短暂性局灶性脑缺血再灌注后氯化锂对大鼠海马_省略_1区神经元凋亡及糖原合成酶激酶.pdf

基金项目 国家人事部出国留学人员基金资助项目 Z A 0 0 0 1 南京医科大学创新基金资助项目 M C 0 0 0 5 通讯作者 E m a i l y a n n i n g q i a n y a h o o c o m c n 糖原合成酶激酶 3 G S K 3 是一种丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶 1 它可以激活p 5 3基因表达P 5 3 蛋白 2 可以抑制热休克因子1 H S F 1 使热休克蛋 白7 0 H S P 7 0 表达下降 3 促进细胞凋亡 9号位点丝 氨酸残基磷酸化后成为p G S K 3 S e r 9 是G S K 3 短暂性局灶性脑缺血再灌注后氯化锂对大鼠海马 C A 1 区神经元凋亡及 糖原合成酶激酶 3 的影响 王新河 王斌 1 钱燕宁 南京医科大学第一附属医院麻醉科 江苏 南京2 1 0 0 2 9 1南京医科大学药理学教研室 江苏 南京 2 1 0 0 2 9 摘要 目的 观察氯化锂对短暂局灶性脑缺血再灌注大鼠海马C A 1区神经元凋亡及G S K 3 的影响 方法 S D大鼠1 2 6 只 随机分为正常 N O 组 假手术 S H 组 缺血再灌注 I R 组 氯化锂1 L i 1 组 氯化锂2 L i 2 组 氯化锂3 L i 3 组 H o e c h s t染 色观察海马C A 1区神经元凋亡的变化 免疫荧光染色观察海马C A 1区G S K 3 及p G S K 3 S e r 9 的变化 结果 与S H组比较 I R组细胞凋亡明显 P 0 0 1 与I R组比较各氯化锂组凋亡细胞明显减少 P 0 0 5或P 0 0 1 氯化锂剂量越大 凋亡细胞 减少越明显 P 0 0 5或P 0 0 1 各组G S K 3 阳性反应颗粒数差异无显著性 与S H组相比I R组p G S K 3 S e r 9 明显增多 P 0 0 1 与I R组比较各氯化锂组p G S K 3 S e r 9 明显增多 P 0 0 1 氯化锂剂量越大 增多越明显 P 0 0 5或P 0 0 1 结论 氯化锂能剂量依赖性的减轻大鼠短暂性局灶性脑缺血后海马C A 1区神经细胞凋亡 增加海马C A 1区p G S K 3 S e r 9 表达 关键词 脑缺血 细胞凋亡 氯化锂 G S K 3 大脑中动脉闭塞 中图分类号 R 7 4 3 3 1 Q 7 4 文献标识码 A 文章编号 1 0 0 7 4 3 6 8 2 0 0 7 0 5 0 4 0 7 0 4 Ef f e c t so f l i t h i u m c h l o r i d eo nn e u r o n a l a p o p t o s i sa n de x p r e s s i o no f g l y c o g e ns y n t h a s e k i n a s e G S K 3 b e t ao f h i p p o c a mp a l C A 1r e g i o na f t e r t r a n s i e n t f o c a l c e r e b r a l i s c h e mi a r e p e r f u s i o ni nr a t s WA N GX i n h e WA N GB i n 1 Q I A NY a n n i n g D e p a r t m e n to fA n e s t h e s i o l o g y t h eF i r s tA f i l i a t e d H o s p i t a lo fN J M U N a n j i n g2 1 0 0 2 9 1 D e p a r t m e n to f P h a r m a c o l o g y N J M U N a n j i n g 2 1 0 0 2 9 C h i n a A b s t r a c t O b j e c t i v e T oo b s e r v et h ee f f e c t o f l i t h i u mc h l o r i d eo nn e u r o n a l a p o p t o s i s a n dG S K 3 o f h i p p o c a m p a l C A 1a r e aa f t e r t r a n s i e n t f o c a l c e r e b r a l i s c h e m