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微生物学讲义第一章 绪论一、 微生物与人类的关系人类喝的酸奶、酒等发酵饮料，吃的面包、馒头甚至呼吸的新鲜空气都是微生物带来的恩惠；而我们所遭受的感冒和其它传染病等病魔的折磨，则是有害微生物侵蚀了身体所致，但服用或注射抗生素类药物后恢复健康，又要感谢微生物，因为这类药物是微生物的“奉献”。微生物是一把双刃剑：一方面给人类带来巨大的利益，如：许多微生物产品疫苗、维生素、酶制剂、酒和抗生素等重要产品，物质循环中的重要组成成员以及以基因工程为代表的生物技术也是微生物对人类做出的又一重大贡献；另一方面又“残忍”地给人类带来巨大灾难，如：1347年的瘟疫（鼠疫耶森氏菌）几乎毁灭整个欧洲，今天的艾滋病（AIDS）、癌症、SARS以及已被人类征服了的传染病（如肺结核、疟疾、霍乱等）也有“卷土重来”之势。随着环境污染和破坏日益严重，一些以前从未有过的新疾病（如军团病、埃博拉病毒病、疯牛病和SARS等）又给人类带来新的威胁。因此，你未来的微生物学家或其他科学家任重而道远。正确地利用微生物的两面性来造福人类是我们学习和应用微生物学的目的，也是义不容辞的责任。1、 什么是微生物？微生物是一切肉眼所看不到的或者看不清楚的形体微小的单细胞或个体结构简单的多细胞的甚至没有细胞结构的低等生物的总称。2、 微生物的特点：形体微小 m mm 光镜下可见、大的肉眼可见（细胞型） nm 电镜下可见（细胞器和非细胞型病毒） 单细胞构造简单 简单多细胞非细胞型（分子生物） 原核类：细菌、放线菌、支原体、立克次氏体和蓝细菌等进化地位低等 真核类：真菌（酵母菌和霉菌）、原生动物和显微藻类 非细胞类：病毒、亚病毒（拟病毒、类病毒和朊病毒等）二、 微生物科学1、 研究对象及分类地位研究对象：无细胞结构不能独立生活的病毒、亚病毒，具原核细胞结构的古生菌和真细菌以及具真核细胞结构的真菌（酵母菌、霉菌和蕈xun菌）、单细胞藻类和原生动物等。分类地位：由于微生物的极其多样性以及独特的生物学特征（个体小，比表面积大、吸收多、转化快，生长旺盛、繁殖快，种类多、分布广，易变异、适应性强。），使其在整个生命科学中占有举足轻重的地位。无论是1969年魏塔克Whittaker提出的五界系统，还是1977年卡尔伍斯Karl Woese（2003年格拉夫生物科学奖获得者）提出的三域系统，微生物都占据很大比例（3/5和2/3）。2、 研究内容及分科研究内容：微生物学是研究微生物在一定条件下的形态结构，生理生化，遗传变异以及微生物的进化、分类和生态等生命活动规律及其应用的一门学科。分科：随着微生物学的不断发展，已形成了基础微生物学和应用微生物学两大学科，又可分为许多不同的分支学科，并还在不断地形成新的学科和研究领域。见p3图11三、微生物学的发展（一）史前期 （1676年以前） 人们在显微镜出现以前并不知道微生物，只是无形中利用了微生物，也不知道这些过程中有微生物存在。如我国的制曲酿酒工业先用霉菌制曲，再用酵母菌发酵；农业上的轮作制、积肥沤粪等；医学上人痘（鼻苗法种痘）预防天花、用麦曲治疗腹泻等。（二）初创期 （16761861）微生物的发现和形态学研究 列文虎克Leeuwenhoek 于1676年用自制的单式显微镜第一次发现并描述了微生物，随后人们主要热衷于寻找和描述微生物的形态及分门别类，而没有研究其生理活动及与人类实践活动的关系。（三）奠基期 （18611897）微生物的生理活动研究 以法国的巴斯德Pasteur和德国的柯赫Koch为代表的科学家将微生物的研究推进到生理学研究阶段，揭露了微生物是造成腐败发酵和人畜疾病的原因，并建立了分离、培养、接种和灭菌等一系列独特的微生物技术，从而奠定了微生物学的基础，同时开辟了医学和工业微生物学等分支学科。1、 巴斯德 主要贡献有三个方面 提出了生命只能来源于生命的胚种学说，认为只有活的微生物才是传染病、发酵和腐败的真正原因。用著名的曲颈瓶试验彻底否定了“自然发生”学说。 奠定了免疫学的基础。1877年巴斯德研究了鸡霍乱，发现将病原菌减毒可诱发免疫性，以预防鸡霍乱。其后他又研究了牛、羊炭疽病和狂犬病，并首次职称狂犬病疫苗，证实其免疫学说，为人类防病、治病作出了重大贡献。 证实发酵是由微生物引起的。巴斯德经过不断努力，终于分离到了许多引起发酵的微生物，并证实酒精发酵是由酵母菌引起的。此外，他还发现了乳酸发酵、醋酸发酵和丁酸发酵都是由不同的细菌引起的，为进一步研究微生物的生理生化奠定了基础。 