异基因骨髓间质干细胞移植治疗系统性红斑狼疮.doc

异基因骨髓间质干细胞移植治疗红斑狼疮11例临床分析基金项目：国家自然科学基金（30772014）；教育部高等学校博士点专项基金项目（20050315001）；江苏省医学重点人才基金作者单位：210008 南京，南京大学医学院附属鼓楼医院风湿免疫科通信作者：孙凌云，Email: 【摘要】 目的 探讨异基因骨髓间质干细胞（MSC）移植治疗难治性系统性红斑狼疮（SLE）的疗效及安全性。方法 血缘相关供者骨髓中分离培养MSC移植治疗11例SLE患者，移植前予环磷酰胺（CTX）0.81.8g，分23次静脉输注，输注后隔日予MSC移植，移植细胞数（1106/kg体重）。评价患者移植前后的临床表现和实验室检查的改变。 结果 11例SLE患者病程115年，SLEDAI积分12.85.1。8例存在肾脏损害，表现为狼疮性肾炎，24h尿蛋白定量2045935mg（517.53690mg），其中2例患者为肾功能不全（血肌肝分别为474和153umol/L，GFR 分别为65和45 ml/min），其中5例患者存在低蛋白血症（17.733g/L）；1例患者合并重度血小板减少和股骨头坏死；2例患者曾患神经精神狼疮。异基因MSC移植治疗SLE后，所有患者无移植并发症。患者SLEDAI积分降低为5.83.8（移植后1月，n=9，P0.01），C3升高（移植前 0.500.12g/L，移植后1月0.750.10g/L，n=9）。ANA和ds-DNA抗体滴度降低。24h尿蛋白定量降低为981559mg（移植后1月，n=8），移植后2月（2039517mg vs. 1055689mg，n=5），移植后6月（2577883mg vs. 572117mg，n=4）。5例低蛋白血症患者血清白蛋白上升，移植后1月（移植前28.06.0 g/L vs. 32.36.6g/L，n=5，p0.021），移植后2月（移植前23.3.08.0 g/L vs. 30.08.3g/L，n=2，p0.01），移植后4月（移植前23.3.08.0 g/L vs. 34.49.0g/L，n=2，p0.01），移植后8月（移植前23.3.08.0 g/L vs. 36.48.6g/L，n=2，p0.01）。2例肾功能不全患者GFR轻读上升，其中1例移植后1月肌肝降低为389umol/L。结论 异基因MSC移植治疗难治性SLE有效安全，有利于狼疮病情缓解。MSC取材方便，扩增迅速，输注安全，经济。异基因MSC移植治疗SLE的长期疗效评估需进一步随访。【关键词】骨髓间质干细胞； 移植； 红斑狼疮，系统性Clinical report on allogenic bone marrow derived mesenchymal stem cells transplantation for refractory systemic lupus erythematosusDepartment of Rheumatology & Immunology, the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School, Jiangsu 210008, China P.R.Corresponding author: SUN Ling-yun, Email: Objective: To explore the clinical efficacy and safety of allogenic bone marrow derived mesenchymal stem cells transplantation (MSCT) in patients with severe and treatment-refractory systemic lupus erythematosus(SLE). Methods: Eleven patients with refractory SLE, nine female and two male aged 1641(mean 257.6 years), were enrolled in the study and gave consent to the study which was approved by the Ethics Committee of the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School. The bone marrow of related healthy donors were aspirated and the mesenchymal stem cells(MSCs) were expanded in vitro. Each patients were given MSCs 1106/kg body weight introvenously. Before MSCT, all patient were given cyclophosphamide(CTX) 4001800mg divided by two to three times. The clinical manifestations and laboratory tests were compared before and after