THE 全文PDF - 促红细胞生成素的血液检测方法GUIDE DOWNLOAD.pdf

文章编号 10012747 2002 0320042204 促红细胞生成素的血液检测方法 周 刚 许豪文 华东师范大学 体育与健康学院 上海200062 摘 要 重组人促红细胞生成素 rHuEPO 被禁止用于提高运动员的成绩 但是用常规的检测方法很难区分内源 性EPO和外源性EPO 运动员使用EPO后 会导致其一些血液参数的变化 通过对这些血液参数的检测 可以间 接判定运动员是否使用了EPO 笔者综述了促红细胞生成素的血液检测方法的研究进展 明确指明了EPO血液检 测的原理和方法 并重点讨论了转铁蛋白受体和网织红细胞参数等指标的检测原理和方法 以及悉尼奥运会的 EPO血检方法 关键词 促红细胞生成素 重组人促红细胞生成素 血检 中图分类号 G80 4121 文献标识码 B Blood Detecting Techniques of Erythropoietin ZHOU Gang XU Hao wen College of Physical Education and Health East China Normal University Shanghai 200062 China 1 EPO和rHuEPO 增加红细胞量对于提高运动成绩的好处已被广泛的报 道 就目前而言 增加血红细胞量的途径主要有 持续的 艰苦训练或高原训练 采用血液回输技术 注射促红细胞 生成素 毫无疑问 即使在高水平运动员中 靠持续的艰苦训 练或高原训练 要大幅度地提高自身固有的血液浓度和血 红蛋白含量是很困难的 于是 有人便另辟 捷径 企图 通过采用不正当手段来实现上述目的 20世纪70年代 一 些长跑运动员曾在慕尼黑 1972 和蒙特利尔 1976 两届 运动会上利用自体输血的技术参加比赛 有的运动员还取 得了金牌 1 随着检测技术的发展 用常规的尿检方法已能 很容易地检测出血液兴奋剂的滥用 于是 一些运动员便 转向使用其它尿检不易查出的兴奋剂 这其中便包括 EPO 2 而今 促红细胞生成素已成为目前国际体坛 最具 欺骗性的药物 人体的肾脏能产生一种红细胞生成酶 erythrogenin 这种酶作用于肝脏所产生的促红细胞生成素的前身 一种 球蛋白 促红细胞生成原 erythropoietinogen 它们在血 浆中转变成人促红细胞生成素 Erythropoietin EPO 3 最 近发现 肝细胞和巨噬细胞也能产生EPO EPO属酸性糖 蛋白 它与红细胞前体细胞表面EPO受体结合 促进其血 红蛋白的合成 使之增殖分化成红细胞 从而调节体内红 细胞和血红蛋白的生理平衡 它的表达有其严格的组织特 异性 同时严格受体内氧分压的控制 正常情况下人血液 中EPO水平保持在4 10 3 24 10 3U mL 再生障碍性 贫血患者因组织严重缺氧 血液中EPO水平可高达10U mL 4 早年从再生障碍性贫血病人的尿中 胎肾细胞的培养 液中可获得较多的EPO 1985年应用基因重组技术 获得 重组人EPO Recombinant Human Erythropoietin rHuEPO 有 了大量纯品EPO的问世 使EPO得以在临床上广泛应 用 5 6 rHuEPO与EPO的作用极为相似 可以明显提高人 体的红细胞数量及血红蛋白含量 从而提高人体运输氧的 能力 提高人体最大摄氧量 在使用rHuEPO4 7d后 rHuEPO已恢复正常水平 应用常规检测的色谱学方法无法 查出 而其功效还可持续四周之久 这正是有氧耐力运动 员所期望的 因此 在2 0世纪80年代 人工合成的rHuE2 PO开始被用作体育训练及竞赛中的辅助药物 个别人为了 追求良好的训练及比赛成绩并逃避药检 越来越多地服用 此类药物 rHuEPO也被直接称为EPO 然而 rHuEPO的滥 用可导致血小板功能亢进 高血压 中风等疾病 严重者 甚至死亡 有鉴于此 1989年国际奥委会医学委员会将 EPO等4种人工合成的肽类激素正式列为禁用药物 2 rHuEPO的血液检测原理 由于检测技术的原因 EPO在体能类运动项目中的滥 24 西 安 体 育 学 院 学 报 JOURNAL OF XI AN INSTITUTE OF PHYSICAL EDUCATION Vol119 