i a r e p e r f u s i o ni nr a t s Me t h o d s 1 2 6m a l eS Dr a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t on o r m a l g r o u p N O g r o u p s h a mo p e r a t i o ng r o u p S Hg r o u p i s c h e m i a r e p e r f u s i o ng r o u p I Rg r o u p L i 1g r o u p L i 2g r o u p a n dL i 3g r o u p T h ec h a n g eo f n e u r o n a l a p o p t o s i s i nt h eC A1r e g i o nw a s e x a m i n e db yH o e c h s t s t a i n i n g T h ee x p r e s s i o na n dd i s t r i b u t i o no f G S K 3 a n dp G S K 3 S e r 9 i nt h ec e l l w a s e x a m i n e db yi m m u n o f l u o r e s c e n c ea n a l y s i s R e s u l t s T h ea p o p t o t i cn u c l e i c o u l db ed e t e c t e ds i g n i f i c a n t l yi nI R g r o u p s c o m p a r e dw i t hS Hg r o u p P0 0 5 P G S K 3 S e r 9 i n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya f t e r r e p e r f u s i o n P 0 0 1 L i t h i u mc h l o r i d et r e a t m e n t c a nd o s ed e p e n d e n t l yi n c r e a s et h e e x p r e s s i o no f p G S K 3 S e r 9 c o m p a r e dw i t hI Rg r o u p s P 0 0 1 C o n c l u s i o n L i t h i u mc h l o r i d ec a nd o s ed e p e n d e n t l ys u p p r e s s n e u r o n a l a p o p t o s i s a n dG S K 3 e x p r e s s i o na f t e r M C A O r e p e r f u s i o n K e yw o r d s b r a i ni s c h e m i a a p o p t o s i s l i t h i u mc h l o r i d e G S K 3 m i d d l e c e r e b r a l a r t e r y o c c l u s i o n A c t a U n i v M e dN a n j i n g 2 0 0 7 2 7 0 5 4 0 7 4 1 0 南京医科大学学报 自然科学版 A C T AU N I V E R S I T A T I SM E D I C I N A L I SN A N J I N G N a t u r a l S c i e n c e 第2 7卷第5期 2 0 0 7年5月4 0 7 第2 7卷第5期 2 0 0 7年5月南京医科大学学报 的失活形式 4 6 锂有抗神经元凋亡的作用 7 1 0 体外 实验表明锂可以直接或间接促进G S K 3 S e r 9的磷 酸化 4 1 1 1 2 这可能是锂抗神经元凋亡的机制之一 但在动物实验中锂与G S K 3 的关系鲜见报道 本 研究自2 0 0 5年1 0月 2 0 0 6年7月在大鼠大脑中动 脉闭塞 m i d d l ec e r e b r a l a r t e r yo c c l u s i o n M C A O 模 型上 观察G S K 3 及p G S K 3 S e r 9 的变化 以探 讨在体研究中锂对G S K 3 的影响 1材料和方法 1 1材料 雄性S D大鼠 1 2 6只 