MSCT. Results: The eleven patients were followed up for one to thirteen months after MSCT. All patients have not developed transplantation related complications. The Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index (SLEDAI) score decreased from 12.85.1 to 5.83.8 one month after MSCT(n=9, p0.01). Urine protein concentration decreased from 1985.18892.49 mg/24h to 962.20525.99 mg/24h one month after MSCT (p0.01, n=10). Five patients that were followed up for six months, the urine protein concentration decreased significantly (523.68147.55 mg/24h vs. 2477.68796.50mg/24h, n=5, p0.01). Five patients with hypoproteinemia, the serum albumin increased gradually. One month after MSCT (28.06.0 g/L vs. 32.36.6g/L, n=5, p=0.021), two months after MSCT (23.3.08.0 g/L vs. 30.08.3g/L, n=2), four months after MSCT (23.3.08.0 g/L vs. 34.49.0g/L, n=2), eight months after MSCT (23.3.08.0 g/L vs. 36.48.6g/L, n=2). Complement C3 increased from 0.500.12 g/L to 0.750.10 g/L(n=9, p0.01) one month after MSCT. The anti-nuclear antibody (ANA) and anti-dsDNA antibody titer decreased after MSCT. In two patients with chronic renal failure, the serum creatinine fell down mildly. Conclusion: Treating refractory SLE with allogenic MSCT is effective and safe. However, further observation is required to evaluate long term efficacy.Key words: bone marrow mesenchymal stem cells; transplantation; lupus erythematosus, systemic 系统性红斑狼疮（SLE）是多因素参与的特异性自身免疫病，通过大量自身抗体和免疫复合物造成组织损伤。迄今为止，尽管新型免疫抑制剂如霉酚酸酯、来氟米特和生物制剂对SLE有一定的疗效，但糖皮质激素和细胞毒药物环磷酰胺(CTX)仍是治疗SLE最有效的方法，但仍有20%-30%患者无效。造血干细胞移植（HSCT）治疗SLE是近年来开展的又一疗法，临床取得一定效果，但也存在许多问题，如自体HSCT高复发和异体HSCT的预处理风险及移植物抗宿主病（GVHD）等，难以作为常规治疗。骨髓间质干细胞（MSCs）是骨髓内造血干细胞（HSCs）之外的另一类干细胞，是骨髓微环境的重要组成部分。随着对MSC认识的不断深入，还发现MSC具有低/无免疫原性和免疫调节功能，可通过T、B淋巴细胞及树突状细胞（DC）等免疫细胞发挥免疫抑制作用。目前研究表明SLE骨髓间MSCs存在缺陷，且参与疾病的发生1，因此我们尝试用异基因MSC移植治疗SLE并对其机制进行了初步研究。我们在用异基因骨髓MSCs移植治疗狼疮鼠（MRL/lpr）有效的基础上，已对11例重症难治性系统性红斑狼疮采用异基因骨髓MSC移植治疗，总结如下。1 资料和方法1.1 病例资料11例SLE患者于2007年3月至2008年4月于我院行异基因骨髓间质干细胞移植，均符合美国风湿病学院（ACR）1997年修订的SLE分类标准，其中女性9例，男性2例，平均年龄25岁（1641岁）。所有患者均为积极药物治疗仍反复发作者。11例SLE患者病程115年，狼疮活动积分（SLEDAI）11.75.1。其中10例存在肾脏损害，表现为狼疮性肾炎，24h尿蛋白定量1989842mg（5183690mg），其中2例患者为肾功能不全（血肌肝分别为474和153umol/L，GFR 分别为65和45 ml/min），其中5例患者存在低蛋白血症（17.733g/L）；1例患者合并重度血小板减少和股骨头坏死；2例患者曾患神经精神狼疮。具体临床和实验室资料见表1。