發展操作策略以提昇利用Clostridium acetobutylicum 產氫製程之產量.doc

秦咸隆 周志雄 發展操作策略以提昇利用Clostridium acetobutylicum產氫製程之產量發展操作策略以提昇利用Clostridium acetobutylicum產氫製程之產量秦咸隆 周志雄逢甲大學化學工程研究所摘 要氫氣被認為是乾淨的替代能源之一，利用微生物產氫亦是一項嶄新的技術，一般在微生物產氫的系統中代謝酸的累積影響產氫量的多寡。本研究乃利用厭氧菌種 Clostridium acetobutylicum生產氫氣，探討細胞密度提昇對於產率及產量的關係。由實驗結果發現，經由營養基質的改善及適當的饋料策略能有效提高槽內細胞密度，產率不但可維持在原有的1.9 mole氫氣/mole葡萄糖以上，對總產氫量亦可被有效提升。關鍵字：Clostridium acetobutylicum 代謝酸 饋料策略_周志雄 逢甲大學化學工程研究所教授Tel:(04)2451-7250ext3678E-mail:.tw秦咸隆 逢甲大學化學工程研究所研究生.tw第七屆生化工程研討會論文集1.簡介由於化石燃料 ( Fossile fuel ) 的大量開採，近年來這些含碳燃料包括燃煤、石油經燃燒後所產生的衍生物已對環境造成極大的衝擊，例如二氧化碳與硫氧化物這類物質所造成環境的破壞正困擾著每一個國家，為了在使用能源上可將地球生態的衝擊減到最低，無碳的能源的開發與應用已受到世界各國的重視，氫氣由於其燃燒熱高，氧化燃燒的唯一產物水亦為一乾淨的物質，因此被視為清淨能源的最佳代表，一般在產氫氣的製程上除了使用工業的生產技術外，由於生化法產氫主要乃藉由特定微生物的發酵培養所伴隨產生，可簡化複雜培養系統的設計與操作生產製程上的麻煩，一方面在微生物細胞生長所須的營養成分亦為單純的醣類亦無原料污染的問題，因此近年來這項產氫新技術獲得極大的重視。一般在生化法產氫微生物主要可分為兩大類，第一類是厭氧菌種 (Anaerobic bacteria) ，如Clostridium acetobutylicum (Kataoka et al., 1997)，第二類是光合菌種 (Photosynthetic bacteria) (Asada and Miyake, 1999; Benemann, 1997)，如 Rhodobacter sphaeroides (Eroglu et al., 1999; Yigit et al., 1999)，在厭養產氫菌方面，由於其可代謝環境中的碳源，進行多種代謝反應，這些反應通常都伴隨著 NADH/NAD+ 的能量轉移，因此在代謝過程中同時可釋放出氫氣，目前這方面產率範圍多在 0.51.5 mole氫氣/mole葡萄糖左右 (Kataoka et al., 1997)；而光合菌產氫模式中，利用光照可將有機酸進一部分解後可再釋放出氫氣產率亦達到34.5 mole- 氫氣/mole-VFA (Sasaki et al., 1996)，然而在這兩不同的產氫系統中產率皆不到理論值的50% 極為偏低，主要原因除了細胞在接受基質後並不完全朝向產氫途徑進行，再加上厭氧菌的培養上亦有能受到其他代謝物的抑制，導致產量降低。本研究利用厭養菌株 Clostridium acetobutylicum做為厭氧產氫菌種，首先針對CGM (Clostridium growth medium)培養條件下所產生的瓶頸問題作初步假設，並利用分析的結果進一步地研究細胞生長與代謝環境之相關性，並藉由配方與操作模式的修正以提高此厭氧製程的產氫量。2.實驗方法2.1 菌種活化與培養關於菌株細胞C. acetobutylicum的各種處理和操作過程都是在厭氧箱(Anaerobic chamber) 中進行完成，厭氧箱中必須持續添加包含一定比例之氮氣、氫氣與二氧化碳等混合氣體，並且具有適當的隔絕設備與恆溫培養箱。