真核生物的遗传分析

第十章真核生物的遗传分析 了解真核生物基因组的特点了解遗传标记的分类掌握各种遗传标记的原理及其应用 第一节遗传标记 遗传学中通常将可识别的等位基因称为遗传标记 geneticmarker 遗传标记可用于基因的连锁分析 基因定位 遗传作图和基因转移的鉴定 RFLP AFLP RAPD 限制性酶消化和分子杂交技术为基础 以PCR技术为基础 SSRInDelSNP 以Sequence PCR技术为基础 一 形态标记 形态标记即植物的外部形态特征 如矮秆 白化 变态叶 雄性不育等 就是一种特定的肉眼可见的外部特征 二 细胞学标记 染色体的变化常常会引起某些表型性状的异常 从而可以将染色体的变化作为一种遗传标记 来分析测定基因所在的染色体及相对位置 也可通过染色体置换等进行基因的定位染色体数目的变化 如单体 缺体 三体 四体 染色体结构的变异 如缺失 易位 倒位 重复等 染色体核型 染色体数目 大小 随体有无 着丝粒位置等 和带型 C带 N带 G带等 三 生化标记 同工酶 isozyme 指同一种酶具有多种不同形式 它们催化同样的生化反应 这类结构不同功能相似的酶称为同工酶同工酶标记的特点 可以通过两点或三点测验定位于染色体上编码同工酶的等位基因是共显性的同工酶标记的不足 具有组织特异性发现同工酶标记有限 四 分子标记 遗传标记多态性形成的分子基础均是基因组DNA的变异 而分子标记所揭示的多态性是直接反映基因组DNA间的差异 1 分子标记的优越性 直接以DNA的形式表现数量多 遍及整个基因组 检测位点近乎无限多态性高 自然存在着许多等位变异 不需要专门创造特殊的遗传材料表现为 中性 即不影响目标性状的表达 与不良性状无必然的连锁有许多分子标记表现为共显性 2 分子标记技术分类 一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术 主要有限制性片段长度多态性标记 Restrictionfragmentlengthpolymorphisms 简称RFLP标记 可变数目串联重复序列标记 Variablenumberoftandemrepeats 简称VNTR标记 原位杂交 insituhybridization 等另一类是以聚合酶链式反应 Polymerasechainreaction 简称PCR反应 为基础的各种DNA指纹技术第三类是一些新型的分子标记 如单核苷酸多态性 Singlenucleotidepolymorphism 简称SNP 表达序列标签 Expressedsequencestags 简称EST 和反转录转座子 Retro transposon 等 RFLP标记 RFLP restrictionfragmentlengthpolymorphism 称为限制性片段长度多态性 是指用限制性内切酶酶切不同个体的基因组DNA后 含有与探针序列同源的酶切片段在长度上的差异 基因组DNA DNA小片段 按DNA分子大小顺序分开 尼龙膜 转移 杂交 同源序列结合 探针的限制性酶切片段多态性 X光片 放射自显影 RFLP标记的原理 电泳检测 2 RFLP标记的特点 无表型效应RFLP标记具有共显性的特点RFLP具有种族特异性RFLP标记范围遍及全基因组 RFLP标记不足之处 DNA量大 5 15ug 检测步骤繁琐 需要的仪器 设备较多 周期长用作探针的DNA克隆其制备与存放较麻烦检测中要利用放射性同位素 通常为32P 易造成环境污染虽然也可以用非放射性物质 如Biotin系统 Dig系统及Ecl系统 替代同位素 其杂交信号相对较弱 灵敏度较同位素标记低得多且价格较高 1944 TheNobelPrizeinChemistry1993 二 PCR标记 PCR是Mullis等 1985 首创的在模板DNA 引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下 依赖于DNA聚合酶的体外酶促反应 以合成特异DNA片段的一种方法 其特异性取决于引物与模板DNA结合的特异性 1 PCR反应过程 3步 变性 denaturation 94 96 1 5min 目的使样品DNA解链 复性 annealling 36 60 1 2min 使引物与模板DNA片段结合 