparation of cerebral ischemiaCooling ( min)Slice of cerebral tissueAnalysis of target 四、实验动物：家兔三只（要求体重相近，年龄相同，性别不限）五、实验器材：普通温度计（测肛温用）、热敏电阻温度计（测脑温用）、Powerlab生物信号处理系统（包括血压、呼吸、心电图）、高频电刀、i-STAT血液分析仪、脑颅钻孔机（5.0mm，杭州萧山医疗器械厂）、分析电子天平(1/10000克)、普通光学显微镜、兔子手术台、手术器械、气管插管、动脉插管、动脉夹等六、实验药品：戊巴比妥纳（30mg/kg）、氯丙嗪，异丙嗪（非那根）、10%尼可刹米、0.04% 多聚甲醛、生理盐水、冰块（袋装）七、实验操作：1前脑缺血前准备：家兔剃毛后，戊巴比妥纳30mg/kg全麻后，仰卧位固定家兔，先切开兔头顶皮肤，暴露颅骨，于矢状缝左侧0.3cm与眼眶后缘相交点钻一个2mm直径大小的圆孔，深达硬脑膜3。而后，于喉头下缘与第一肋上缘之间沿颈腹正中线作切口，常规分离两侧颈总动脉和气管。1）分离右侧椎动脉：于右侧锁骨下缘分离皮下组织，切口下可见横向分布的胸浅肌，分离结扎后剪断肌束、切口深处可见横向走行的腋静脉和纵向走行的头臂静脉，分开二静脉的汇合处，见白色呈扇形分布的臂神经丛、其中有粉红色搏动的锁骨下动脉，彻底将该动脉与周围组织分离，且要有足够的长度(1.5-2.5cm)并仔细辨认该动脉上的3个分支、其中一支向前内上走行至颈椎旁、即为椎动脉（椎动脉根部距颈根部皮肤表面之垂直距离：右侧约1.5cm，左侧约1.2cm；距锁骨内上方两侧均约1.0cm；距颈前正中线右侧约0.8cm，左侧约0.6cm）因椎动脉位置较深，且与臂神经丛交叉而行，用血管钳和眼科镊仔细分离该动脉约0.2-0.4cm，穿线备用。2）左侧颈总动脉插管，采集动脉取血2ml（标记为A1 B1 C1），连接血压换能器。3）气管插管连接呼吸压力换能器。4）心电图连线： II导联EGG连接(皮下插入针状电极)。家兔的右上肢连接负极（NEG）、左下肢连接正极（POS），右下肢连接地线。将电极连接到生物电导线上并通过生物电放大器连接到Powerlab主机的第4通道上（channel 4）5）测量体温：温度计测量肛温。测量脑温：采用热敏电阻温度计通过开颅孔测量脑温度。6）观察、记录动物瞳孔对光反射情况（在缺血-降温以及再灌注时每隔10min观察一次，在注射中枢兴奋药物后每隔2min，观察一次并记录）。2前脑缺血（持续时间约30min）： 断血时，用动脉夹夹闭右侧颈总动脉。然后将手术台竖立置动物于头高尾低位，头固定于右转后仰位，造成急性不全性前脑缺血，持续时间约30小时。3降温：（持续时间约60min）A组：体温维持正常，随时测量体温B组：头颅敷冰袋进行头部局部降温（用冰袋降温，维持脑温在34-35的亚低温状态，诱导降温至35的时间约为50min10）C组：采用人工冬眠法（冬眠剂+物理降温法）进行全身降温：静脉注射剂量： 氯丙嗪IV 50-100mg/kg.次 * 0.3 * 1/2异丙嗪IV 0.5-1mg/kg.次 * 0.3 * 1/2 在降温过程中，C组的降温速度应尽可能与B组相符合，以保证两组的降温趋势、时间基本一致，排除降温时间不一致而带来的误差。4再灌注： 缺血30min后，放开动脉夹，体位平置，头枕复自然位，使右侧颈总动脉恢复血流，右侧大脑再灌注（灌注过程维持脑降温状态）。再灌注之前采集动脉血2ml，并用肝素抗凝（标记为A2 B2 C2）5注射呼吸中枢兴奋剂：1）脑降温持续60min后，三组同时采血2ml并用肝素抗凝（标记为A3 B3 C3）。2）兔耳缘静脉注射nikethamide（2.5%nikethamide, 50mg/kg）后，观察兔心电、呼吸频率、瞳孔反应、血压等指标。3）15min后三组同时采血2ml，并用肝素抗凝（标记为A4 B4 C4）6甲醛灌注组织固定、开颅取脑、脑组织形态学观察：迅速经左心室注入质量分数为0.04的多聚甲醛溶液。脑组织固定结束后，用颅钻在中线上打孔，用老虎钳钳开，取脑。