产前诊断.pdf

1 FISH技术在产前诊断中的应用 北京金菩嘉医疗科技有限公司北京金菩嘉医疗科技有限公司 概述 产前诊断又称宫内诊断 是指胎儿出生前采 用各种方法预测其是否有先天性疾病 包括畸形 和遗传性疾病 为能否继续妊娠提供科学依据 产前诊断是一个正迅速发展 技术不断完善的新 领域 是围产医学的重要组成部分 对提高人口 素质 实行优生优育具有重要意义 染色体异常改变 数目异常 数目异常 三倍体 和 四倍体 非整倍体 21 18 13 XO XXY 等 三倍体 和 四倍体 非整倍体 21 18 13 XO XXY 等 结构异常结构异常 平衡改变 易位和 倒位 不平衡改变 缺失 扩增 环状染色体 和等臂染色体 平衡改变 易位和 倒位 不平衡改变 缺失 扩增 环状染色体 和等臂染色体 染色体异常在自发性流产中的发生率染色体异常在自发性流产中的发生率 6四倍体 4染色体重排 26三倍体 23其他 521号染色体三体 520号染色体三体 318号染色体三体 1616号染色体三体 52总发生率 常染色体三体 1常染色体单体 2045 X 非整倍体 发生率 类型 6四倍体 4染色体重排 26三倍体 23其他 521号染色体三体 520号染色体三体 318号染色体三体 1616号染色体三体 52总发生率 常染色体三体 1常染色体单体 2045 X 非整倍体 发生率 类型 产前诊断的方法 第一类是采用特殊仪器检查胎儿体表是否有畸形 如用X线照片或 体表造影 B型超声扫描间接观察 或胎儿镜下直接观察 此类检查 属形态学水平 第二类是采用母体血 尿等特殊检查 间接诊断胎儿先天性疾病 孕期少量胎儿血细胞 可扩散的代谢产物及蛋白质 酶 可通过胎盘 进入母血循环 这是母血 尿可作某些疾病产前诊断的基础 如测定 母血甲胎蛋白 AFP 诊断胎儿神经管畸形 NTD 测定孕妇尿甲基 丙二酸诊断胎儿甲基丙二酸尿症 第三类是直接获取胎血 羊水或胎儿组织来诊断胎儿疾病 三类检查方法 可以形态学 染色体 酶学 代谢产物和基因形态学 染色体 酶学 代谢产物和基因五个水平 进行产前诊断 常见染色体异常疾病 2 唐氏综合症 21号染色体三体 95 97 多余的染色体来自母亲 唐氏综合症与母亲的年龄有关系 无诱因 21号染色体三体 95 97 多余的染色体来自母亲 唐氏综合症与母亲的年龄有关系 无诱因 活产新生儿发病率为1 800 到 1 1 100 唐氏综合症与文化 种族 社会阶层以及 地理区域都没有必然的联系 活产新生儿发病率为1 800 到 1 1 100 唐氏综合症与文化 种族 社会阶层以及 地理区域都没有必然的联系 智能较正常儿童低 认知困难 发育迟缓 他们也有很特殊的面貌 通常双眼距离较 远 眼睛向上斜 鼻梁骨平坦 嘴 牙齿及耳朵均细小 肌张力低 智能较正常儿童低 认知困难 发育迟缓 他们也有很特殊的面貌 通常双眼距离较 远 眼睛向上斜 鼻梁骨平坦 嘴 牙齿及耳朵均细小 肌张力低 唐式综合症在活产中的发生率及与孕妇年龄的关系 1 251 351 5043 1 101 201 2545以上 1 201 301 4044 1 301 451 6542 1 401 651 8541 1 601 751 10040 1 751 1001 14039 1 1001 1201 17538 1 1301 1501 22537 1 1751 2001 27536 1 2401 2501 35035 1 3251 50034 1 4201 65033 1 75032 1 90031 1 90030 1 110025 29 1 140020 24 1 125015 19 绒毛膜活检羊膜穿刺检查胎儿出生时孕妇年龄 岁 发生率 唐氏综合症相关基因 21号染色体上的关键片断 包括 DSCR 21q22 3 DSCR2 21q22 3 DSCR3 21q22 2 DSCR4 21q22 2 D21S55 21q22 2 Turner 综合症 两个x染色体的全部或者部分丢 失 只发生在女性 是最常见的染色体异常导致的 疾病 活产女性新生儿发病例 大约为1 2500 身材矮小 卵巢不发育 性幼 稚 蹼颈 肾脏和甲状腺有 问题 骨骼畸形等 生长激素治疗 雌激素替代治 疗 和其他生殖技术治疗 DiGeorge综合症 Velocardiofacial综合症 DiGeorge综合症 