清洁级 体重2 8 0 3 2 0g 1 8 2 2周龄 购于江苏省实验动物中心 无水氯化锂 美国A m r e s c o公司生产 南京大致生物科技有限公 司分装 H o e c h s t 3 3 2 5 8染色试剂盒 苏州碧云天生 物技术研究所 多克隆羊抗p G S K 3 S e r 9 美国 S a n t ac r u z公司 驴抗羊I g G F I T C 美国S a n t ac r u z 公司 多克隆兔抗G S K 3 H 7 6 美国S a n t a c r u z 公司 抗兔C y 3免疫荧光染色试剂盒 苏州碧云天 生物技术研究所 1 2方法 1 2 1动物分组 S D大鼠1 2 6只 随机分为正常组 N O组 n 6 缺血再灌注组 I R组 n 2 4 假手术组 S H组 n 2 4 氯化锂1组 L i 1组 n 2 4 氯化锂2组 L i 2组 n 2 4 氯化锂3组 L i 3组 n 2 4 除正 常组外 其余各组按不同观察时间点 M C A O6h M C A O 1天 M C A O 3天 M C A O 7天 再分为4个亚 组 每个亚组6只大鼠 正常组不予任何处理 各氯 化锂组于再灌注后即刻用相应剂量 1 3m m o l k g 的氯化锂腹腔注射 以后每2 4h1次 直至处死 缺 血再灌注组和假手术组以同等体积生理盐水替代 氯化锂腹腔注射 1 2 2动物模型 M C A O方法参考L o n g a E Z等 1 3 介绍的线栓法 2 戊巴比妥钠0 2 5m l 1 0 0g腹腔注射麻醉后行右 侧M C A O 栓线深度 2 0 3 m m 9 0m i n后再灌注 监测并控制肛温在 3 7 0 5 选清醒后左侧肢体 不能完全伸展或爬行时向左侧转圈或倾倒者入组 假手术组栓线深度小于1 5m m 1 2 3标本采集 各组大鼠在规定时间点 参照卞清明等 8 介绍 的方法行升主动脉插管灌注及固定 鼠脑于冰冻切 片机中做冠状切片 片厚1 0 m 每个鼠脑标本于视 交叉后1 7 4 0m m 海马齿状回互包平面 随机选 择6张切片作观察 1 2 4免疫荧光染色 2 4孔培养板中操作 常规间接染色法 F I T C C y 3双荧光标记 一抗稀释比均为1 1 0 0 空白对 照以P B S替代一抗 1 2 5 H o e c h s t凋亡染色 同张切片经上述处理后 继续于2 4孔培养板 中行H o e c h s t 3 3 2 5 8染色 按试剂盒说明书进行 切 片移至载玻片 抗荧光淬灭封片剂封片 荧光显微 镜下于海马C A 1区随机取三个高倍 4 0 0 视野 分 别在红 绿 蓝三种荧光下观察并拍照 1 3统计学方法 照片以i m a g e J 1 3 6 b软件处理分析 所有数据均 以平均数 标准差 x s 表示 以S t a t a8 0做单因 素方差分析 两两比较采用S c h e f f e法 P 0 0 5为 差异有统计学意义 2结果 2 1 H o e c h s t凋亡染色 N O组与S H组拟缺血侧海马C A 1区未见或偶 见凋亡细胞 与相同时点S H组比较 I R组海马 C A 1区细胞凋亡明显 P 0 0 1 M C A O后1天凋 亡细胞数达到高峰 P 0 0 1 各L i组凋亡细胞比 相同时点I R组明显减少 P 0 0 1 氯化锂剂量越 大 凋亡细胞减少越明显 P 0 0 1 但仍多于S H 组 P0 0 5 I R 组和各氯化锂组海马C A 1区阳性反应颗粒均较相 同时点S H组明显增多 且多分布于核内 P 0 0 1 各L i组的阳性反应颗粒数均比相应时间点的I R组 明显增多 P 0 0 1 氯化锂剂量越大 增多越明显 P 0 0 5或P0 0 5 N O组和S H组 阳性反应多位于胞质 I R组和各L i组的阳性反应 多位于细胞核 I R组和各L i组G S K 3 阳性反应颗 粒在细胞内的分布无差异 表3 图1 C 封二 3讨论 体内和体外研究都发现锂盐有抗神经细胞凋 4 0 8 表2各组大鼠各时间点的右侧海马C A 1区p G S K 3 S e r 9 阳性反应颗粒数的比较 T a b2 N u mb e r o f p G S K 3 S e r 9 p o s i t i v e p a r t i c l e s i nr i g h t h i p p o c a mp u s C A 1a r e ai ne a c hg r o u pa t d i f f e r e n t t i me x s n 6 个 0 0 5m m 2 N O组 S H组 I R组 L i 1组 L i 2组 L