No13 July12002 第19卷第3期 2002年7月 收稿日期 2001 12 04 修回日期 2002 03 08 作者简介 周 刚 19672 男 重庆人 华东师范大学体育与健康学院运动人体科学硕士研究生 用一直无法进行有效的控制 有三个方面的因素限制了 EPO的检测 这些因素是 其一 rHuEPO与内源性EPO的 分子结构极为相似 EPO是一种含有166个氨基酸的单链酸 性糖蛋白 分子量为34000D 道尔顿 而rHuEPO的分子 量为30400D 也是单链糖蛋白 7 现在还没有技术能从统 计学上鉴别 分离和确定rHuEPO的数量 8 其二 rHuEPO 与内源性EPO相似的临床效果 其功能都是刺激造血祖细 胞分化为红细胞 其三 rHuEPO的平均半衰期大约为6h 大多数rHuEPO在1 3d内被身体清除 然而其功效仍可以 持续四周 9 10 因此 按常规的尿检或血检方法很难直接 检测出rHuEPO的存在 更少有机会通过血清的EPO水平检 测出滥用者 尤其是在竞赛期间 研究表明 在停止注射EPO四周后 体内EPO恢复到 正常水平 甚至低于正常水平 9 10 这就是说 为了保持 其有效性 兴奋剂使用者不得不在赛前四周内注射rHuE2 PO 而最佳的使用效果是在赛前两周内注射 这就给兴奋 剂检测者提供了一个检测出当前或最近使用了rHuEPO的运 动员的机会 从这个思路入手 一些研究表明 rHuEPO的使用不可 避免地会导致血液中一些生理生化指标的改变 这些指标 包括可溶性转铁蛋白受体 soluble transferrin Receptor sT fr 和与血红细胞及网织红细胞相关的各种参数 如红细胞压 积 hematocrit Hct 血红蛋白含量 Haemoqlobin Hb 和 网 织 红 细 胞 计 数 reticulocytecount retic 等 等 2 8 11 12 13 14 依赖于对这些间接指标的检测 与没有用 rHuEPO的正常人的指标相比较 可用于查明运动员当前或 近期滥用rHuEPO 这是目前EPO检测的一个现实思路 国际自行车联合会曾以红细胞压积 Hct 超过50 为 界线来判定使用了EPO 15 而国际业余滑冰组织则以血红 蛋白 Hb 超过1815g dL 1来判定明显地使用了 EPO 然 而 Hct和Hb是相当粗糙的血液特征检测指标 血液特征 受脱水 心情和运动方式的影响 并且50 的限制不排除 个别优秀运动员有自然的高Hct 早期 的 研 究 还 有 检 测 滥 用rHuEPO的 间 接 指 标 T fr 14 16 17 一项最近的研究指出 在最后一次使用rHuEPO 后的25d内 T fr还高于正常水平 一项运动员使用rHuEPO 的药动学研究表明 尽管用药后4到7天内EPO已回落到 正常水平 但直到用药后第14d 许多血液学指标还高于正 常水平 11 另外 最近的几项关于rHuEPO的研究报道 网织红细 胞绝对计数 retic 每个网织红细胞的血红蛋白含量 CHr 网织红细胞的血红蛋白总量 RetHb 血红细胞的 血红蛋白与网织红细胞的血红蛋白的比率 RBCHb RetHb 等指标也可做为检测rHuEPO的间接指标 8 10 11 国内外现在已有大量关于EPO检测方法的报道 下面 重点对EPO的血液检测方法做一综述 3 rHuEPO的血液检测方法 311 转铁蛋白受体 Transferrin Receptor T fr T fr为一双糖蛋白 分子量为2 94000D 实际上存在 于所有细胞的表面上 但成人中 约有80 存在于骨髓成 红细胞中 当红细胞受到EPO的刺激时 T fr会将与其结合 的血液中富含的转铁蛋白中的铁转移到血红蛋白的卟啉中 随着红细胞的成熟 T fr及T fr的一些碎片将被释放进入血 液循环 因此 以免疫方法定量测定血中的T fr及其碎片可 以提供一个可能的方法以检测外源EPO的使用 国内外许 多相关的实验都证实了T fr作为检测rHuEPO的间接指标的 可靠性 11 13 14 17 以下是一些这方面的实例 加拿大的Gareau等人报道 以50100IU kg1bw的EPO进 行每周三次的皮下注射后 以酶联免疫吸附法 ELISA 测 定给药组 n 24 血清中的T fr的浓度为3135 312ng mL 