本研究遵循程序符合本单位负责人体试验委员会所制定的伦理学标准，并得到该委员会的批准，取得所有患者的知情同意。1.2 方法1.2.1 异基因骨髓MSCs采集、分离、扩增和培养：移植前取相关供者骨髓3045ml，肝素抗凝，生理盐水稀释至2倍所取骨髓量，缓慢加入预先加有等体积的淋巴细胞分离液（Ficoll，1.077）分离液面上，2000转离心30分钟，收集中间层细胞，洗涤后以5106细胞/ml接种于25cm2培养瓶中，每瓶含5ml 低糖DMEM完全培养液（含10%胎牛血清），置37、5 %CO2、饱和湿度CO2培养箱培养。2448h后换液，去掉非贴壁细胞，以后每3d以低糖DMEM完全培养液换液1次。培养至贴壁细胞90融合时，用0.25胰蛋白酶消化，按13的比例传代，扩增后的MSCs计数，加入5人体白蛋白溶液中静脉回输。低糖DMEM，胎牛血清和0.25胰蛋白酶均购自美国GIBCO公司。1.2.2 移植方案：移植前予环磷酰胺（CTX）0.81.8g，分23次静脉输注，输注后隔日予MSC移植，移植细胞数（1106/kg体重）。移植前用0.25胰蛋白酶消化，按13的比例传代，扩增后的MSCs计数，加入5人体白蛋白溶液中静脉回输。移植前给予甲基强的松龙40mg预防过敏反应。1.2.3疗效评价：移植后平均随访时间为6月（111个月），对移植前后患者临床表现改善请况和实验室检查如血清抗核抗体（ANA）、抗双链DNA抗体（ds-DNA）、IgG滴度、补体C3、24小时尿蛋白定量、肾小球滤过率（GFR）、血常规、尿常规、肝肾功能等指标进行比较，以及移植相关并发症等方面进行评价。1.3 统计学分析：结果以均数标准差表示，各组间差异采用独立样本t检验和配对t检验分析，采用SPSS11.5统计分析软件包进行数据分析。2 结果2.1 MSC移植后的疗效和随访：移植后，患者SLEDAI积分降低为5.63.4（移植后1月，n=11，P0.01）（图1）。24h尿蛋白定量降低为1118700mg（移植后1月，n=10，P=0.02），移植后2月（2039517mg vs. 1055689mg，n=5），移植后6月（2577883mg vs. 572117mg，n=4）（图2、3）。5例低蛋白血症患者血清白蛋白上升，移植后1月（移植前28.06.0 g/L vs. 32.36.6g/L，n=5，p0.021），移植后2月（移植前23.3.08.0 g/L vs. 30.08.3g/L），移植后4月（移植前23.3.08.0 g/L vs. 34.49.0g/L），移植后8月（移植前23.3.08.0 g/L vs. 36.48.6g/L）。11例患者中3例患者ds-DNA抗体阳性，移植后1月无变化；1例患者移植后1月，ANA滴度由1：2000降为1：500；1例患者移植后2月，ANA滴度由1：2000降为1：100，2例患者移植后1月，ANA滴度由1：1000降为1：500。移植后患者血清补体C3升高（移植前 0.500.12g/L，移植后1月0.750.10g/L，n=9）。2.2 MSC移植并发症：4例患者在接受CTX后出现恶心、呕吐。所有移植患者输注异基因MSC时均无并发症。2.3 MSC移植适应症：异基因骨髓MSC移植主要用于难治性SLE，常规激素、免疫抑制剂控制欠佳，如狼疮性肾炎、肺动脉高压、重度血细胞减少，对终末期器官功能衰竭患者不合适。3 讨论 本文首次报道异基因骨髓MSC体外分离、扩增后移植成功治疗SLE。在我国SLE患病率约0.1，近年来对SLE在发病机制方面进行了多方面的研究，T、B淋巴细胞以及骨髓干细胞的异常在疾病发生、发展、预后起着非常重要的作用。对于治疗则仍是单行激素或联合CTX、霉酚酸脂（MMF）、硫酸羟基氯喹等免疫抑制剂，但仍有20左右的患者病情进展难以控制。近年来，造血干细胞移植（HSCT）治疗难治性SLE获得了较好的效果，但是，自体HSCT存在高复发率，异体HSCT存在高死亡率，难以在临床广泛开展。长期应用大剂量激素、免疫抑制剂治疗造成的继发感染、骨质疏松、高血压、糖尿病等并发症将给患者带来极大的危害和负担。寻求一种能控制病情、安全、经济的治疗方法将给患者带来新的希望，而MSC独特的免疫调节功能和安全特性使之成为可能。MSC是存在于骨髓中的一类干细胞，能分化为分泌多种细胞因子、黏附分子的骨髓基质细胞，近来多项研究表明MSC具有以下特点：来源广泛、多向分化潜能、体外易扩增传代并保持稳定的表型、无免疫原性、具有造血支持和免疫调节作用和诱导免疫耐受。体内外研究均表明MSC通过分泌多种细胞因子如转化生长因子(TGF-)、白细胞介素-6（IL-6）、IL-7、IL-10、干扰素(IFN-)、等来诱导免疫耐受和免疫调节的作用、达到抑制活化T细胞增殖的作用2。由于MSC没有MHC限制性，在异体MSC移植时无排斥反应发生，而且MSC在分化成其它细胞类型时仍保留其特性。根据MSC多向分化潜能、造血支持、免疫调节的特性，临床上已将其应用于组织工程、大剂量化疗后造血支持、治疗移植物抗宿主病(GVHD)等3-5。近年来对肾损伤疾病的研究显示MSC输注可促进肾损伤的结构修复和功能恢复，MSC可迁移至受损的肾脏并分化为肾小管上皮细胞，加快肾小管细胞增殖速度6。 早有学者提出SLE是“干细胞病”的观点7，国内外以及我们相关研究表明狼疮动物模型或SLE患者骨髓MSC存在缺陷。