i 3组 0 2 4 0 8 3 0 2 7 5 8 9 0 8 7 5 7 5 1 2 4 7 1 3 7 1 5 1 3 1 2 7 1 8 1 7 8 6 0 2 7 2 8 9 1 1 3 3 8 2 1 6 0 5 1 0 8 1 8 5 3 1 2 6 2 1 5 3 4 2 0 2 5 5 8 0 1 5 4 0 1 1 4 2 0 4 0 1 2 5 2 3 5 5 1 0 8 2 5 7 8 9 8 0 2 7 2 7 9 2 0 1 0 9 9 2 3 5 8 5 2 2 5 6 3 1 2 1 2 8 0 2 1 1 9 组别M C A O6hM C A O1dM C A O3dM C A O7d 与S H组比较 P 0 0 1 与I R组比较 P 0 0 1 与L i 1组比较 P 0 0 5 P 0 0 1 与L i 2组比较 P 0 0 5 P 0 0 1 亡的作用 7 9 1 1 1 4 为进一步明确其机制 本研究采用 M C A O再灌注模型 再灌注后腹腔注射氯化锂 以 往的研究发现 由于锂本身的毒性作用 氯化锂剂 量不宜超过3m m o l k g 1 5 这和R e n等 1 4 的结果一 致 所以选择氯化锂的剂量为1 3m m o l k g 海马 C A 1区属缺血易损区 有利于观察缺血造成的病理 变化 I R组大鼠缺血侧海马C A 1区可见明显凋亡细 胞 各氯化锂组海马C A 1区的凋亡细胞数量均比相 同时间点I R组的凋亡细胞数量明显减少 随着氯 化锂剂量的增加 凋亡细胞数量逐渐减少 这提示 脑缺血再灌注后给予锂盐 仍可体现锂盐具有剂量 依赖性的抗神经元凋亡作用 各组大鼠海马C A 1区G S K 3 阳性反应颗粒数 之间无显著差异 N O组和S H组G S K 3 主要位于胞 质 核中较少 I R组和各氯化锂组则有大量G S K 3 分布于胞核 可见 M C A O再灌注后 G S K 3 蛋白合 成量没有改变 主要变化是G S K 3 由胞质到核内 的转移 这可能因为多数凋亡调节因子位于核内 G S K 3 必须移位到核中才能影响它们的作用 应 用氯化锂后 G S K 3 阳性反应颗粒数和胞内的分 布与I R组比较无显著差异 说明氯化锂对G S K 3 的合成量和G S K 3 细胞质核迁移过程均无影响 P G S K 3 S e r 9 是G S K 3 的失活形式 其含 量代表G S K 3 的活性 4 5 N O组和S H组p G S K 3 S e r 9 含量很少 且多见于细胞质中 I R组p G S K 3 与S H组比较 P 0 0 1 与I R组比较 P 0 0 1 与L i 1组比较 P 0 0 5 P 0 0 1 与L i 2组比较 P 0 0 5 P 0 0 1 与M C A O 1 天比较 P 0 0 1 表1各组大鼠不同时间点右侧海马C A 1区凋亡细胞数比较 T a b1 N u mb e r o f a p o p t o s i s c e l l i nr i g h t h i p p o c a mp u s C A 1a r e ai ne a c hg r o u pa t d i f f e r e n t t i me x s n 6 个 0 1m m 2 N O组 S H组 I R组 L i 1组 L i 2组 L i 3组 0 0 7 0 8 0 0 7 0 8 1 4 3 1 0 0 8 6 0 8 0 6 2 0 8 0 6 0 0 9 0 0 5 0 6 2 1 8 0 7 1 5 2 0 8 1 2 5 1 1 1 0 5 0 6 0 0 7 0 8 1 6 6 0 8 0 9 8 0 8 0 8 2 0 8 0 6 5 0 6 0 0 8 0 8 1 2 3 0 8 0 9 3 1 0 0 6 8 0 8 0 5 7 0 8 组别M C A O6hM C A O1dM C A O3dM C A O7d 表3各组大鼠在MC A O后各时间点的右侧海马C A 1区G S K 3 阳性反应颗粒数比较 T a b3 C o mp a r i s o no f t h e n u mb e r o f G S K 3 p o s i t i v e p a r t i c l e s i nr i g h t h i p p o c a mp u s C A 1a r e ai ne a c hg r o u p a t d i f f e r e n t t i me x s n 6 个 0 0 5m m 2 N O组 S H组 I R组 L i 1组 L i 2组 L i 3组 6 2 