延伸 extension 70 72 1 2min 根据模板DNA 在Taq酶作用下合成DNA 30 35次循环可将某一特定DNA序列扩增105 107 从而可以通过琼脂糖凝胶分开 UV观察 PCR检测DNA多态性的优点 与RFLP相比 模板DNA用量少 对模板DNA纯度要求不高 程序简单 分析周期大大缩短 PCR的特点 2 PCR的扩展 单引物PCR标记随机扩增多态性DNA标记 RandomamplificationpolymorphismDNA 简称RAPD标记 引物为10个随机核苷酸组成任意引物PCR标记 Arbitaryprimerpolymerizedchainedreaction 简称AP PCR标记 引物长度与一般PCR引物相当 开始退火温度低允许错配 后正常PCR 具有随机性单重复序列中间区域标记 Intersimplesequencerepeatspolymorphisms 简称ISSR标记 在SSR引物端加2 4个简并核苷酸组成 具有较好的随机性和稳定性 RAPD标记 RAPD标记是用随机排列的寡聚脱氧核苷酸单链引物 通常长度为10个核苷酸 通过PCR扩增染色体组中的DNA所获得的长度不同的多态性DNA片段 RAPD 经典PCR 引物个数 1对 1个 55 60 复性温度 36 扩增产物 特异扩增 随机扩增 10bp 20bp 引物长度 RAPD与经典PCR区别 B 双引物选择性扩增的PCR标记 主要通过引物3 端碱基的变化获得多态性 这种标记主要指扩增片段长度多态性标记 Amplifiedfragmentlengthpolymorphism 简称AFLP标记 AFLP标记 1 AFLP标记的基本原理 C 需要通过克隆 测序来构建特殊双引物的PCR标记 SSR SimpleSequenceRepeat Nakamura 1987 发现生物基因组内有一种短的重复次数不同的序列 统称可变数目串联重复序列 Variablenumbertandemrepeat 简称VNTR VNTR标记包括小卫星 minisatellites 标记和微卫星 microsatellites 标记微卫星DNA又称SSR simplesequencerepeats 它是一类由1 6个碱基组成的基序 motif 串联重复而成的DNA序列 如 CA n AT n GCT n GATA n等重复 其中n代表重复次数 SSR分子标记的特点 数量几乎无限 检测出多态性的频率极高SSR一般检测的是一个单一的多等位基因位点SSR标记为共显性标记 可鉴别出杂合子和纯合子结果重复性高 稳定可靠 为了提高分辨力 通常使用可检测出单拷贝差异的聚丙烯酰胺凝胶电泳兼具PCR反应的优点 即所需DNA样品量少 对DNA质量要求亦不苛刻 明恢63与珍汕97杂交 回交BC1F1 wx基因SSR图谱 12 1 珍汕972 明恢63 利用卫星DNA进行亲子鉴定的基本原理 CAPS标记 利用PCR产物专门检测内切酶位点变异间的差异如PCR产物无多态性 通过测序 可能发现它们之一的酶切位点 如EcoRI 具有突变 五 单核苷酸多态性 Singlenucleotidepolymorphism SNP 标记 单核苷酸多态性 Singlenucleotidepolymorphism SNP 是指不同个体基因组DNA序列之间单个核苷酸的差异 SNP共有4种转换形式C T G A 转换最为常见 约占4种SNP转换的2 3 C A G T C G G C T A A T 1 SNP的分类 在基因组DNA中 任何碱基都有可能发生变异 因此SNP既有可能在基因序列内 也有可能在基因序列外 基因组内的SNP分为两种形式 一是遍布于基因组非编码区中的大量单碱基核苷酸变异另一是主要分布于基因编码区内 Codingregion 的突变 故又称其为cSNP 从对生物遗传性状的影响上来看 cSNP又可分为两种 一种是同义cSNP SynonymouscSNP 即SNP导致的突变碱基与未突变碱基在氨基酸密码的变异上属于同义突变 从而使得基因编码序列的改变并不影响其所翻译蛋白质的氨基酸序列的改变 另一种是非同义cSNP Non synonymouscSNP 指突变碱基序列的改变导致氨基酸的改变 从而使其蛋白质序列发生改变 影响蛋白质的功能 