胎儿或新生儿先天性心脏病 临床症状 为心脏发育异常 胸腺发育不良或胸腺缺失导致免疫系统 异常 通常无面部发育异常 全世界发病率1 4000 Velocardiofacial综合症 颚心面综合症 临床症状为心 脏发育异常 面部发育异常等 全世界发病率1 2000 4000 基因异常改变 异常改变片断 22q11 2缺失 90 DiGeorge病人和约85 Velocardiofacial病人 异常改变片断 22q11 2缺失 90 DiGeorge病人和约85 Velocardiofacial病人 改变方式 间隙缺失占90 以上 其余则为染色体结构畸形如平衡易 位 倒位 改变方式 间隙缺失占90 以上 其余则为染色体结构畸形如平衡易 位 倒位 DiGeorge关键区域 DiGeorge critical region DGCR 基因 包括 DGCR1 TUPLE1 HIRA DGCR2 IDD LAN UFD1L GNB1L等 DiGeorge关键区域 DiGeorge critical region DGCR 基因 包括 DGCR1 TUPLE1 HIRA DGCR2 IDD LAN UFD1L GNB1L等 3 何时考虑应用FISH检测 怀孕20周以上需要进行产前染色体诊断 怀孕3个月超声检测发现胎儿情况严重 比如13或18号 染色体三体 孕妇年龄 血清学筛查或者超声检测发现其属于常染 色体三体核型高危人群 孕妇急切希望了解胎儿是否存在染色体异常 比如在 前一次怀孕中曾发现胎儿染色体异常的情况 FISH Fluorescence in situ hybridization FISH是一门新兴的分子细胞遗传学技术 是 20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术 的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术 广泛应用于动植物基因组结构研究 染色体 精细结构变异分析 病毒感染分析 人类产前诊 断 肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域 原理 用已知的标记单链核 酸为探针 按照碱基互补 的原则 与待检材料中未 知的单链核酸进行异性结 合 形成可被检测的杂交 双链核酸 由于DNA分子在 染色体上是沿着染色体纵 轴呈线性排列 因而可以 探针直接与染色体进行杂 交从而将特定的基因在染 色体上定位 荧光标 记探针 探针变性 样本 荧光标 记探针 探针变性 样本DNADNA变性 杂 交 变性 杂 交 FISH技术在产前诊断中的优点 操作简便 探针标记后稳定 可与多种技术结合 可成功地帮助细胞遗传学家做出回顾性分析 能迅速得到结果 操作简便 探针标记后稳定 可与多种技术结合 可成功地帮助细胞遗传学家做出回顾性分析 能迅速得到结果 24小时就可以完成检测 灵敏度及特异性高 能检测染色体微小缺失及重排 并能明确标记染 色质性质 标本来源丰富 间期细胞 分裂中期细胞 分化或未分化细胞及死亡或 存活的细胞皆可以被检测 小时就可以完成检测 灵敏度及特异性高 能检测染色体微小缺失及重排 并能明确标记染 色质性质 标本来源丰富 间期细胞 分裂中期细胞 分化或未分化细胞及死亡或 存活的细胞皆可以被检测 centromere telomere subtelomere locus specific whole chromosome paint CSP探针 染色体 着丝粒探针 GLP探针 位点特 异性探针 WPP探针 全染色 体或染色体区域特 异性探针 CSP探针 染色体 着丝粒探针 GLP探针 位点特 异性探针 WPP探针 全染色 体或染色体区域特 异性探针 FISH探针的种类 操作流程简图 制片制片预处理预处理 FISH结果分析结果分析 破坏细胞膜利于探针 杂交 破坏细胞膜利于探针 杂交 蛋白酶消化 蛋白酶消化 HCl处理处理 变性变性 杂交杂交 洗涤洗涤 复染复染 制备的质量制备的质量 新鲜程度新鲜程度 4 未经培养的羊水细胞玻片的制备 4 6 ml 羊水羊水 离心 去上清 离心 去上清 37 C 1 5 5ml 胶原酶胶原酶B 20分钟分钟 37 C 2 5ml KCl低渗低渗 20分钟分钟 离心 去上清 离心 去上清 固定固定 固定液固定液 甲醇甲醇 乙酸乙酸 