6 3 3 8 7 6 3 3 7 4 1 4 6 1 9 2 3 6 7 6 0 7 0 3 6 1 6 2 3 8 3 4 9 6 2 8 8 1 9 3 6 1 5 3 2 2 6 6 0 9 2 3 6 2 6 2 6 2 4 4 6 6 5 6 3 3 9 0 6 1 3 5 2 3 5 6 1 6 2 5 8 3 6 4 8 8 4 6 5 6 4 1 0 5 0 1 5 9 6 5 3 1 4 6 2 7 7 4 7 1 6 3 8 7 3 2 2 6 3 0 3 2 6 2 6 1 7 0 3 4 6 5 9 5 0 4 5 2 6 2 3 0 3 6 7 组别M C A O6hM C A O1dM C A O3dM C A O7d 王新河等 短暂性局灶性脑缺血再灌注后氯化锂对大鼠海马C A 1区神经元凋亡及糖原合成酶激酶 3 的影响 第2 7卷第5期 2 0 0 7年5月4 0 9 第2 7卷第5期 2 0 0 7年5月南京医科大学学报 S e r 9 比S H组显著增多 说明M C A O后机体可能 为了减少神经元凋亡而抑制了G S K 3 的活性 L i 1 L i 2 L i 3组p G S K 3 S e r 9 含量均比相同时间 点I R组明显增多 氯化锂的剂量越大 p G S K 3 S e r 9 阳性反应颗粒数越多 这说明氯化锂可以促 进G S K 3 S e r 9位点的磷酸化 锂促进G S K 3 的 S e r 9磷酸化的具体机制尚不确定 体外实验中发 现 锂通过激活磷脂酰肌醇 3激酶 P I 3 K 后者 又激活蛋白激酶B A k t 1 5 或蛋白激酶 C P K C 4 A k t和P K C可以磷酸化G S K 3 的S e r 9 锂也可 直接作用于G S K 3 1 2 磷酸化其S e r 9从而抑制其 活性 研究发现M C A O后 氯化锂可以显著增加大 鼠海马A k t的活性 A k t极可能是G S K 3 的上游调 节因子 1 6 本实验结果提示大鼠M C A O后 氯化锂对 G S K 3 的合成量没有影响 但氯化锂可以剂量依 赖性的促进海马C A 1区的G S K 3 S e r 9位点的磷酸 化 从而抑制了G S K 3 的活性 这可能是锂抗神经 元凋亡作用的机制之一 参考文献 1 P a r k e rP J C a u d w e l lF B C o h e nP G l y c o g e ns y n t h a s e f r o mr a b b i t s k e l e t a l m u s c l e e f f e c t o f i n s u l i no nt h es t a t e o f p h o s p h o r y l a t i o no f t h e s e v e np h o s p h o s e r i n e r e s i d u e s i n v i v o J E u r J B i o c h e m 1 9 8 3 1 3 0 1 2 2 7 2 3 4 2 Q uL H u a n gS B a l t z i sD e t a l E n d o p l a s m i cr e t i c u l u m s t r e s si n d u c e sp 5 3c y t o p l a s m i cl o c a l i z a t i o na n dp r e v e n t s p 5 3 d e p e n d e n t a p o p t o s i s b y a p a t h w a y i n v o l v i n g g l y c o g e n s y n t h a s e k i n a s e 3 b e t a J G e n e s D e v 2 0 0 4 1 8 3 2 6 1 2 7 7 3 X a v i e r I J M e r c i e r P A M c L o u g h l i nC M e t a l G l y c o g e n s y n t h a s ek i n a s e3 b e t an e g a t i v e l yr e g u l a t e sb o t hD N A b i n d i n ga n dt r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t i e s o f h e a t s h o c kf a c t o r 1 J J B i o l C h e m 2 0 