QPCR技术细节.ppt

程涛中国科学院生物化学与细胞生物学研究所 细节决定成败QPCR的技术细节对实验结果的影响 内容概要 实时定量PCR技术 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化 通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析 与常规PCR技术比较 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析 无法对起始模板准确定量 无法对扩增反应实时检测 荧光定量PCR原理 扩增曲线荧光阈值Ct值 荧光定量PCR原理 在PCR反应中 DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理 反应初期 目的DNA片段呈指数扩增 随着目的DNA产物逐渐积累 在引物一模板与DNA聚合酶达到一定比例时 酶的催化反应趋于饱和 此时扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态 即出现 停滞效应 又称 平台期 到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数 PCR扩增效率 DNA聚合酶种类和活性 以及非特异产物的竞争等因素 到达平台期前 TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上PCR循环 多数情况下 平台期在PCR反应中不可避免 PCR产物的积累规律 PCR产物的积累规律示意图 荧光定量PCR定量原理 扩增曲线 荧光定量PCR定量原理 为什么终点定量不准确呢 荧光定量PCR定量原理 尽管终点产物的量不恒定 但人们发现Ct cyclethreshold 与模板起始浓度有密切联系 Ct值的定义 PCR扩增过程中 扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数 Cycle 循环数 Rn 荧光强度 Ctvalue 荧光定量PCR原理 Ct值 前15个循环信号作为荧光本底信号 baseline 荧光阈值的缺省设置是3 15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置 大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值 进入指数期的最初阶段真正的信号 荧光信号超过阈值 荧光定量PCR原理 荧光阈值 定量PCR的数学原理 定量PCR的数学原理 定量PCR的数学原理 定量PCR的数学原理 模板DNA量越多 荧光达到域值的循环数越少 即Ct值越小 Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系 线性关系 扩增效率确认 检测灵敏度确认 NoTemplateControl NTC 确认 PCR扩增效率 E 0 9 1 1 35Cycles内可得到好的定量结果如果采用SYBR检测方法 30Cycles内无非特异性产物扩增 35Cycles内无引物二聚体产生 相关系数 r2 大于0 98 荧光定量PCR反应性的确认 内容概要 非特异性荧光标记SYBRGreenI特异性荧光标记TaqManProbe 常用荧光标记方法 SYBRGreenI染料法 原理 SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料 SYBRGreenI 热变性 引物退火 延伸反应 SYBRGreenI染料法 作用机理 问题点 SYBRGreenI与双链DNA进行结合后散发荧光 因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生 也将同时被检测到 从而可能导致检测结果不准确 SYBRGreenI染料法 问题点与关键点 关键点 设计合适引物 防止非特异性扩增 将温度与荧光强度的变化求导 dI dT 原始图谱 对数图谱 SYBRGreenI染料法 融解曲线 SYBRGreenI染料法 融解曲线 对DNA模板没有选择性使用方便 不必设计复杂探针具有价格优势 优点 容易产生假阳性对引物特异性要求较高不能进行多重定量 缺点 SYBRGreenI染料法 优缺点 Taqman探针法 原理 5 端标记有报告基团 Reporter R 如FAM VIC等3 端标记有荧光淬灭基团 Quencher Q 探针完整 R发射的荧光能量被Q基团吸收 无荧光 R与Q分开 发荧光Taq酶有5 3 外切核酸酶活性 可水解探针 Taqman探针法 