3 1 预固定 预固定 2ml 两次固定两次固定 5ml 滴片滴片 离心 去上清 离心 去上清 老化玻片老化玻片 5656 C 30分钟C 30分钟 室温过夜室温过夜 未经培养的羊水细胞玻片预处理 2XSSC漂洗漂洗 160 160 l 胃蛋白酶储存 液 20mg ml 胃蛋白酶储存 液 20mg ml 7 10分钟7 10分钟 2XSSC漂洗漂洗 脱水脱水 RNase A 37 C 室温室温 0 1M HCl 7 10分钟分钟 37 C 胃蛋白酶胃蛋白酶 FISH 2XSSC漂洗漂洗 60 60 l RNase A 100ug ml l RNase A 100ug ml 15min 1h15min 1h FISH实验 变性变性杂交杂交 洗涤洗涤DAPI复染复染 50 甲酰胺50 甲酰胺 2XSSC2XSSC 0 1 NP 400 1 NP 40 70 乙醇70 乙醇 探针变性探针变性 玻片变性玻片变性 70 甲酰 胺 甲酰 胺73 C 5min 42 C湿盒 孵育过夜 湿盒 孵育过夜 结果分析结果分析 唐氏综合症唐氏综合症 正常细胞判断 单个间期细胞红色及绿色 信号各 正常细胞判断 单个间期细胞红色及绿色 信号各2个个 异常细胞判断 单个间期细胞核中红色信 号为 异常细胞判断 单个间期细胞核中红色信 号为3 绿色信号为 绿色信号为2 表示 表示21号染色体三 体 绿色信号为 号染色体三 体 绿色信号为3 红色信号为 红色信号为2 表示 表示13 号染色体三体 红色信号为号染色体三体 红色信号为3 绿色信号为 绿色信号为 3 表示 表示21号及号及13号染色体同时三体 其他 异常情况 号染色体同时三体 其他 异常情况 随机计数细胞 至少计数随机计数细胞 至少计数50个细胞 个细胞 80 以上的细胞正常说明正常 以上的细胞正常说明正常 70 细胞 出现异常说明异常 如果无法判断则扩大 计数到 细胞 出现异常说明异常 如果无法判断则扩大 计数到100个细胞 个细胞 DSCR2探针 探针 GLP探 针 标记 探 针 标记红色荧光红色荧光 对照探针 对照探针 DLEU1探 针 标记 探 针 标记绿色荧光绿色荧光 染色体异常染色体异常 正常细胞判断 男性单个间期细胞核中天 蓝色信号 正常细胞判断 男性单个间期细胞核中天 蓝色信号2个 红色信号与绿信号各个 红色信号与绿信号各1个 女性单个间期细胞核中天蓝色信号 个 女性单个间期细胞核中天蓝色信号2个 绿 信号 个 绿 信号2个个 异常细胞判断 不同于正常细胞的即为异 常细胞 异常细胞判断 不同于正常细胞的即为异 常细胞 随机计数细胞 至少计数随机计数细胞 至少计数50个细胞 个细胞 80 以上的细胞正常提示为正常样本 以上的细胞正常提示为正常样本 70 细胞出现异常提示为异常样本 如果 结果不明确则扩大计数到 细胞出现异常提示为异常样本 如果 结果不明确则扩大计数到100个细胞 个细胞 CSP18探针 标记探针 标记天 蓝色荧光 天 蓝色荧光 CSP X探针 标记探针 标记 绿色荧光绿色荧光 CSP Y 探针 标记探针 标记 红色荧光红色荧光 5 DiGeorge综合症DiGeorge综合症 Velocardiofacial综合症Velocardiofacial综合症 正常细胞判断 单个中期细胞核中红色信 号及绿色信号均为 正常细胞判断 单个中期细胞核中红色信 号及绿色信号均为2个个 异常细胞判断 红色信号异常细胞判断 红色信号1个 绿色信号个 绿色信号2 个 表示个 表示TUPLE1基因发生缺失 红色信号基因发生缺失 红色信号 2个 绿色信号个 绿色信号1个 表示个 表示ARSA基因发生 缺失 其他异常情况 两种探针互为对照 基因发生 缺失 其他异常情况 两种探针互为对照 随机计数细胞 至少计数随机计数细胞 至少计数50个细胞 个细胞 80 以上的细胞正常提示为正常样本 以上的细胞正常提示为正常样本 70 细胞出现异常提示为异常样本 如果 无法判断则扩大计数到 细胞出现异常提示为异常样本 如果 无法判断则扩大计数到100个细胞 个细胞 TUPLE1探针 探针 GLP 探针 标记探针 标记红色荧光红色荧光 ARSA探针 探针 GLP探 针 标记 探 针 标记绿色荧光绿色荧光 总体注意事项 1 羊水制备玻片羊水制备玻片FISH分析后需要重新杂交的情况有 分析后需要重新杂交的情况有 