其他方面：至今仍在沿用的巴斯德消毒法（6065加热处理30，杀死有害微生物的一种消毒法），对蚕软化病提出隔离病原体防治传染、检查淘汰病蛾，逐渐消灭病害的理论。2、 柯赫 主要贡献有两方面 在微生物基本操作技术方面为微生物学的发展奠定了技术基础，主要包括发明了明胶、琼脂固体培养基平板分离培养技术，一直沿用至今；创立了悬滴培养法、显微摄影技术以及许多染色方法；配置培养基。在病原菌研究方面具体证实了炭疽病菌是炭疽病的病原菌；发现了肺结核病的病原菌（于1911年获诺贝尔奖）；提出了证明某种微生物是否为某种疾病病原体的基本原则柯赫法则：病原菌总是在患传染病的动物（生物）中存在，而不存在于健康个体中；这一微生物可以离开动物体，并被培养为纯种培养物；这种纯种培养物接种到敏感的健康动物体后，应出现该微生物所引起的特有病症；该微生物可以从患病的试验动物中重新分离出来，并可在实验室中再次培养，且它仍应与原始病原微生物相同。3、其他 李斯特消毒外科术，埃尔里赫、梅契尼科夫免疫学，贝哲林克、维诺格拉德斯基土壤微生物学，伊万诺夫斯基病毒学，埃尔里赫化疗法。（四）20世纪的微生物学 1941年以前微生物学家主要研究感染疾病因子、免疫、寻找新的化学治疗剂以及微生物代谢等。直到40年代，许多生物学难以解决德理论和技术问题十分突出，特别是遗传学上的争论问题，才使得微生物学与生物学很快结合起来，成为整个生命科学发展德前沿。1、 多学科交叉促进了微生物学的全面发展1941年的突变实验比德尔和塔特姆用粗糙脉胞菌分离出一系列生化突变株，将遗传学和生物化学紧密结合起来，不仅促进了微生物学的发展，形成了微生物遗传学和生理学，而且也推动了分子遗传学的形成；与此同时，微生物的其它分支学科也得到了迅速发展。还有60年代发展起微生物生态学、环境微生物学等；50年代微生物学全面进入分子研究水平，与发展起的分子生物学理论和技术以及其他学科汇合，使其发展成为生命科学领域内的一门前沿科学。2、 促进许多重大理论问题的突破1941年的突变实验，提出了“一个基因一个酶”的假说；1943年鲁里亚、德尔波留克的涂布试验证明了突变的性质和来源（自发性）；长期争论而未能解决的“遗传的物质基础是什么？”的重大理论问题，也是以微生物为实验材料进行研究获得的结果证实：核酸是遗传的物质基础；DNA双螺旋结构的提出，基因的概念，基因组的测序，操从子学说，“中心法则”等理论的提出都与微生物学的研究息息相关。另外，源于微生物转化的理论和技术的转基因动植物的转化技术、DNA重组技术、遗传工程，使人类定向改变生物、根治疾病、美化环境的梦想成为现实。总之，20世纪的微生物学一方面在与其他学科的交叉和相互促进中获得迅猛发展，另一方面也为整个生命科学的发展作出了巨大贡献。3、我国微生物学的发展我国具有5000多年文明史的古国，是认识和利用微生物最早的国家之一。特别是在制酒、酱油和醋等微生物产品以及种痘等方面。但是微生物作为一门科学进行研究却比较落后。从本世纪初由一批从西方留学的科学家开始进行比较系统地研究。主要有伍连德对鼠疫和霍乱病原等进行研究，并建立卫生防疫机构；汤飞凡及其助手张晓楼医学细菌学、病毒学和免疫学，尤其是在世界上首次分离和确证了沙眼病原体；谢少文则第一次分离出立克次氏体；戴芳澜和俞大绂是我国真菌学和植物病理学的奠基人；陈华癸和张宪武开创了我国的农业微生物学；高尚荫创建了我国的病毒学和第一个微生物学专业。五、21世纪微生物学展望1、微生物基因组学研究将全面展开 主要集中在基因组的序列分析、功能分析和比较分析，从本质上认识微生物自身以及利用和改造微生物，并带动分子微生物学等基础研究学科的发展。2、以了解微生物之间、微生物与其他生物、微生物与环境的相互作用为研究对象的微生物生态学、环境微生物学和细胞微生物学等，将在基因组信息的基础上获得长足进步，为人类的生存和健康发挥重要作用。3、与其他学科将更加广泛的交叉，相互促进发展。微生物基因组学是数、理、化、信息和计算机等多种学科交叉的结果；随着人类认识的加深和需求，将进一步向地质、海洋、大气和太空渗透，是更多的边缘学科得到发展。微生物学的研究技术和方法也将会在吸收其他学科的先进技术的基础上，向自动化、定向化和定量化发展。在21世纪微生物产业除了更广泛地利用和挖掘不同生境（尤其是极端环境）的自然资源微生物外，基因工程菌将形成一批强大的工业生产菌，生产外源基因表达的产物，特别是药物的生产将出现前所未有的新局面，人类将完全征服癌症、艾滋病以及其他疾病，为人类做出更大的贡献。 思考题1什么是微生物？微生物学的研究内容是什么？2微生物学发展过程中的几位重要科学家及其贡献有哪些？