工作机理 1 引物 探针的设计 探针Tm为68 70 30bp 5 不能有G G可能会淬灭荧光素 引物尽量靠近探针 扩增片段 400bp 引物Tm为59 60 2 反应参数的确定 一般为 94 10 20S60 30 60S Taq酶5 3 外切核酸酶活性在60 最高 也可通过温度梯度优化退火温度3 优化引物和探针浓度 获得最小Ct值 最大信号 背景比值引物浓度 50 900nM探针浓度 50 250nM4 其他与常规PCR相同 Taqman探针法 PCR体系的建立 Taqman探针法 荧光标记物的选择 高度特异性重复性好可进行多重定量 优点 只适合一个特定的目标委托公司标记 价格较高不易找到本底低的探针 缺点 Taqman探针法 优缺点 不同定量方法的比较 SYBR法实验流程及注意事项 样品制备 模板准备 引物设计 反应条件优化 浓度确定 技能要求 环境要求 误差控制 数据分析 仪器软件 RT 上机 反应体系优化 试剂选择 分析方法 样品制备 环境要求 模板准备 数据分析 RT 上机 浓度确定 SYBR法实验流程及注意事项 RT 反应体系优化 试剂选择 样品制备 模板准备 数据分析 上机 SYBR法实验流程及注意事项 模板准备 引物设计 浓度确定 环境要求 误差控制 RT 样品制备 数据分析 上机 反应体系优化 上机 反应条件优化 RT 样品制备 模板准备 数据分析 SYBR法实验流程及注意事项 标准品 待测样本 阳性对照 阴性对照 技能要求 误差控制 上机 试剂选择 RT 样品制备 模板准备 数据分析 SYBR法实验流程及注意事项 溶解曲线 扩增曲线 1 95oCfor15min2 94oCfor10sec3 Gradientfrom45oCto65oCfor15sec4 72oCfor30sec5 83oCfor1sec6 PlateRead7 Gotoline239moretimes8 Meltingcurvefrom65oCto95oC readevery0 2oC hold1sec Real timePCR体系优化 误差分析及操作规范 同一cDNA样品的三个重复 误差分析及操作规范 如图一系列梯度稀释的模板 理论上它们在扩增曲线上的CT值之差 应该相等 但是后边几个浓度低的样品CT值明显提前了 由熔解曲线可知对于浓度低的样品 引物二聚体引起的误差非常严重 1 模板浓度越低 染料法的误差越大 误差分析及操作规范 2 某一孔荧光信号特别强 原因 试剂配制时反应液没完全溶化 导致探针量在一管中增多 试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同 也可能是PCR仪热槽被荧光物质污染 这时就要清除热槽中的污染 3 样品浓度跨度过大 样品浓度过高 至阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向下的直线 误差分析及操作规范 4 部分样本扩增效率过低 原因 提取液残留 一定程度抑制了PCR反应 反应液未严格取量混匀或分装不均匀 试剂失效 误差分析及操作规范 5 阴性对照或空白对照翘尾 原因 模板提取环境有污染 模板提取操作有污染 试剂配制过程存在污染 误差分析及操作规范 6 直线型扩增曲线 原因 探针部分降解 探针降解原因 a 探针反复冻融 稀释的探针可在4 保存至少3个月 应避免反复冻融 b 探针在光线下暴露时间太长 反应液中有PCR抑制物 误差分析及操作规范 7 山坡形曲线 原因 常因反应管封口不严 至反应液蒸发所致 误差分析及操作规范 8 扩增曲线断裂 原因 基线选取范围不对 基线终点大于Ct值 这通常是由于模板DNA浓度过高所致 因Ct值 15 而基线范围仍取3 15 其中包含部分扩增信号 导致标准差偏大 阈值过高 解决办法 减少基线终点至Ct值前4个循环 重新分析数据 误差分析及操作规范 9 基线下滑 原因 基线选取范围不对 可试着将基线范围改大一些 这一问题常因试剂质量所致 误差分析及操作规范 10 没有扩增曲线 原因 PCR参数设置错误 在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步 即stage1阶段 电脑设定了自动休眠 误差分析及操作规范 11 扩增曲线有一向上或向下的尖峰 原因 反应过程中电压不稳定 可能在20循环左右仪器有停下或者仪器有开盖 使得光线突然增强 如果尖峰向下 也可能是卤素灯老化所致 这时应更换 误差分析及操作规范 数据分析 软件系统 分析方法 上机 RT 样品制备 模板准备 相对定量 2 Ct法绝对定量 标准曲线法 可靠 准确的数据 SYBR法实验流程及注意事项 内容概要 绝对定量解析方法 绝对定量的定义 Log 