實驗前，先將儲存於 4C 營養基質 CMM ( Roos et al., 1985) 及欲活化之菌種取出，以滅菌過之竹籤沾取儲存菌液，在固態 CGM 培養基上，快速畫線，於 37C 下靜置培養約 20小時以上，待多株單一菌落形成後，再以滅菌過之竹籤沾取單一菌落細胞轉養至包含 50mL CGM培養液(NH4)2SO4, 2.0; K2HPO4, 1.0; KH2PO4, 0.5; yeast extract, 1.0; tryptone, 2.0; MgSO4, 0.1; CaCl2, 0.01; MnSO4H2O, 0.01; FeSO47H2O, 0.015; CoCl2, 0.002; ZnSO4, 0.02 g/L)培養瓶中。在活化程序之前，除了使用滅菌鍋消毒培養基外，菌種必須於厭氧箱內恆溫 37C培養 18 小時以上即可順利活化並且有大量氣體產生，待菌株生長完全 (OD600=3) 則轉養至發酵槽。細胞濃度以分光光度計來測量。取適量體積的菌液，以0.015 M 的 NaCl 稀釋後，置入波長為 600 nm 的分光光度計中，量測其吸收度 (absorbance)，即 OD600 值，再乘回稀釋倍數，便可得知原菌液之細胞濃度。2.2 發酵槽發酵槽體積1500 ml實際反應體積1000 ml，種子菌液轉養40 ml至發酵槽中並且使用控制器控制發酵槽內之酸鹼度，轉速400 rpm發酵溫度37，並添加適量消泡劑 (Sigma antifoam 289) 以防止氣泡的產生，氣體收集方面採用排水集氣法，利用10升血清瓶收集排出之氣體並準確估計其氣體體積，最後收集之氣體以GC定量分析氣體之組成。3. 分析方法氣體取樣使用氣相層析器( Gas Chromatograph )，TCD ( Thermal Conductivity Detector ) 偵測器及分離管柱 molecular sieve5A，分析管柱溫度40，Carrier Gas氦氣30 ml/min，主要以氫氣為分析對象。溶液分析方面，取菌液於13000g離心下3分鐘取上清液，使用高壓液相層析器 ( High Pressure Liquid Chromatograph ) RI偵測器及管柱HyperRzeXP Carbohydrate H+在恆溫箱65 下分析, Mobile Phase 為0.005 M H2SO4(流率0.6 ml/min)。4.問題討論4.1配方改善一般在CGM的培養環境中產氫量約在600 mmole hydrogen/L左右，由於氫氣的釋放主要是伴隨著Acetate及Butyrate兩成分的產生，因此在提昇產氫量的同時勢必要將Acetate及Butyrate兩成分的濃度的增加，面對大量的代謝酸累積(Butyrate達到15g/L)可能會造成產量的限制。因此在提昇產量的策略上我們主要增加 Tryptone 及 Yeast extract兩成分的濃度以期望細胞能在氮源絕對充足的條件下能改善其生理狀態，以面對抑制環境下能延續產量。實驗將CGM所含Tryptone及Yeast extract兩成分濃度調整為原來的0.5、2.5及5倍(MCGM-0.5、MCGM-2.5、MCGM-5)，控制組則選擇原始37 pH 6.0的最佳化培養，並保留最初的饋料策略與操作模式做發酵培養其結果如 (圖一)，在此主要討論的重點在於改變培養基質後細胞產氫的變化。實驗結果如 (圖二)，首先在控制組方面所得的產氫量為600 mmole hydrogen/L，若與其他的配方相較產量差距並不明顯，既使MCGM-5產氫量為700 mmole hydrogen/L雖然與控制組比較已有些微的差距，但其產氫量的增加量仍在20%之內並不算高，在這一部份的發現改善效果並不顯著。比產氫速率方面，在所有配方的比較中意外地發現僅有控制組與MCGM-0.5的比產氫率達到5 mmole/h/OD600/L， 反而在MCGM-5的實驗中比產氫率呈現偏低的趨勢(圖三)，基於這現象可能是因為饋料碳源不足而造成。4.2饋料策略面對所須碳源不足所造成的問題，實驗嘗試對MCGM-5實驗進行饋料策略的修正，期望對比產氫率有正面提昇的效果，在此修正上主要為提高Glucose的饋料速率，這一方面與過去實驗不同的是饋料速率不一定維持在一個定值 (Constant) 而是經由分析視Glucose的剩餘量而定，饋料流速首先設定為5g/h做一測試，在這實驗的結果中產氫量增加為850 mmole hydrogen/L (圖四)，與原先沒有提高饋料流速的MCGM-5實驗產氫量提高20%，細胞生濃度也較低流速的實驗高出許多，另一方面經由比產氫速率曲線亦發現由原先偏低的趨勢有了大幅度的改善(圖五)，因此再將饋料流速提高至9g/h實驗中，發現細胞濃度可高達15 OD600比起之前實驗的細胞濃度7.4 OD600已有相的差距，氫量為910 mmole hydrogen/L 比原始的MCGM-5實驗產氫又高出30%，基於以上結果，對於配方的改善上相信饋料策略是項常重要的因素。