3病原菌学说的提出和证实都有哪些人？4微生物有那些特点？第二章 微生物细胞的结构与功能第一节 原核微生物的细胞结构原核微生物是指细胞核无核膜包围，只有核区的裸露DNA的原始单细胞微生物，包括古生菌和真细菌两大类群。真细菌的细胞膜含由酯键连接的脂类，细胞壁中含特有的肽聚糖，DNA中一般没有内含子（近年来也有例外的发现）。包括细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、立克次氏体和衣原体等。一、真细菌细胞的构造 细菌细胞是原核细胞，就是在细胞中没有细胞核结构。只有明显核区（拟核），外面无核膜包围。与有真正细胞核的真核细胞相比，其它结构成分也有差异，如原核细胞壁的主要成分是一类含有氨基酸的多糖，称为肽聚糖，而真核细胞壁主要由纤维素或甲壳质组成。原核细胞 核区，原核细胞壁的主要成分是一类含有氨基酸的多糖，称为肽聚糖。真核细胞壁主要是由纤维素或甲壳素组成。 细菌细胞的基本结构是一般细菌共有的结构，包括细胞壁、细胞质膜、拟核、细胞质。1、 细胞壁：是位于细胞最外面的一层坚韧而略具弹性的结构层，主要由肽聚糖构成，有固定外形和保护细胞等多种功能。用一种称为革兰氏染色的方法，可将细菌分为革兰氏阳性菌（G 菌）和革兰氏阴性菌（G 菌）两大类。 真细菌的细胞膜含由酯键连接的脂类，细胞壁中含有特有的肽聚糖，DNA中一般没有内含子（近年也有例外发现）；古生菌的细胞壁无肽聚糖，由多糖、糖蛋白或蛋白质构成，且多含有酸或酸性氨基酸、多糖细胞壁。证明细胞壁存在的方法：质壁分离技术（蔗糖溶液），姬姆萨染色（壁绿色，质红色），制成原生质体，电子显微镜观察。革兰氏阳性菌细胞壁：化学组分简单，只由90的肽聚糖和10磷壁酸肽聚糖：分子由肽和聚糖两部分组成，肽有四肽尾（按L型和D型交替连接而成）和肽桥，聚糖则由N乙酰葡萄糖胺（NAG）和N乙酰胞壁酸（NAM）相互间隔通过1、4糖苷键（溶菌酶水解）连接而成，呈长链骨架结构。磷壁酸：主要为甘油磷壁酸或核糖醇磷壁酸。分为壁磷酸和膜磷酸。壁磷酸与肽聚糖上的NAG共价连接，可用稀酸或稀碱提取；膜磷酸是甘油磷酸与膜上的磷脂共价结合，用45的热酚或热水提取。主要生理功能：由于含有较多的负电荷而吸收Mg2，而提高一些合成酶的活性；储藏磷元素；增强某些致病菌对宿主细胞的粘连，避免被白细胞吞噬以及抗补体的作用；赋予G菌以特异表面抗原；可为噬菌体的吸附位点。革兰氏阴性菌的细胞壁 肽聚糖：12层为薄层，四肽尾的第三个氨基酸为内消旋的二氨基庚二酸（mDAP），无肽桥，单体之间仅通过肽尾直接相连，故松散、机械强度较差。 外膜：位于细胞壁外层，由脂多糖、磷脂和脂蛋白等组成。脂多糖由类脂A、核心多糖和O特异侧链三部分组成。其中类脂A是G菌的致病物质内毒素的物质基础；O特异侧链种类极多，决定其表面抗原决定簇的多样性。 外膜蛋白：是镶嵌在LPS和磷脂层外膜上的蛋白。有两种孔蛋白，限制或控制某些物质进入细胞，一种脂蛋白将外膜与肽聚糖内壁层上的蛋白牢固连接。 缺壁细菌：在自然界长期进化和实验室菌种的自发突变中发生细胞壁缺陷的细菌或者在实验室用人为的方法获得的缺壁细菌。缺壁突变L型细菌实验室或宿主体内形成 基本去尽原生质体（G ）缺壁细菌 人工去壁部分去掉球状体（G）在自然界长期进化中形成支原体（细胞膜中含有甾醇）革兰氏染色的机制：革兰氏发明，萨顿提出，彼弗里奇证明。结晶紫和碘在细胞膜内形成水不溶的复合物，G菌的细胞壁较厚，肽聚糖网层次多和交联紧密，故乙醇脱色时，因失水反而网孔缩小，因此该复合物留在壁内，使其仍呈紫褐色；反之G菌则正相反，且由于其外膜的类脂迅速溶解，使薄而松散的肽聚糖层网孔变大，结晶紫碘复合物溶出而无色，故被染成复染的颜色红色。2、细胞质膜：是紧贴在细胞壁内侧，包围细胞质的一层柔软、脆弱且富有弹性的半透性薄膜，是重要的代谢活动中心，对于细菌的呼吸、能量的产生、运动、生物合成、内外物质的交换运送等均有重要的作用。由磷脂和蛋白质组成。3、拟核：位于细胞质内，是一种没有核膜、没有核仁、没有固定形态、结构也较简单的原始形态的核，其实质是一个大型环状的双链DNA分子，是负载细菌遗传信息的物质基础。4、细胞质：是由细胞质膜包围着的，除拟核以外一切透明、胶状、颗粒状物质的总称。具有维持细胞内环境平衡等多种功能，分散于细胞质中的核糖体颗粒是蛋白质合成的场所。 内含物主要有PHB聚羟丁酸、磁小体和羧化酶。PHB存在于许多细菌细胞质内属于类脂性质的碳源类贮藏物，不溶于水，可溶于氯仿，用尼罗兰或苏丹黑染色，具有贮藏能量、碳源和降低细胞渗透压的作用。由于其具有无毒、可塑和易降解的特性，故被认为是生产医用塑料、生物降解塑料的良好原料。 