而对照组 n 6 的血清浓度为2195 225ng mL P 01 001 16 在 Gareau等人的另一项实验中也得出同样结果 rHuEPO的滥用导致T fr的延迟性增加和 fr 铁蛋白 的延迟 性减少 T fr fr升高 作者提出 可用T fr和T fr fr作为检测 运动员滥用rHuEPO的指标 14 方子龙等给6名健康青年男性受试者皮下注射rHuEPO 剂量为30IU kg体重 每周3次 持续4周 采用ELISA进 行指标测定 结果表明 注射rHuEPO能提高血清EPO浓度 和转铁蛋白可溶性受体T fr的浓度 在停药后1个星期左右 的时间内 T fr浓度仍保持在较高水平 结果提示 血清 EPO和T fr浓度有可能作为rHuEPO检测的指标 18 法国的Audran等人也做了相关的实验 给9名运动员 每人每天皮下注射50IU kg的rHuEPO 持续26天 分别于 用药期10 14 17 24天和用药后1 3 7 14 25天抽取 血样分析 结果表明 rHuEPO的滥用 使运动员的有氧能 力明显提高 同时 用药期间及停药两周内T fr和T fr fr均 显著升高 作者提出 以T fr高于10 g mL和T fr fr高于 153 来判定是否使用了rHuEPO 11 多年来 国外在T fr的检测方面已做了大量的研究 可 以肯定的是 T fr已成为目前EPO检测中最为可靠 最为常 用的指标 312 网织红细胞参数 网织红细胞 reticulocyte 是介于晚幼红细胞和成熟红 细胞之间尚未完全成熟的红细胞 因其胞质内尚存留多少 不等的嗜碱物质RNA 经煌焦油蓝 新亚甲蓝等活体染色 法染色后 嗜碱物质凝聚成颗粒 其颗粒又可联缀成线 而构成网织状 此种红细胞即网织红细胞 19 滥用rHuEPO 将导致血液中的网织红细胞的参数变化 这些参数包括网 织红细胞绝对计数 retic 每个网织红细胞的血红蛋白 含量 CHr 网织红细胞的血红蛋白总量 RetHb 血红 细胞的血红蛋白与网织红细胞的血红蛋白的比率 RBCHb RetHb 8 11 澳大利亚的Parisotto等人对此进行了深入的研究 在一 项实验中 8 他们以自行车 游泳 赛艇 田径和越野滑 雪等项目的国家级和世界级运动员 n 155 为对照组 对照组又分为模拟高原训练组和高原训练组 以健康的非 运动员男性 n 23 为实验组 实验组又分为三组 A组 在1 4 7 10天每天注射300U kg rHuEPO B组在1 5 34 第19卷 周 刚 等 促红细胞生成素的血液检测方法 第3期 9天每天注射400U kg rHuEPO C组在1 10天每天注射 600U kg rHuEPO 在第11天采样 采用流量血细胞计数法 进行分析 实验结果显示 注射rHuEPO的非运动员的网织 红细胞参数明显地不同于正常训练的优秀运动员的 也不 同于在高原或模拟高原训练的运动员的 注射rHuEPO的非 运动员的 retic增加近三倍 注射rHuEPO前后的 retic分 别为25 53 109 L和193 260 109 L RetHb增加近两 倍 同时 RBCHb RetHb明显降低 作者认为 最好的检 测rHuEPO的 指 标 是 retic 其 次 是RetHb和RBCHb RetHb 据此检测的失误率在10000例被试中不超过7例 95 置信区间 作者建议可用网织红细胞参数 retic RetHb RBCHb RetHb 作为检测优秀运动员当前或最近滥 用rHuEPO的间接指标 另外 这项实验同时也说明了高原 训练和模拟高原训练不影响这些指标的可靠性 上述Audran等人的实验也检测到 从注射rHuEPO到停 止使用rHuEPO的25天内 网织红细胞参数都发生显著性 变化 P 01 01 11 313 悉尼奥运会的EPO血检方法 1999年澳大利亚体育学院 AIS 成立了 EPO2000 科研攻关组 并协同澳大利亚体育运动兴奋剂检测实验室 ASDT L 联合进行一项注射EPO的课题 该课题后来被命 名为 EPO2000 研究计划 22 这项研究课题后来又有许多 国家和地区的专家共同参与攻关 包括澳大利亚 法国 加拿大 挪威和中国 上述研究者Parisotto Gareau Au2 dran等都参与了该计划 国际奥委会执委会在2000年8月28日正式通过了在悉 