三组取大脑右半球顶叶皮质和海马作冰冻切片、HE染色后，于光镜和电镜下观察（厚度不超过3cm，宽度及长度不超过栽玻片的长宽（2cm左右）。HE染色后观察脑组织形态。7相关指标测定：（1）大脑含水量测定2：实验结束后取部份前脑（右）即刻在1/10000克分析天平上称湿重，并在烤箱内干燥至恒重，按E1liolt公式计算出脑组织含水量。计算公式为：脑含水量()(湿重 - 干重)/ 湿重 x 100% 4（2）所取血样做血气分析：PH、PO2、PCO2（3）血样中丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的测定：采用血清，利用南京建成生物工程研究所出厂的MDA试剂盒以及SOD试剂盒来测定，具体的操作方法详见说明书。8可能遇到的困难和问题及解决的措施：（1）家兔的椎动脉比较难找，在模型制作上会有一定的困难。（2）药品的剂量我们希望通过预实验来确定。（3）降温的具体时间我们需要通过预实验来确定。八、实验预期结果：（1）Fig-1 ： Cooling curve of brain temperature and anal temperatureTemperature Group A Group B Group C34Time (min)(A) Brain temperature Group A Group B Group CTemperature34Time (min)(B) Anal temperature（2）Table-1: Preparation of cerebral ischemia Cooling Injection of Nikethamide BP R HR PLR BP R HR PLR BP R HR PLR A B C （PLR = pupillary light reflex）（3）Fig-2： （4）Fig-3：Slice of cerebral tissue (H.E coloration)containing water of brain (%) = ( wet weight dry weight ) / wet weight x 100%A % B % C %brain-slice ofgroup Abrain-slice ofgroup Bbrain-slice ofgroup CDescription：- - - - - - - - 注以上的指标分析结果中：（1）Fig-1表示本实验的模型复制成功以及亚低温状态构建成功（2）Table-1以及Fig-2说明反映全身状态（PH、PO2、PCO2）以及反映脑缺血缺氧损伤（MDA、SOD）的指标改变（3）Fig-3说明脑组织形态学改变综合以上指标及其分析，我们认为本次实验将可能获得的结果是：选择性头颅降温治疗比人工冬眠法有更好的疗效，它对机体的副作用更小。九、参考文献：1 王子灿等，家免急性脑缺血再灌注后脑损害的实验研究， 中华神经外科杂志，1989年第五卷第二期，104-1062 林友俊，李劲松等，轻度低温对兔缺血再灌注脑损伤的保护作用，临床神经病学杂志，1996年第九卷第四期，206-2093 陈沛源 李秀珍等，结扎家兔三动脉造成急性不完全性脑缺血模型，中风与神经病杂志 1991年 第8卷，第3期，143-1444 杨于奈 度佩兰等， 免大脑缺血再灌流新模型，中国病理生理杂志，1991：74)， 434-4375高曲文亚低温对脑缺血神经元的保护作用J工国外医学脑血 管疾病分册，1998，6(3)：1451476刘雪乎亚低温治疗脑损伤的应用研究J工国外医学神经病学 神经外科学分册，1997，24(5)：2362387Schwab M，Bauer R，Zwiener U Mild hypothermia prevents the 0ccurrence of cytotoxic brain edema in rats J Acta Neurobiol Exp(warsz)，1998，58(1)：29358 徐 恩， 祁 风等，选择性头颅降