磁小体：趋磁细菌中含有的大小均匀、数目不等的磁小体，其成分为Fe3O4，外有一层膜包裹，是单磁畴晶体，无毒、大小均匀。功能是导向作用，即借鞭毛游向该菌最有利的环境处生活。目前认为该菌有实用前景，可生产磁性定向药物或抗体，以及制造生物传感器等。 细菌细胞的特殊结构包括鞭毛、菌毛、荚膜、芽孢等，是某些细菌在某生长阶段具有的结构。1、 鞭毛：是某些细菌表面着生的一至数根由细胞内伸出的细长、波曲的丝状体，具有运动的功能。鞭毛在菌体上的着生位置、数目因种而异。2、菌毛（又名纤毛）：是在细菌体表的比鞭毛更细、更短、直硬，且数量较多（250300根）的丝状体，与细菌吸附或性结合有关。3、荚膜：是某些细菌向细胞壁表面分泌的一层厚度不定的胶状物质，它犹如穿在菌体表面的一件外套，用显微镜观察，中心部位是细菌菌体，在暗色背景下荚膜呈透明状环绕菌体， 具有抗干燥，抗吞噬和附着作用。4、芽孢：是某些细菌于生长后期，在细胞内形成的一个圆形、椭圆形或圆柱形、厚壁、含水量极低和具有极强的抗热、抗辐射、抗化学药物和抗静水压等特性的休眠体，称为内生孢子，亦称芽孢。堪称生命世界之最，所以有些细菌在环境条件不利于生长繁殖时便会形成芽孢。能产生芽孢的多为杆菌，产芽孢母细胞的外壳称芽孢囊。芽孢在菌体内的位置、形状、大小因种而异，有中央位、端位、近端位等。在有些细菌中，芽孢的直径小于菌体直径，这些细菌称为芽孢杆菌，为好氧细菌；在另一些细菌中，芽孢的直径大于菌体直径，使整个菌体呈梭形或鼓塑形，这些细菌称为梭状芽孢杆菌，为厌氧菌。在球菌和螺菌中，只有少数种类有芽孢。芽孢形成和结构芽孢的形成是一个极其复杂的过程，包括形态结构、化学成分等多方面的变化。光学显微镜和电子显微镜观察研究的结果，表明芽孢的形成在结构上主要经历以下几个阶段：核物质融合成轴丝状（杆状）。在细胞中央或一端，细胞膜内陷形成隔膜包围核物质，产生一个小细胞。小细胞被原来的细胞膜包围，生成前孢子。前孢子实质上是一个被两层同心膜包围着的原生质体，抗辐射。前孢子再向外分泌芽孢肽聚糖、DPA（吡啶二羧酸），积累钙离子，再经脱水，形成皮层、芽孢衣等多层膜，最后成为成熟的芽孢，由于细胞壁的溃溶而释放出来。芽泡形成过程中在化学成分方面也发生很大变化。生芽孢的细胞大量吸收钙离子并大量合成营养细胞中没有的吡啶二羧酸。在成熟的芽孢中，芽孢原生质体含有极高的吡啶二羧酸钙DPA-Ca，在新合成的、具有特殊化学构造的外层（皮层和孢子衣，有时还有芽孢外壁）中也有这种物质。芽孢的壁含有一种特殊的肽聚糖芽孢肽聚糖。同时，芽孢中还含有一些特殊的蛋白质。芽孢的萌发：刚形成的芽孢总是处于休眠状态。热处理（如65放置几十分钟）可以使芽孢加速活化。芽孢萌发时首先发生吸胀作用，随之折光性和抗性丧失，继而呼吸作用开始，显出代谢活性，芽孢物质（干重）的30变为可溶物释出，营养细胞壁迅速合成，最后，新形成的营养细胞从孢子衣里萌发出来。萌发通常有三种方式：赤道脱出，末端脱出，斜出。芽孢耐热机制：渗透调节皮层膨胀学说认为芽孢的耐热性在于芽孢衣对多价阳离子和水分的透性很差，皮层由于含有大量交联度低、负电荷强的芽孢肽聚糖，其与低价的阳离子一起使皮层的离子强度很高，从而使皮层产生极高的渗透压去夺取芽孢核心的水份，其结果造成皮层的充分膨胀，而有生命的核心部分的细胞质却变得高度失水，因此，具极强的耐热性。伴孢晶体：少数芽孢杆菌如苏云金芽孢杆菌在形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一颗菱形或双锥形的碱溶性蛋白质晶体（）内毒素，称为伴孢晶体。对200多种昆虫尤其是鳞翅目昆虫的幼虫有毒杀作用，蛋白质晶体的毒性是有高度专性的，对其他动物与植物完全没有毒性，故是一种理想的有利于环保的生物农药。研究芽孢的意义：1分类鉴定 不同细菌的芽孢具有不同的特点，从形状、大小、表面特征，直到与菌体的关系等都有不同的表现，因此可以作为分类鉴定的依据或参考。2科研材料 由于芽孢独特的产生方式，成为研究形态发生和遗传控制的好材料。3保存菌种 芽孢对不良环境有很强的抵抗力，可以保持生命力达数十年之久，在自然界使细菌度过恶劣的环境，在实验室是保存菌种的好材料。4分离菌种 芽孢的耐热性有助于芽孢细菌的分离。将含菌悬浮液进行热处理，杀死所有营养细胞，可以筛选出形成芽孢的细菌种类。5生物杀虫。这种杀虫剂的生产，并不需将蛋白质分离出来，只需培养大量细菌，在其形成芽孢并产生晶体时收获、干燥，做成粉剂即可第二节 真核微生物的细胞结构细胞核具有核膜，能进行有丝分裂、细胞质中存在线粒体等细胞器的生物。