Papadaki等8研究表明SLE患者骨髓基质细胞存在缺陷，通过Fas介导CD34细胞凋亡致CD34细胞减少；Ikehara 9报道将正常鼠骨髓（含MSC和少量T细胞）直接注射入狼疮鼠（MRL/lpr）骨髓腔内，能使狼疮鼠存活2年以上并无临床症状发生，也无GVHD发生。我们前期研究发现狼疮MSC存在异常1,10，表现为：1）SLE患者骨髓MSC体外生长较正常人缓慢，存在早衰，不能长期传代；2）SLE患者MSCs分泌细胞因子如IL-6、IL-7减低；3）狼疮鼠（NZBW/F1）MSCs使Th1/Th2平衡向Th2偏移，推测MSC的异常可能在SLE的发病中起重要作用，SLE患者MSC缺陷为原发性而非继发性。我们将人MSC输注给狼疮鼠（MRL/lpr）的实验研究发现狼疮鼠尿蛋白下降，病情活动相关指标得到了改善，肾脏病理变化明显减轻, 且无排斥反应发生11；因此，我们推测MSC移植治疗SLE患者有效，而且认为SLE患者自体MSC移植不合适，应选择异体（异基因）MSC移植。 自2007年3月2008年4月，我们已对12例SLE患者行MSC移植。病例选择，倾向于难治狼疮性肾炎，这些患者大都具有大量蛋白尿，2例合并慢性肾功能不全，正规激素联合免疫抑制剂治疗半年以上无效。结果显示，MSC移植能显著改善SLE病情，降低血中抗体滴度，改善狼疮性肾炎。从图？中可看出，患者24小时尿蛋白定量在移植后1个月时下降趋势较明显，之后有轻度回升，在随访6个月至1年时，尿蛋白均下降到较低水平。笔者认为小剂量CTX在早期尿蛋白降低中起一定作用，而MSC在长期疗效中发挥重要作用。其中一例患者肾损较重，移植前血Cr 474 umol/L，移植后1个月，血Cr降低为389 umol/L，血红蛋白也有显著上升，但患者因呼吸道感染血Cr上升至556 umol/L，给予第2次移植后血Cr降至480umol/L，进一步证实了MSC移植后的疗效。我们对移植前后患者血中调节性T细胞也进行了相关研究，发现异基因MSC移植可上调SLE 患者CD4+ Foxp3+ T细胞水平，推测可能是MSC移植治疗SLE有效的机制之一。 国内外尚未见MSC治疗SLE报道，虽国内可见MSC联合HSC移植治疗SLE的相关报道12，而该作者是利用MSC造血支持作用来支持大剂量化疗后的造血功能恢复，而笔者利用的是其独特的免疫抑制特性达到治疗目的。总之，本初步研究表明异基因骨髓MSC取材方便，扩增迅速，输注安全，短期疗效较好。下一步将进一步观察并继续深入开展此项研究后加以评估，以及选择不同类型的难治性SLE患者（如合并肺动脉高压），改变MSC输注途径，通过多次移植等来观察MSC疗效，为今后MSC治疗SLE及其他免疫病奠定基础。参考文献1 Sun LY, Zhang HY, Feng XB, et al. Abnormality of bone marrow-derived stem cell in patients with systemic lupus erythematosus Lupus, 2007,16:121-128.2 Aggarwal S, Pittenger MF. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses. Blood,2005,105:1815-1822.3 Chen SL, Fang WW, Ye F, et al. Effect on left ventricular function of intracoronary transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cell in patients with acute myocardial infarction. Am J Cardiol., 2004,94:92-95.4 Koc ON, Gerson SL, Cooper BW, et al. Rapid hematopoietic recovery after coinfusion of autologous-blood stem cells and culture-expanded marrow mesenchymal stem cells in advanced breast cancer patients receiving high-dose chemotherapy. J Clin Oncol, 2000,18:307-316.5 Le Blanc K, Rasmusson I, Sundberg B, et al. Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells. Lancet, 2004,363:1439-1441.6 Behr L, Hekmati M, Fromont G, et al. Intra renal arterial injection of autologous mesenchymal stem cells in an ovine model in the postischemic kidney. Nephron Physiol, 2007;107:p65-76.7 Ikehara S. Autoimmune diseases as stem cell disorders: no