0 0 2 7 5 3 7 2 9 1 4 7 2 9 1 5 2 4 K i r s h e n b o i m N P l o t k i nB S h l o m oS B e ta l L i t h i u m m e d i a t e dp h o s p h o r y l a t i o no fg l y c o g e ns y n t h a s ek i n a s e 3 b e t ai n v o l v e s P I 3k i n a s e d e p e n d e n t a c t i v a t i o no f p r o t e i n k i n a s e C a l p h a J J M o l N e u r o s c i 2 0 0 4 2 4 2 2 3 7 2 4 5 5 S t a m b o l i c V Wo o d g e t tJ R M i t o g e n i n a c t i v a t i o n o f g l y c o g e ns y n t h a s ek i n a s e 3b e t ai ni n t a c t c e l l s v i as e r i n e 9p h o s p h o r y l a t i o n J B i o c h e mJ 1 9 9 4 3 0 3 P t 3 7 0 1 7 0 4 6 H a b a sA K h a r e b a v aG S z a t m a r iE e ta l N M D A n e u r o p r o t e c t i o na g a i n s tap h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 3k i n a s e i n h i b i t o r L Y 2 9 4 0 0 2b yN R 2 B m e d i a t e ds u p p r e s s i o no f g l y c o g e ns y n t h a s ek i n a s e 3 b e t a i n d u c e da p o p t o s i s J J N e u r o c h e m 2 0 0 6 9 6 2 3 3 5 3 4 8 7 施韬 1 钱燕宁 1 王 斌 2 等 氯化锂预处理对沙土 鼠前脑缺血保护作用的病理观察 J 南京医科大学学 报 2 0 0 3 2 3 3 2 4 3 2 4 5 T 0 0 1 8 卞清明 1 钱燕宁 1 王 斌 2 等 沙土鼠前脑缺血后海 马P 5 3蛋白的表达及氯化锂的干预作用 J 南京医科 大学学报 2 0 0 4 2 4 2 1 6 5 1 6 7 F 0 0 3 9 卞清明 2 钱燕宁 1 氯化锂对沙土鼠前脑缺血后神经 细胞凋亡及磷酸化A k t蛋白表达的影响 J 南京医科 大学学报 2 0 0 5 2 5 8 5 4 0 5 4 3 F 0 0 2 1 0 H u g h e sK N i k o l a k a k i E P l y t eS E e t a l M o d u l a t i o no f t h e g l y c o g e n s y n t h a s e k i n a s e 3 f a m i l y b y t y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o n J E M B OJ 1 9 9 3 1 2 2 8 0 3 8 0 8 1 1 B h a t R V S h a n l e yJ C o r r e l l M P e t a l R e g u l a t i o na n d l o c a l i z a t i o no ft y r o s i n e 2 1 6p h o s p h o r y l a t i o no fg l y c o g e n s y n t h a s ek i n a s e 3 b e t ai nc e l l u l a ra n da n i m a l m o d e l so f n e u r o n a l d e g e n e r a t i o n J P r o cN a t l A c a dS c i USA 2 0 0 0 9 7 2 0 1 1 0 7 4 1 1 0 7 9 1 2 K l e i nP S M e l t o nD A Am o l e c u l a rm e