真核微生物包括真菌、显微藻类、原生动物以及地衣等。一、 细胞壁（真菌和藻类）：主要成分是多糖（葡聚糖、甘露聚糖、纤维素、几丁质等），另有少量的蛋白质和脂类。1、 酵母菌的细胞壁：甘露聚糖、蛋白质、葡聚糖、几丁质和少量的脂质。葡聚糖有两类1、3和1、6葡聚糖，位于细胞壁内层，起维持酵母细胞的机械强度作用。2、 丝状真菌的细胞壁：由外到内依次为葡聚糖、糖蛋白、纤维素和几丁质。3、 藻类的细胞壁：纤维素、杂多糖及少量的蛋白质和脂类。 除壁的方式为蜗牛酶水解或葡聚糖酶、甘露聚糖酶、纤维素酶和几丁质酶等混合酶水解。二、 鞭毛和纤毛与原核微生物鞭毛的区别主要是鞭杆为：“92”结构，基体为“90”结构。运动方式为弯曲运动。三、 细胞器1、核糖体：又称核蛋白体，是存在于一切细胞中的无膜包裹的颗粒状细胞器，具有合成蛋白质的功能，主要成分由表到内是蛋白质（40）和RNA（60），共价结合形成。真核生物内质网和细胞基质中的核糖体为80S，其它细胞器如线粒体、叶绿体中的为70S。2、线粒体：是一种进行氧化磷酸化反应的重要细胞器，其功能是把蕴藏在有机物中的化学潜能转化为生命活动所需的通用能源ATP，故为真核生物的“动力车间”。由双层膜包裹而成，内膜上有嵴、基粒和四种脂蛋白复合体，嵴增大进行化学反应的面积；基粒或F1颗粒为ATP合成酶复合体，四种脂蛋白是电子传递链（呼吸链）的组成部分。3、叶绿体：将光能转化为化学能，并通过光合作用将CO2和H2O合成葡萄糖等碳水化合物，放出O2的绿色颗粒状细胞器。课后思考题1. 那些特征可用于区别真核生物与原核生物？2. 什么是缺壁细菌？试述其各自的特点和意义。3. 用渗透调节皮层膨胀学说解释芽孢的耐热机制。4. 简述线粒体和叶绿体的主要特征及功能。第三章 微生物的营养微生物的营养主要是研究和阐明营养物质在微生物生命活动过程中的生理功能，以及微生物细胞从外界环境摄取营养物质的机制。营养物质和营养：那些能够满足微生物机体生长、繁殖和完成各种生理活动所需的物质称为营养物质。微生物获得和利用营养物质的过程称为营养。第一节 微生物的营养要求一、 微生物细胞的化学组成 1化学元素：C、H、O、N、P、S、K、Mg、Ca、Fe等为主要元素 Zn、Mn、Na、Cl、Mo、Se、Co、Cu、W、Ni、B等为微量元素。组成微生物细胞的各类化学元素的比例因微生物的种类不同而异；也随菌龄及营养条件的不同而发生变化。2化学成分及其分析 对细胞有机物成分的分析常采用两种方式：一是用化学方法直接抽提细胞内的各种有机物成分，再加以定性和定量分析；另一种是先将细胞破碎，获得不同的亚显微结构，再分析这些结构的化学成分。 对细胞无机物成分的分析则将干细胞在高温炉（如马沸炉）中焚烧成灰，再采用无机化学常规分析法可定性定量分析出灰分中的各种无机元素含量。 灰分：干细胞于高温炉（550）中焚烧后而剩下的各种无机元素的氧化物的总称（混合物）。 水：是一切细胞维持正常生命活动所必不可少的，一般占细胞重量的7090 。（湿重干重）/湿重100二、 营养物质及其生理功能根据营养物质在有机体中的生理功能不同，可将其分为碳源、氮源、无机盐、生长因子和水五大类。1碳源：在微生物生长过程中为微生物提供碳素来源的物质。在细胞中经一系列复杂的生物化学反应后变为微生物自身的细胞物质和代谢产物。其中化能异养菌还能产生生物能。微生物利用碳源物质具有选择性，其顺序依次为：糖类单糖（己糖戊糖）双糖淀粉纤维素、纯多糖杂多糖 有机酸醇脂烃HCO3- 、CO2(自养菌) 蛋白质、核酸等。2氮源：在微生物生长过程中为微生物提供氮素来源的物质。一般不作为能源，只有消化细菌和少数厌氧菌在厌氧条件下利用氨基酸作为营养物质。常用的蛋白质类：蛋白胨、鱼粉、蚕蛹粉、黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆、牛肉膏、酵母膏等。微生物对氮源的利用也具有选择性，对主要以氨基酸和肽等较易吸收的蛋白质降解产物和NH3+、NO3-形式存在的氮源的利用速度快，称为速效氮源；对主要以大分子蛋白质形式存在，需进一步降解成小分子的氨基酸和肽后才能利用吸收的氮源称为迟缓氮源。即速效氮源有利于菌体生长，后者有利于代谢产物的形成。在发酵生产中常利用微生物的这一特性，将两者按一定比例制成混合氮源，以控制菌体生长时期与代谢产物形成时期的协调，达到提高产量降低成本的目的。 