尼奥运会上采用 EPO2000 研究的EPO血检和尿检方法的 决定 其中澳大利亚科学家的血检研究成果意义更加重大 因为这是奥运会历史上引进的第一项血检技术 它突破了 尿检技术只有在服用EPO后三天内检测才有效的局限性 尿检方法为法国科学家研究成功 澳大利亚体育学院Parisotto等人2000年发表在血液学 杂志上的实验报告 20 成为国际奥委会最终同意在悉尼奥运 会进行血检的重要参考性文献 22 该实验将27名运动员分 为三组 EPO IM组 n 10 注射rHuEPO和铁 EPO OR组 n 8 注射rHuEPO和口服铁 安慰剂组 n 9 用药期为三周 每组被试在用药期和用药后四周内的血液 学和生化指标被检测 实验者从检测的众多指标中筛选出5 个指标 它们是 Hct 网织红细胞压积 reticulocyte hemat2 ocrit RetHct 巨 红 细 胞 百 分 比 percent macrocytes Macro 血清EPO和sT fr 实验设计了两种分析模型 ON model和OFF model ON model应用于rHuEPO使用期 在 rHuEPO使用期的最后两周 通过综合分析上述五个指标 能够检测出94 100 的rHuEPO使用者 OFF model应用 于停药后 综合分析RetHct EPO和Hct 在停药后的12 21天 能够检测出67 72 的rHuEPO使用者 由此证明 这五项指标可用于检测当前或最近滥用rHuEPO的运动员 澳大利亚和中国合作也做了相关的实验 在这项实验 中 Parisotto等人在悉尼和北京两地分别对49名和24名运 动员进行了EPO实验 每名被试每天被注射50 IU kg rHuE2 PO 持续25天 结果显示 两地被试血液中的上述五项指 标在注射rHuEPO期间及注射后4周内均有异常变化 作者 认为 通过检测这五项指标 完全可以准确地查出数周内 滥用rHuEPO的运动员 21 该实验的另一意义在于补充了 黄种人 人种 和中国人 民族 的EPO检测数据 综上所述 采用检测rHuEPO导致的血液中一些 间接 指标 的变化来判定优秀运动员当前或最近滥用rHuEPO是 行之有效的方法 尤其是综合多项指标来进行分析 并结 合尿检时 对于数周内使用rHuEPO者的检测 其准确率几 乎100 然而 尽管检测EPO的方法已日臻完善 但对于 高原训练与内源EPO的产生 不同地域和不同人种红细胞 数量的不同等方面研究成果还相对缺乏 这限制了EPO血 检技术的应用 这也是悉尼奥运会最终采用尿检与血检共 同使用 而不单以血检结果判定滥用rHuEPO的原因之一 如何解决这些难题 使EPO的检测方法准确而无隙可击将 是兴奋剂检测工作者进一步研究的课题 参考文献 1 许豪文 运动生物化学概论 M 北京 高等教育出 版社 2001 414 4161 2 Breymann C1Erythropoietin test methods J 1Baillieres Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2000 14 1 135 1451 3 吴祖泽 造血细胞研究的进展 J 生理科学进展 19791 10 1 4 Lin F K1cloning and expression of the human erythropoietin gene J 1Proc Natl Acad Sci USA 1985 82 7580 75841 5 Y oshimura A Arai K1Phyician Education The Erythropoietin Receptor and Signal Transduction J 1Oncologist 1996 1 5 337 3391 6 马大龙 生物技术药物 M 北京 科学出版社 20011181 7 杨树民 体育运动中的促红细胞生成素滥用及检测方 法 J 中国运动医学杂志 1997 16 4 285 2881 8 Parisotto R G ore CJ Hahn A G et al1Reticulocyte parame2 ters as potential discriminators of recombinant human