一张玻片上细胞数不够一张玻片上细胞数不够50个 个 男性胎儿羊水样本检测出现女性细胞的细胞数大于总计数细胞的男性胎儿羊水样本检测出现女性细胞的细胞数大于总计数细胞的10 时 比如 时 比如50个细胞中有个细胞中有6个细胞出现此状况 说明羊水样本可能有母 体细胞的污染 此时只计数有 个细胞出现此状况 说明羊水样本可能有母 体细胞的污染 此时只计数有XY 男性 类型的细胞中 男性 类型的细胞中18号染色体的 数目 同时用 号染色体的 数目 同时用Y探针重新杂交已经做过探针重新杂交已经做过 DLEU1 DSCR2实验的羊水玻 片 以确定 实验的羊水玻 片 以确定DLEU1 DSCR2在男性细胞中的信号特征 在男性细胞中的信号特征 2 出现下列情况则认为结果不可靠 出现下列情况则认为结果不可靠 羊水样本离心后 若血细胞比例大于羊水样本离心后 若血细胞比例大于1 2 该样本应不用于 该样本应不用于FISH检测 若仍进行了 检测 若仍进行了FISH检测 并显示女性 检测 并显示女性 XX 细胞结果 该分析认为不可 靠 细胞结果 该分析认为不可 靠 每张玻片细胞计数少于每张玻片细胞计数少于50个 个 当扩大计数细胞至当扩大计数细胞至100个时 仍然只出现个时 仍然只出现70 以下的异常细胞或 以下的异常细胞或80 以下的正常细胞 以下的正常细胞 3 在在10 左右的羊水过少的孕妇中 羊水样本可能被大量母体细胞污染 致 使 左右的羊水过少的孕妇中 羊水样本可能被大量母体细胞污染 致 使FISH结果不准确 结果不准确 4 羊水样本有羊水样本有1 1500的几率即使羊水清亮 存在大量母体细胞污染 致使的几率即使羊水清亮 存在大量母体细胞污染 致使 FISH结果不准确 结果不准确 临床意义 13 18 21 X Y号染色体异常占产前染色体异常的号染色体异常占产前染色体异常的80 90 故而 故而13 21 18 X Y染色体数目异常是产前筛查的重点 染色体数目异常是产前筛查的重点 13号染色体和号染色体和21号染色体都是近端着丝粒染色体 没有特异的着丝粒探 针 故而选用位点特异探针 号染色体都是近端着丝粒染色体 没有特异的着丝粒探 针 故而选用位点特异探针 DLEU1位于位于13号染色体 属于稳定基因 可 作为判断染色体数目异常的指标 号染色体 属于稳定基因 可 作为判断染色体数目异常的指标 21号染色体特定区段 唐氏综合症判定 区 号染色体特定区段 唐氏综合症判定 区 DSCR 基因扩增是产生唐氏综合症的主要原因 基因扩增是产生唐氏综合症的主要原因 X和和Y染色体异常相关疾病有染色体异常相关疾病有Klinefelter综合症综合症 47 XXY 三倍体三倍体 X综合症综合症 47 XXX Turner综合症综合症 45 X 及及47 XYY综合症综合症 TUPLE1基因存在于基因存在于Digeorge关键区 关键区 22号染色体微缺失核心部位 该基 因缺失可判定有先天性心脏发育不全 在 号染色体微缺失核心部位 该基 因缺失可判定有先天性心脏发育不全 在Digeorge及及VCFS两种疾病中都 有出现 两种疾病中都 有出现 ARSA缺失为缺失为22号末端缺失综合症 常表现为智力低下 在此 处 号末端缺失综合症 常表现为智力低下 在此 处TUPLE1 ARSA探针互为内对照 探针互为内对照 参考文献 1 Hendrik P D D et al The 22q11 2 deletion From diversity to a single gene theory Genetics in Medicine 2001 3 1 2 4 2 Verayuth Praphanphoj Barbara K Goodman George H Thomas et al Cryptic subtelomeric translocations in the 22q13deletion syndrome J Med Genet 2000 37 58 61 3 Witters I Devriendt K Legius E et al Rapid prenatal diagnosis of trisomy 21 in 5049 consecutive uncultured amniotic fluid samplesby fluorescence in situ hybridizati