酶的活性中心组成部分3无机盐： 维持生物大分子和细胞结构的稳定性在机体的生理功能 调节并维持细胞的渗透压平衡、控制氧化还原电位 作为某些化能自养菌生长的能源物质微量元素对微生物生长是必需的，若缺乏则会导致细胞生理活性降低甚至停止生长；若过量则对机体产生毒害作用，而且单独一种过量毒害更大，因此配制培养基时要控制其在正常的范围内，并注意各种微量元素之间的比例协调。通常情况下没有必要向培养基中添加微量元素。4生长因子：指那些微生物生长所必需而且需要量很少，但微生物自身又不能合成或合成量不足以满足机体生长需要的有机化合物。根据生长因子的化学结构和它们在机体中的生理功能不同，将其分为维生素、氨基酸与碱基（嘌呤和嘧啶）三大类。5水：生理功能主要有：起到溶剂与运输介质的作用，营养物质的吸收与代谢产物的分泌必须以水为介质才能完成；参与细胞内一系列化学反应；维持蛋白质、核酸等生物大分子稳定的天然构象；因为水的比热高，是热的良导体，能有效地吸收代谢反应产生的能量并及时散发出体外，从而有效控制细胞温度；通过水合作用和脱水作用控制由多亚基组成的结构，如酶、鞭毛等。水活度：指在一定的温度和压力条件下，溶液的蒸汽压力与同样条件下的纯水蒸气压力之比，即awPW/PW0。三、微生物的营养类型微生物种类繁多，其营养类型比较复杂，依据不同，划分结果亦不同。根据碳源、能源及电子供体性质的不同，将绝大多数微生物分为：表31 微生物的营养类型营养类型能源碳源电子供体例子光能无机自养型光能CO2和HCO3-为唯一碳源还原性无机物如水、H2S、H2等着色细菌、蓝细菌光能有机异养型光能有机物有机物红螺细菌化能无机自养型化学能无机物氧化CO2和HCO3-为唯一或主要碳源还原性无机物如H2S、Fe2+、NO2-、NH3等氢、铁、硫细菌和消化细菌等化能有机异养型化学能有机物氧化有机物有机物多为中间代谢物绝大多数细菌、所有真菌其中化能有机异养型又分为腐生型和寄生型等，而且该类型也能固定CO2，总之不同类型之间的界限不是绝对的，有的类型在不同条件下会发生改变，如紫色非硫细菌在没有有机物时同化CO2，表现为自养型，反之则为异养型；在有光照和厌氧条件下表现为光能营养型，无光和好氧条件下，又为化能营养型。营养缺陷型：某些菌株由于发生基因突变而丧失合成某种或某些对该菌生长比不可少的物质（通常是生长因子）的能力，必须从外界环境获得该物质才能生长繁殖，这种突变型菌株称为营养缺陷型。第二节 培养基培养基是指人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。一、配制培养基的原则1选择适宜的营养基质：首先要依据微生物的营养要求配制针对性强的培养基。由于微生物营养类型复杂，不同微生物对营养物质的需求不一样，同一种微生物在不同的营养条件下会产生不同的代谢产物。如：培养自养型微生物的培养基，由简单的无机物组成，不需要有机物；培养光能微生物则还需要光照提供能源；培养化能自养型的微生物，培养基中还要添加该菌所需的提供能源的无机化合物；谷氨酸发酵生产中，培养菌种的培养基与发酵培养基的营养成分就有很大差异。表32几种类型的培养基组成成分氧化硫硫杆菌培养基大肠杆菌培养基牛肉膏蛋白胨培养基高氏I号合成培养基查氏合成培养基LB培养基主要作用牛肉膏5碳源（能源）、氮源、无机盐、生长因子蛋白胨1010碳源（能源）、氮源、生长因子酵母浸膏5氮源、生长因子葡萄糖5碳源（能源）蔗糖30碳源（能源）可溶性淀粉20碳源（能源）CO2来自空气碳源(NH4)SO404氮源、无机盐NH4H2PO41氮源、无机盐、缓冲剂KNO31氮源、无机盐NaN033氮源、无机盐MgSO47H2O050.20.50.5无机盐FeSO40010.010.01无机盐KH2PO44无机盐、缓冲剂K2HPO410.51无机盐、缓冲剂NaCl550.510无机盐KCl无机盐CaCl2025无机盐S10能源H2O1000ml 溶剂PH707.07.27.07.27.27.4自然70灭菌条件12120min11230min12120min12120min12120min12120min2.营养物质浓度及配比合适：培养基中营养物质浓度合适时微生物才能生长良好，营养物质浓度过低不能满足微生物正常生长需求，浓度过高时则可能对微生物生长起抑制作用。培养基中各种营养物质之间的浓度配比（尤其是C/N）也能直接影响微生物的生长繁殖或产物的形成和积累。例如：谷氨酸发酵过程中 C/N为1/4时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；为1/3时，菌体繁殖受抑制，谷氨酸产量大量增加。抗生素发酵生产过程中，则通过控制速效氮（或碳）源与迟效效氮（或碳）源之间的比例来控制菌体生长与抗生素的合成协调。