醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白.doc

醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白【实验目的】掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白的原理和方法。【实验原理】 蛋白质是两性电解质。在pH值小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH值大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在同一pH的溶液中，所带净电荷不同，故可利用电泳法将它们分离。血清中含有清蛋白、-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸祖坟、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。由表可知，血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH值7.0，所以在pH8.6的缓冲液中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极移动。 表1 人血清中各种蛋白质的等电点及相对分子质量蛋白质名称等电点相对分子质量白蛋白4.88690001-球蛋白5.062000002-球蛋白5.06300000-球蛋白5.1290000150000-球蛋白6.857.50156000300000 在一定范围内，蛋白质的含量与结合的染料量成正比，故可将蛋白质区带剪下，分别用0.4mol/L NaOH溶液浸洗下来，进行比色，测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，测定其相对含量。 肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、慢性炎症、妊娠等都可以使白蛋白下降。肾病时1、2、球蛋白升高，-球蛋白降低。肝硬化时2、-球蛋白降低，而1、-球蛋白升高。【实验器材及试剂】器材：醋酸纤维薄膜，人血清或牛血清，烧杯，培养皿，镊子，载玻片，盖玻片，电吹风，电泳槽，直流稳压电泳仪，剪刀，手套，滤纸； 试剂：巴比妥-巴比妥钠缓冲液（pH8.6，离子强度0.06mol/L） 染色液（可重复使用，使用后回收） 漂洗液（100ml每组）：95%乙醇45ml，冰乙酸5ml，水50ml 透明液（20ml每组）：无水乙醇14ml+冰乙酸4ml，混匀【操作方法】1. 薄膜浸泡：将醋酸纤维薄膜在缓冲液中浸透（30min），取出后用滤纸吸去多余缓冲液。2. 调整电泳槽水平，加电极液，搭建滤纸桥。3. 点样：用盖玻片蘸取少许血清，然后将其与距离薄膜一端1.52处接触。血清投入后移去载玻片，将薄膜平贴于已放在电泳槽上并已浸透缓冲液的电桥上，点样端为阴极。4. 电泳：先平衡10min，后90V预电泳10min，再调电压110V，电泳50min1h左右，结束。（点样带不要接触滤纸条）5. 染色：电泳完毕，将薄膜浸于染色液中510min。6. 漂洗：取出薄膜，用漂洗液漂至背景无色（约45次）。7. 透明：将薄膜平贴于干净的玻璃器皿壁上，用配制好的透明液滴在薄膜上，薄膜逐渐透明，待其完全透明后，用吹风机将薄膜吹干，然后小心将透明条带揭下。【实验结果】电泳结果：【注意事项】1. 取出薄膜吸取上面多余的缓冲液溶液时，注意不要长时间放置于滤纸上，防止渗于薄膜内的缓冲液被洗出来，而导致电泳时蛋白质不能完全分开，影响最后结果。2. 在往电解槽中加入电极液时要注意电极液高度不能超过红色划线，且电极槽液面要保持一致，同时要漫过电桥，否则无法形成回路，不能进行电泳。3. 连接电泳仪线路时要注意正负极，用前检查电泳仪是否可用，在打开电源之前一定要把电压旋钮调至零，否则一打开电源，瞬间电压过高会烧坏仪器。4. 在把薄膜放到电桥上时，要注意点样区不能接触到电桥上的滤纸，且点样区放在阴极端，还有，薄膜必须要拉直，中间部分不能与电泳槽接触。5. 撕条带必须在完全干燥后，判断是否干燥的方法为用手触摸一下薄膜，要是感觉不粘手，则说明可以揭下，否则不能揭；在干燥时要注意也不能过度，过度则不易揭下。【思考与讨论】本次实验得到的电泳带从效果来看不是太好，主要的问题有以下几个：1. 有些电泳带参差不齐；2. 个别电泳带的两条带之间界限不明显；分析可能导致实验失败或误差的原因有以下几点：1. 将薄膜表面吸干时吸的太干或吸的不完全。因为点样时应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干，太干则样品不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐，影响分离效果。吸水量以不干不湿为宜；2. 用镊子取薄膜并吸干、点样的过程中，薄膜可能受到了异物污染；3. 缓冲液选择浓度不合适。因为缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并由于扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中不易分辨；4. 电流强度控制的不好，因为电流强度高，尤其在温度较高的环境中，可引起蛋白质变性或由于热效应引起缓冲液中水分蒸发，使缓冲液浓度增加，造成膜片干涸。电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散；醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白的试验中，如果区带的分离效果不好，可能存在的影响因素？1. 电泳时间不足2. 薄膜在染色或漂洗时重叠紧密且时间很长3. 薄膜在缓冲液中浸泡的时间不足4. 点样时薄膜上是否存在多余的水分实验过程中哪些