2 SNP的检测方法 直接测序法 直接测序对不同个体进行的PCR扩增 然后对扩增片段测序比较是发现SNP的最常用方法 DNA芯片法 检测SNP的最佳方法是新近发展起来的DNA芯片技术 SNPs的大规模发现和识别与DNA芯片技术的发展和应用关系密切 基于生物信息学的SNP候选位点搜索 公共数据库中公布有大量的序列信息 其中包括表达序列标签 ESTs 序列标签位点 STSs cDNA文库和基因组测序DNA序列 在这些序列之间必然存在大量的重叠区域 通过比较这些重叠区域 就可获得大量的SNP 并且成本可以大大降低 3 SNP作为遗传标记的优越性 位点丰富 数量多 分布广泛具有较高的遗传稳定性易于基因分型SNP适于快速 高通量检出因SNP的二态性 更有利于发展自动化的筛选或检测技术 六 插入缺失 InDel 标记 InDel标记是指通过比较基因组学发现不同基因组中缺失或者插入DNA片段 表现出的多态性InDel标记的设计主要是在插入 缺失片段的两侧设计PCR引物 然后 通过扩增两特定引物之间的片段 从而由于插入 缺失片段在不同个体之间产生多态性 InDel标记与SSR标记一样 具有PCR技术的特点 全基因组分布 数量多 稳定 共显性的特点 在基因组中的位置恒定 五 分子标记的应用 建立分子标记遗传连锁图谱进行基因定位和基因克隆可用于品种鉴定 纯度鉴定 亲子鉴定杂种优势遗传机理研究动植物的起源和进化研究 Humanchromosomes withsegmentscontainingatleasttwogeneswhoseorderisconservedinthemousegenomeascolorblocks Eachcolorcorrespondstoaparticularmousechromosome ConservedsegmentsintheHumanandmousegenome Litigation Forensicscience paternity patentapplicationandinfringement DNA指纹技术发明人杰夫里斯 法医利用DNA指纹鉴定罪犯 亲子鉴定实验室 她们真是母女吗 右图的男子汉 就是左图怀里抱着的婴儿 和中图左侧站着的儿童吗 DNA指纹曾用于鉴定一个坟墓的墓主是否路易十七本人 从而解决了法国历史上的一个悬案 原来法国资产阶级革命胜利后 路易十六被送上断头台 他的儿子按照王室惯例自动登基 这个尚未成年的路易十七被革命党囚禁 后来病死并被就地安葬 保皇党则宣扬他已越狱逃到了国外 并声称坟墓的主人是他的替身 这事一时成为法国历史上的悬案 到20世纪80年代 法国利用DNA指纹技术才确定了坟墓的主人是路易十七本人 右图是防腐药剂浸泡着的路易十七的心脏 曾被偷运出国和辗转在国外 历史真相大白后才送回法国公开展览 第二节真核生物基因组 一 基因组与C值 基因组 genome 一个物种单倍体的染色体的数目及其所携带的全部基因称为该物种的基因组 C值 Cvalue 指一个物种单倍体DNA含量 几种代表性生物的基因组 每类生物最小基因组的大小基本上对应于生物在进化上所处地位的高低 进化地位高 形态结构复杂高的一类生物 其最小基因组也较大 每一类生物的最小基因组比较 C值悖理 Cvalueparadox 指C值的大小并不能完全说明生物进化的程度和遗传复杂性的高低 即物种的C值和它的进化复杂性之间没有严格的对应关系 第三节真核生物基因组DNA序列的复杂度 一 重复序列的检测 DNA复性首先取决于互补的DNA序列之间的随机碰幢 所以DNA复性是一个双分子二级反应 单链消失速度的微分方程为 1 C 1 C0 kt C0是t 0时的DNA初始浓度 表明所有的DNA均为单链 当t t1 2时 即C C0 1 2 50 单链复性 C C0 1 2 1 1 kC0t1 2 实验中有很多因素会影响复性的速度 如果把多种因素 温度 离子强度 DNA片段大小等 都控制起来 剩下唯一可变的因素就是DNA序列的复杂性 x 复杂性与C0t1 2成正比 x kC0t1 2 假设基因组中每一种基因只有一个 即都是单拷贝序列 那么基因组愈大则基因组的复杂性愈大 复性速率愈小 k也愈小 C0t1 2与非重复序列的基因组大小呈正比 Thereassciationrates C