3控制pH条件：培养基的pH值必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。各类微生物生长繁殖或产生代谢产物的最适pH条件各不同：一般来说，真细菌生长的pH在7.07.5，真菌生长在4.56.0或者是自然pH。在微生物生长繁殖和代谢过程中，由于营养物质被分解利用和代谢产物的形成与积累，会导致培养基pH发生变化，所以通常在培养基中加入缓冲剂。缓冲剂组成的缓冲系统只能在一定的范围内起调节作用，故对产酸量很大的菌，其培养基中则需要加CaCO3等来调节。4控制氧化还原电位（）：不同类型的微生物生长对的要求不一样，一般好氧菌的在0.1以上，通常在0.30.4V为宜；厌氧菌只能在低于0.1V的条件下生长；兼性微生物一般在为0.1以上时为好氧，以下时发酵。由于值与pH有关，所以也受代谢产物的影响。5原料来源的选择：应尽量利用廉价且易于获得的原料作为培养基的成分，以利于降低成本，提高经济效益。6灭菌处理：要获得纯培养，就必须避免杂菌污染，对培养基一般采用高压蒸汽灭菌，以彻底杀灭培养基中的杂菌。一般用1.05kg/cm2(121.3)持续灭20min或者0.56kg/cm2(112.6)下维持30min。某些含有特殊成分如血清等则需过滤除菌或间歇灭菌，有些由于一起灭菌会产生沉淀或分解，则需分别灭菌后在混合或者加鳌合剂如乙二胺四乙酸（EDTA）等。二、培养基的类型及应用培养基之类繁多，根据其成分、物理状态和用途可将其分为多种类型。1按成分不同划分（1） 天然培养基：含有的化学成分还不清楚或不恒定的天然有机物，成本较低，亦称为非化学限定培养基。如牛肉膏蛋白胨培养基、LB培养基、豆芽汁培养基和马铃薯培养基等。（2） 合成培养基：由化学成分完全了解的物质配制而成的培养基。成本较高，重复性好，常用来进行微生物的营养需求、代谢、分类鉴定、生物量测定、菌种选育及遗传分析等方面的研究。如高氏1号合成培养基、查氏合成培养基（3） 半合成培养基。2根据物理状态划分 依据凝固剂的有无和含量多少。（1） 液体培养基：培养基中不加任何凝固剂。通过搅拌或振荡可以增加培养基的通气量，同时使营养物质分布均匀，故常用于大规模工业生产以及在实验室进行微生物的基础理论和应用研究。（2） 固体培养基：在液体培养基中加入一定量的凝固剂（琼脂、明胶或硅胶），使其成为固体培养基。主要用于进行微生物的分离纯化、分类鉴定、活菌计数以及菌种保藏等。理想的凝固剂应具备的条件：不被所培养的微生物分解利用；在所培养的微生物生长温度范围内保持固体状态，即凝固剂的凝固点温度不能太低和量不能太少；凝固剂对所培养的微生物无毒害作用；凝固剂在灭菌过程中不会被破坏；透明度好，粘着力强；配制方便且价格便宜。天然固体培养基天然固体基质制成的培养基。如酒曲、棉子壳培养基等。（3）半固体培养基：其凝固剂的含量比较少，一般琼脂含量为0.20.7%。主要用作观察微生物的运动特征、分类鉴定及效价测定等。3按用途划分（1）基础培养基：含一般微生物生长繁殖所需的基本营养基质。如LB培养基、牛肉膏蛋白胨培养基等。（2）加富培养基：在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基。如：血清、血液、动物组织液、牛奶等，为半合成培养基。主要用来对营养要求苛刻的异养微生物进行富集培养和分离。（3）选择培养基：用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。即根据不同种类微生物的特殊营养要求或对某种化学物质敏感性不同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长，从而达到分离所需微生物的目的。（4）鉴别培养基：在培养基中加入某种能与某种微生物在培养基中生长后产生的某种代谢产物发生明显特征反应的特殊化学物质，达到分离鉴别和筛选该种微生物目的的培养基。（5）其他培养基：分析培养基、还原性培养基、组织培养物培养基等。第三节 营养物质进入细胞（运输方式）营养物质能否被微生物利用的关键是这些营养物质能否进入微生物细胞。影响营养物质进入细胞的因素主要有三个：一是营养物质本身的性质即相对分子量的大小、溶解性、电负性和极性等。二是微生物所处的环境。如温度。PH、离子强度、诱导物质、抑制剂和解偶联剂等。温度通过影响营养物质的溶解度、细胞膜的流动性及运输系统的活性来影响微生物的吸收能力；pH和离子强度通过影响营养物质的电离程度来影响其进入细胞的能力；诱导物质通过诱导运输系统形成而有利于微生物吸收营养物质；抑制剂和解偶联剂等通过与原生质膜上的物质发生作用而影响物质的运输速率。