結合最佳的操作條件，對於MCGM-10、MCGM-15的實驗結果，產氫量最大可達到1200 mmole hydrogen/L提昇CGM配方約兩倍的產氫量(圖六)，另一方面，在抑制效果的改善上，除了比產氫速率提高在7 mmole/h/OD600/L外，亦緩和過去CGM培養中Butyrate的抑制效應，由原本抑制濃度1015 g/L的範圍中，提高至19g/L(圖七)。5.結論在提昇產氫量的製程上，除了基質配方修正外饋料策略亦是項非常重要的因素，在實驗配方MCGM-15的培養結果中產氫量可達到1200 mmole hydrogen/L比原本使用CGM配方增加近兩倍的產氫量，除此之外，對於細胞在抑制環境中的產氫情形亦有明顯的改善，最小抑制濃度範圍提昇至Butyrate濃度達19g/L。 (圖一) CGM培養產氫相關曲線(圖二) 不同配方產氫比較圖(圖三) 不同配方比產氫率比較圖Y軸單位(mmol h-1 OD600-1 L-1)(圖四) 不同饋料進料下產氫量比較圖(圖五) 不同饋料進料下比產氫率比較圖Y軸單位(mmol h-1 OD600-1 L-1) (圖六) 不同配方培養下產氫量比較圖 (圖七) 以MCGM-10培養Butyrate對比產氫率的影響Y軸單位(mmol h-1 OD600-1 L-1)箭頭處為Butyrate最小抑制濃度5.參考文獻Asada, Y, Miyake, J. 1999. Photobiological hydrogen production. J. Biosci. Bioeng. 88:1-6.Benemann, JR. 1997. Feasibility analysis of photobiological hydrogen production. Int. J. Hydrogen Energy 22:979-987.Eroglu, I, Aslan, K, Gunduz, U, Yucel, M, Turker, L. 1999. Substrate consumption rates for hydrogen production by Rhodobacter sphaeroides in a column photobioreactor. J. Biotechnol. 70:103-113.Kataoka, N, Miya, A, Kiriyama, K. 1997. Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria. Water Sci. Technol. 36:41-47Miyake, J, Miyake, M, Asada, Y. 1999. Biotechnological hydrogen production: research for efficient light energy conversion. J. Biotechnol. 70:89-101.Roos, J.W, Mclaughlin, K., E. T. 1985The effect of pH on nityogen supply, cell lysis and solvent production in fermentations of Clostridium acetobutylicum ATCC824. Biotechnol Bioeng. 27:681-694-221Sasaki, K.; Takeno, K.; Emoto, Y. Utilization of organic acids and volatile fatty acids, and hydrogen production by photosynthetic