C0 ofDNAderivedfromphageMS2 phageT4 andE coli 基因组DNA序列的分类 根据基因组DNA分子的结构和功能区分为 1 基因序列和非基因序列 基因序列指基因组中决定蛋白质的DNA序列 openreadingframe ORF 非基因序列指除基因组外的所有DNA序列 主要指两个基因之间的间插序列 interveningsequence 2 编码序列和非编码序列 编码序列是指编码RNA和蛋白质的DNA序列 外显子 基因的内含子序列以及居间序列的总和统称为非蛋白质编码序列 3 单一 unique 序列和重复 repetitive 序列 前者指基因组中只出现1次或2 3次的DNA序列 后者指重复多次的DNA序列 中度重复序列 高度重复序列 长度6 200bp 106拷贝以上 大部分在异染色质处 着丝粒或端粒附近 三 卫星DNA 卫星DNA satelliteDNA 指一类高度重复的DNA序列DNA分子在介质氯化铯中作密度梯度离心 DNA分子按其大小分布在氯化铯介质中 根据荧光强度分析可见一条主带以外还有一个或多个卫星带 这些卫星带中的DNA被称为卫星DNA 其含量少于主带中的DNA 浮力密度也低 卫星DNA分类按浮力密度大小分类I 1 687g cm3 II 1 693g cm3 III 1 697g cm3 IV 1 700g cm3 按重复单元的核苷酸多少分类小卫星DNA minisatelliteDNA 由几百个核苷酸对的单元重复组成微卫星DNA microsatelliteDNA 由2 20个左右的核苷酸对的单元重复成百上千次所组成 果蝇 Dvirilis 的卫星DNA 隐蔽序列 crypticsatelliteDNA 是指多种串联重复的DNA分子 离心时不象卫星那样分开 属性类似与卫星DNA 第三节基因家族 一 基因家族的类型和Alu家族基因家族 genefamily 指真核生物基因组中有许多来源相同 结构相似 功能相关的一组基因可归结为一个基因家族假基因 pseudogene 指同一基因家族中没有功能的成员 基因家族的几种类型 A 简单多基因家族 5SrRNA B 复杂多基因家族 海胆和果蝇的5个组蛋白基因 重复上千次 果蝇的tRNA C 不同场合表达的多基因家族 人的血红蛋白基因属于不同发育阶段表达的复杂多基因家族 Alu家族 Alufamily 人的基因组中约有5 105 7 105拷贝 平均每隔6kb就有一个Alu序列 总数约300 000个 一个典型的Alu序列长300bp 其中含有Alu限制性内切酶特异性识别序列AG CT 可将该片段切割为170bp和130bp两个片段 因此这一长度和性质相似的重复序列称为Alu家族 Hinf家族与多聚 dT dG 家族 Hinf家族是以319bp串联重复存在于人体基因组中 用限制性内切酶HinfI消化可以分离到172bp和147bp两个亚单位多聚 dT dG 家族是以散在地分布于基因组中 以dT dG头尾衔接的串联重复序列家族 二 基因簇与假基因 指一个基因家族的成员紧密连锁成簇状排列于某一染色体上 形成一个基因簇 genecluster 如人的血红蛋白 haemoglobin 基因家族 由 珠蛋白基因簇和 珠蛋白基因簇组成 embryogenesis G andA fetalstage and expressedfollowingbirth 1withinsubfamily zeta expressedinearlyembryonicstageandtwo geneexpressedinfetal 1 andadultstages 2 and aretwopseudo genes 由于移码突变 终子密码子突变和碱基突变和缺少内含子等不能产生有功能的蛋白质 假基因与有功能的基因同源 原来可能属有功能的基因 由于缺失 deletion 倒位 inversion 或突变 mutation 等原因使该基因失去活性而成为无功能的基因 第四节真核生物基因的丢失 扩增与重排 一 基因丢失基因丢失 geneelimination 某些原生动物 线虫 昆虫和甲壳类动物等在个体发育和分化过程中 可以通过丢失某些基因而去除这些基因的活性的现象小麦瘿蚊的个体发育过程中 其极细胞质的核保留了40条染色