erythro2 poietin abuse in elite athletes J 1Int J Sports Med 2000 21 7 471 4791 9 Lippi G Guidi G1Laboratory screeningfor erythropoietin abuse in sport an emerging challenge J 1Clin Chem Lab Med 2000 38 1 13 191 10 Souillard A Audran M Bressolle F et al1Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of recombinant human erythropoietin in athletes1Blood sampling and doping control J 1Br J of Clin Pharmacol 1996 42 355 3641 11 Audran M Gareau R Matecki et al1Effects of erythropoi2 etin administration in training athletes and possible indirect de2 tection in doping control J 1Med Sci Sports Exerc 1999 31 639 6451 下转第92页 44 第3期 第19卷 西 安 体 育 学 院 学 报 图2 铅球运动员最后用力阶段角度类 运动指标变化情况 单位 度 转动至正对投掷方向 形成最大 背弓 瞬间 运动员的 左肘姿态角逐渐加大 其中在最大 侧弓 瞬间增大的幅 度最大 躯干后倾角的变化不大 只是在最大 背弓 瞬 间略有增加 而左肩后倾角和铅球后倾角两个指标从运动 员左脚着地瞬间到最大 背弓 瞬间都有增加 说明这八 名铅球运动员在最后用力阶段 特别是在左脚着地瞬间到 最大 背弓 瞬间 左肩能够 扣住 没有过早地发生转 动 保持了身体充分扭紧的姿势 左肘与身体躯干的夹角 从右脚落地开始就已经增大 直至形成最大 背弓 的动 作姿势 左肘姿态角变化的幅度要比其它的技术指标大得 多 左肘的摆动在最后用力阶段是一种主动式的摆动 不 是随着身体的逐步抬起和转动而产生被动式的摆动 在动 作的实质上是在人体大脑有意识地支配下的一个技术动作 4 结 论 1 非投掷臂在最后用力阶段起着平衡身体 协调用 力的作用 2 最后用力阶段运动员非投掷臂摆动快慢 将直接 影响着投掷臂向前推送铅球的速度 3 最后用力阶段运动员非投掷臂摆动时机和轨迹 直接关系到铅球的飞行路线 4 最后用力阶段适当加大非投掷臂摆动幅度将有利 于增加铅球运行的工作距离 参考文献 1 全国体育学院教材委员会 田径运动高级教程 M 1 北 京 人民体育出版社 19941 2 阚福林 1 发展我国高水平女子铅球运动员专项速度的探 讨 J 1 田径 1992 43 3 20 221 3 张为桥 1 现代铅球左侧技术研究 J 1 天津体育学院学 报 1994 9 4 23 251 4 郭 进 张秋亚 1 用17个主要技术指标标准检查传统背 向滑步推铅球技术 J 1 田径指南 1995 9 36 381 5 熊 辉 李建良 蒋 勇 1 运动技术分析中的图像采集与 解析方法 J 1 体育科研 1995 4 34 351 6 魏 星 1 马永峰以19109米创造男子铅球亚洲记录的技 术动作 J 1 田径 1988 1 17 191 上接第44页 12 Birkeland KI Hemmersbach P1The future of doping control in athletes1Issues related to blood sampling J 1Sports Med 1999 28 1 25 331 13 Birkeland KI Stray Gundersen J Hemmersbach P et al1 Effect of rhEPO administration on serum levels of sT fR and cy2 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