起始浓度 与循环数呈线性关系 通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线 即得到该扩增反应存在的线性关系根据样品Ct值 就可以计算出样品中所含的模板量 质粒标准品的制备 拷贝数的计算 待测样本浓度 ng ul OD260 40 稀释倍数样本分子量 碱基数 324待测样本拷贝数 copies ul 待测样本浓度 样本分子量 6 1014 倍比梯度稀释方法 1v原液 标准品i 9v稀释缓冲液 得标准品ii1v标准品ii 9v稀释缓冲液 得标准品iii1v标准品iii 9v稀释缓冲液 得标准品iv1v标准品iv 9v稀释缓冲液 得标准品v 质粒标准品稀释方法与拷贝数计算 方法 从组织中提取RNA并进行反转录 以SYBR法进行荧光定量检测试剂 DBI公司SYBRrealtimePCR试剂标准品 质粒标准品浓度为106 105 104 103 2个重复 设阴性空白对照实验步骤 提取RNA并反转录 设计特异引物 荧光定量扩增 结果分析 获取样品中目的基因的精确copy数 绝对定量实验例 实验数据 绝对定量实验例 扩增效率 E 计算E 10 1 斜率 1 10 1 3 17 1 2 03 1 1 03 标准曲线制作 利用MeanCt作图可得到标准曲线 y 3 17x 37 52R2 0 9988 绝对定量实验例 相关系数 R2 大于0 98 越接近1 结果可信度越高 扩增效率 E 0 9 1 1 越接近1 越理想 未知样品拷贝数的计算 将Ct值带入线性方程 20 5 3 1726X 37 52 QuantityUnknown 105 36 229087copies 绝对定量实验例 相对定量解析方法 相对定量的必要性 以上条件不可能同时得到满足 必须用内对照基因 管家基因 进行校正 进行相对表达量分析 管家基因维持细胞基本代谢活动所必须的基因 如 GAPDH Actin 18SrRNA等 筛选方法 根据文献提供通过具体实验筛选 相对定量分析 管家基因筛选 双标准曲线法2 Ct法 相对定量分析 两种常用的分析方法 通过标准曲线对对照样品 待测样品的目的基因及管家基因进行定量 然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量 相对值 校正值 目的基因定量结果 管家基因定量结果 待测样品的校正值 对照样品的校正值 相对定量分析 双标准曲线法 公式 优点 分析简单 实验优化相对简单缺点 对每一个基因 每一轮实验都必需做标准曲线应用 基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一 相对定量分析 双标准曲线法 实验数据 公式 F 2 相对定量分析 2 Ct法 优点 无需作标准曲线缺点 假定扩增效率为100 假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致 实验条件优化较为复杂应用 基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一 实验数据 Sample 处理前 处理后 Jun MeanCt GAPDH MeanCt E 1816 1717 4 1 951 95 2 Ct法 假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100 Ct 处理前 18 17 1 Ct 处理后 16 17 4 1 4 Ct Ct 处理后 Ct 处理前 1 4 1 2 4比率 处理后 处理前 2 Ct 2 2 4 5 3所以Jun基因在处理后表达水平比处理前高5 3倍 相对定量分析 2 Ct法 发表文章 ActivationofVascularEndothelialGrowthFactorReceptor 3inMacrophagesRestrainsTLR4 NF BSignalingandProtectsagainstEndotoxinShock Immunity 2014 影响因子 20 72 HCV InducedmiR 21ContributestoEvasionofHostImmuneSystembyTargetingMyD88andIRAK1 PlosPathog 2013 影响因子 9 12 InhibitionofLysylOxidaseAmelioratesInflammationandExperimentalPulmonaryFibrosis JMOLCELLBIOL 2014 影响因子 7 31 ExogenousMelatoninModulatesApoptosisintheMouseBrainI