杉木基因组DNA的提取实验方案.doc

DNA提取方案一：手磨提取杉木基因组DNA的提取 1)在l0mL离心管中加入3mL 2xCTAB提取缓冲液，650C水浴预热: 2)材料1g,剪碎，在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中，剧烈摇动混匀，650C水浴保温45min，其间摇动2次: 3)加入等体积的氯仿/异戊醇(24: 1)溶液，颠倒混匀，室温下静置5-l0min,使水相和有机相分层: 4)室温下11000rpm离心l0min; 5)仔细移取上清液至另一个l 0mL离心管:6)重复4-5步骤二至三次;（具体次数示抽取效果而定，标准是两相间分层界面没有或少有白色蛋白漂浮物） 7)仔细移取上清液至另一个l0mL离心管，加2倍体积的冰乙醇，上下颠倒，室温静置5-10min（或加入1.5倍体积异丙醇(预冷)，混匀，-200C放置2-3h）8) 40C11000rpm离心l0min(如果沉淀很多，可用带够的毛细管直接勾出。 9)弃上清，用75%的预冷乙醇洗涤两次，自然风干沉淀，加适量（100ul）的ddH20溶解沉淀。试剂配方 2XCTAB提取缓冲液: CTAB 20g/L PVP 2.5% NaCI 1.4mo1/L EDTA(pH=8.0) 20mmo1/L Tris -C1(pH=8.0) 100mmo1/L 琉基乙醇2%(用前加入)方案二：机磨提取 1)把材料剪碎，放入2mL离心管中（大约1/3的管体积），每管放入钢珠（一大四小），然后整管放到液氮中保存（等其他样本准备好后，一起研磨）2）把样管放入配置器中，（两个配置器两边一定要平衡，配置器用前放入-200C预冷）。并用液氮速冻。3）用研磨仪，两边平衡，28Hz, 2min15s。4)在2mL离心管中加入1mL 2xCTAB提取缓冲液，剧烈摇动混匀，650C水浴保温45min，其间摇动2次: 5）把样管离心（2500rpm,1min），取上清到新管中。6)加入等体积的氯仿/异戊醇(24: 1)溶液，颠倒混匀，室温下静置5-l0min,使水相和有机相分层: 7)室温下11000rpm离心l0min; 8)仔细移取上清液至另一个2mL离心管:9)重复4-5步骤二至三次;（具体次数示抽取效果而定，标准是两相间分层界面没有或少有白色蛋白漂浮物） 10)仔细移取上清液至另一个2mL离心管，加2倍体积的冰乙醇，上下颠倒，室温静置5-10min（或加入1.5倍体积异丙醇(预冷)，混匀，-200C放置2-3h）11) 40C11000rpm离心l0min(如果沉淀很多，可用带够的毛细管直接勾出。 12)弃上清，用75%的预冷乙醇洗涤两次，自然风干沉淀，加适量（100ul）的ddH20溶解沉淀。DNA质量要求（127与144号DNA为参照）经分光光度计检验，本试验中各样品的DNAOD260/OD230值均在1.8以上，表明蛋白质等杂质均较少，DNA纯度较高，OD260/OD280值均在1.7-2.0之间。 据一般物种的SSR反应体系的要求，DNA在30-100ng/ul均可满足SSR-PCR的要求。（如DNA浓度高的话，可加水稀释至合适浓度）。 或经1%琼脂糖检验。SSR引物引物Tm36543850545587559348985410054143542494929749220533535041850反应程序：94预变性5min; 94变性45S，Tm+10退火45S，每个循环下降0.5 72延伸1min. 20个循环:93变性45s，50退火45s，72延伸1min，20个循环；72 延伸 l0min，最后4 保温。 反应体系：10ul体系Buffer：1ulMg：0.5uldNTP：0.2ulP1:0.2ulP2:0.2ulDNA: 60ng左右Tap：0.1ul水（灭菌）补齐至10ul。PCR产物检验10%聚丙烯酰胺凝胶配制1) 10%丙烯酰胺聚丙烯酰胺的配制(500mI):称取210g尿素，1g甲叉，49g丙烯酰胺，加入500mI烧杯中，加入少量水和10TBE 50mI。用搅拌器搅拌均匀，用微波炉加热4次。直到透明无杂质。用双蒸水定容到500mI,溶后，4冰箱避光保存。2) 10TBE配制:称取54gTris碱，27.5g硼酸，20m1 0.5M EDTA(pH=8.0)。加入双蒸水600m1搅拌均匀，最后用双蒸水定容到1L。3)显影液的配制:称取NaOH 1 5g,l0m1 0.756%四硼酸钠和10ml甲醛，用双蒸水定容到1L,在室温保存。4)固定液的配制:称取200ml无水乙醇和10ml乙酸，加入2L烧杯中，用双蒸水定容到2L。5 ) AgNO3原液的配制:称取AgNO37.5g溶解到50ml双蒸水中。将2500ulAgNO3原液加入250m1H2O中配制成工作液。2.2.2.2 做胶，银染1) 50ml 10%PAGE胶，300ul10%APS, 50u1TEMED，依次混合，充分摇匀。2)用清水将玻璃板反复冲洗干净，干燥。将玻璃板泡入硅化剂中半小时，在通风橱中晾干，涂上反硅化剂。待干燥后，使用垫片进行玻璃板的组装，灌胶。注意灌胶过程中小能留有气泡，一旦有气泡产生就用小刀轻轻将其挤破。最后垂直插入梳子，待胶凝固。3)把玻璃板固定在垂直板电泳槽上，在上下槽分别加入1 TBE Buffer。将梳子轻轻拔出。用移液器反复吹打加样孔，以清除加样孔中沉淀的丙烯酰氨和尿素。l0m1PCR产物中加入7ml溴酚蓝混匀，取1ul混合液加入凝胶梳孔中。4) 220V电压电泳，直到溴酚蓝中的二甲苯青电泳到凝胶底部，取凝胶。5)银染:固定:取合适的塑料盘，倒入2000ml新鲜配制的银染固定液，放入凝胶，在摇床上轻摇1