三是微生物细胞的透过屏障。主要由原生质膜、细胞壁、荚膜及粘液层等组成的结构。尤其是原生质膜对跨膜运输的物质具有选择性，这是本节的重点，根据运输物质的特点，将运输方式分为扩散、促进扩散、主动运输和膜泡运输。一、扩散营养物质通过原生质膜上的含水小孔，由胞内外高浓度的环境向低浓度的环境进行非特异性的扩散。孔的大小和形状对扩散的营养物质有选择性。物质在扩散过程中，既不与膜上的各类分子发生反应，自身分子结构也不发生变化，是一种纯粹的物理学过程，不消耗能量，动力来自物质在膜内外的浓度差，直到达到动态平衡。运输的物质主要是水和相对分子量小、脂溶性和极性小的物质（如脂肪酸、乙醇、甘油和某些氨基酸等）。二、促进扩散与扩散的区别是：被运输的物质需要借助载体的作用（胞内外的亲和力不同）才能进入细胞，具有较高的专一性。不消耗能量，载体与被运输物质在这个过程中都不发生化学变化，载体蛋白为透过酶，大多是诱导酶。运输的物质主要有氨基酸、单糖、维生素及无机盐。三、主动运输是微生物的主要运输方式，与前两者相比，其重要特点是在物质运输过程中需要消耗能量，且可以进行逆浓度运输，需要载体蛋白。具体的方式有初级主动运输、次级主动运输、基团移位、Na、KATP酶系统及ATP偶联主动运输等。1初级主动运输：由电子传递系统、ATP酶或细菌嗜紫红质引起的质子运输方式。主要由于原核微生物是在细胞膜上产能，从而在膜内外形成质子浓度差，使膜处于冲能状态即形成能化膜。2次级主动运输：通过初级主动运输建立的能化膜在质子浓度差消失的过程中，往往偶联其它物质的运输。3基团移位：经过一个复杂的运输系统磷酸转移酶系统（PTS）来完成物质的运输，物质和酶在运输过程中发生化学变化。即被运输的物质在进入细胞内的过程中被磷酸化。4Na、KATP酶系统：亦称Na，K泵系统。该酶利用ATP的能量将Na由细胞内泵到胞外，并将K泵如胞内，从而使胞内的Na浓度低，K浓度高，而且不受环境中Na、K浓度高低的影响。5膜泡运输：主要存在于原生动物尤其是变形虫中的一种运输方式。分为胞饮和胞吞作用两种。练习题1 培养基、碳源、氮源、生长因子、选择培养基、加富培养基等名词解释。2 课后P95的1、3、4题。第四章 微生物的代谢第一节 代谢概论代谢：指发生在有机体中的各种化学反应的总称，是一切生命有机体的基本特征，主要由分解代谢和合成代谢（同化和异化作用）两个过程组成。1 分解代谢：指细胞将复杂的大分子有机物通过酶系的催化，分解为简单的小分子物质并释放能量ATP和还原力H的生化反应。2 合成代谢：指活细胞利用简单的小分子物质合成复杂大分子，并同时消耗能量和还原力的生化反应。3 合成代谢与分解代谢的关系：复杂大分子简单小分子ATPH前者是后者的基础，为其提供酶等，后者又为前者提供原料、能量及还原力，两者相互偶联，共同决定着生命的存在和发展。4根据代谢过程中产生的代谢产物在生命中的作用不同，代谢又被分成初级代谢与次级代谢两种类型。初级代谢：能使营养物质转变为有机体的结构物质或对机体具有生理活性作用的物质，或为机体生长提供能量的一类代谢类型。次级代谢：存在于植物和微生物中并在他们一定生长时期内出现的一类代谢类型。次级代谢产物有抗生素、生长刺激素、生物碱、色素等。第二节 微生物产能代谢能量代谢：生物体把外界环境中的各种形式的最初能源转换成对一切生命活动都能使用的通用能源ATP的过程。 日光 光能营养菌 最初能源 有机物 化能异养菌 通用能源ATP 还原态无机物 化能自养菌生物氧化：指发生在生物体内的一系列产能性氧化反应的总称。一、化能异养菌的生物氧化和产能异养微生物生物氧化有机物的方式，根据氧化还原反应中电子受体的不同可分为发酵和呼吸两种类型，而呼吸又分为有氧呼吸和无氧呼吸两种方式。1底物脱氢的四条主要途径以单糖作为典型的生物氧化底物，可通过EMP、HMP、ED和磷酸解酮酶途径（PK和HK途径）四条途径将单糖降解为丙酮酸，同时产生其它小分子中间代谢物、能量和还原力，该过程称为糖酵解。 （1） EMP途径（2）HMP途径（生化已讲过不在阐述）该处需掌握各途径的关键酶（特征性酶）、生理学意义及底物水平磷酸化的定义。（3）ED途径：是细菌特有的，可单独存在的从葡萄糖氧化产生丙酮酸的另一条途径。 ATP ADP NADP NADPH 葡萄糖 葡萄糖6磷酸 葡萄糖酸6磷酸 丙酮酸2酮3脱氧葡萄糖酸6磷酸（KDPG） EMP 甘油醛3磷酸关键酶为KDPG醛缩酶，1分子的葡萄糖经ED途径最后产生1分子ATP，1分子NADPH和1分