遗传学微核实验方案.doc

一、实验名称：蚕豆根尖的微核测试技术二、实验目的：1、应用蚕豆根尖微核实验技术2、测定蚕豆根尖细胞的微核率3、测定不同污水浓度梯度微核白分率三、实验原理：蚕豆根尖细胞在分裂时染色体的复制过程中常发生断裂，断裂下来的片段在正常情况下能自行复位愈合，如果此时受到外界诱变因子的作用，会阻碍染色体的愈合，于是会出现微核，由于产生的微核数量与外界诱变因子的强弱成正比，所以可用微核出现的百分率来评价环境诱变因子对生物遗传物质影响的程度。四、实验器材： 1、材料 蚕豆 什么污水？ 湿脱脂棉 青霉素空瓶 2、仪器显微镜、冰箱、解剖盘、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、试剂瓶、烧杯等显微镜压片实验用具3、试剂 蒸馏水 70%的乙醇 盐酸 席夫氏试剂 45%醋酸1.五、实验步骤： 1、种子浸泡 蚕豆种子按需要量放入盛有污水（三种不同浓度梯度污水）的烧杯中，置25温箱内，浸泡20至30小时，此期间至少换水2次，换用的水最好事先置于25温箱中预温。2、催芽 待种子吸胀后，用纱布松松包裹置解剖盘内，保持温度，在25的温箱中催芽12至24小时。待种子初生根露出2至3mm时，再选取发芽良好的种子，放入解剖盘内，仍置入25的温箱中继续催芽，注意保护湿度。再经24至36h，种子大部分初生根长至2至3cm，根毛发育良好，这时就可用来作为监测水源样品或药物溶液突变效应之间3、被检液处理根尖（蒸馏水对照） 选取初生根尖生长良好，根长一致的种子，放入盛有被测液的培养皿中，被测液浸泡住根尖即可，处理时间5至7h。另用蒸馏水设对照组。4、根尖细胞恢复培养 处理后的种子用自来水（或蒸馏水）浸洗三次，每次23分钟。洗净后再置入辅有湿脱脂棉中，按前述培养条件使根尖细胞在25下再恢复培养2224h。5、固定 将恢复后的种子，从根尖顶端切下1cm长的幼根放入青霉素空瓶中，用卡诺氏固定液固定24小时。固定后的根如不及时制片，可换入70%的乙醇溶液中置4冰箱中保存备用。6、解离 将固定好的幼根在青霉素瓶中用蒸馏水浸洗2次，每次5min。吸净蒸馏水，再加入5mol/L盐酸（HCl）将幼根泡住，连瓶放入28水浴锅中水解幼根25min左右，至幼根被软化即可。7、染色 用蒸馏水浸洗幼根三次，每次12分钟。截下12mm左右长的根尖，滴加席夫氏试剂，每瓶用量以淹没幼根液面高出2mm为好。除去染液，用SO2洗涤液浸洗幼根2次，每次35分钟。用蒸馏水浸洗幼根1次，5min。将幼根放入新换的蒸馏水中，置4的冰箱内保存，可供随时制片之用。8、装片制作 将幼根放在擦净的载玻片上，用解剖针截除根冠区，截留下1mm左右的根尖分生区。滴上少许45%的醋酸溶液，用解剖针将根尖捣碎。加盖一清洁的盖玻片，注意不要有气泡。再在盖玻片上加一小块滤纸，轻轻敲打压片。9、显微镜观察、微核细胞记数 找到分生组织区细胞分散均匀、膨大、分裂相对多的部位，再转到高倍镜（物镜40X）下进行观察 微核的识别标准 （1）凡是主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核。 （2）小核着色与主核相当或稍浅。 （3）小核形态可以是圆形、椭圆形、不规则形。 每一处理观察5个根尖，每个根尖观察100个细胞，并计数其中有微核的细胞数（微核百分率）六、结果分析与报告： 1、各测试样品微核百分率的计算各测试样品（包括对照组）微核百分率（MCN）的计算：=2、如果被检测样品不多，可直接用各样品微核千分率平均值与对照组比较（t检验），从差异的显著性判断水质污染与否。3、如被监测的样品较多，可先用方差分析看各采样点所出现的率平均值和对照的差异显著性，如差异显著，还可进行各采样占微核差异显著性的多重比较，看被检测样品率平均值差异显著性的分组情况，以归纳划分这些不同采样点不同级别的污染程度。4、如采用已筛选出的、又专门隔离栽培，无污染的松滋青皮豆作实验材料，并按规范标准实验条件，其监测样品污染程度的划分，可不用上述两种统计处理方法，而直接采用如下标准： 在10%以下为基本没有污染；10-12区间为轻污染；10-30区间为中污染；10以上为重污染。污染指数判别：此方法可避免应