链球菌检验作业指导书.doc

链球菌检验作业指导书1 主题内容与适用范围本作业指导书规定了链球菌的检验方法。本作业指导书适用于患者的生物样品（如：尿液、脓液、脑脊液、痰等）及医院物体表面涂抹样本及使用中消毒剂链球菌的检验。2 引用标准GB/T 4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂全国临床检验操作规程（第三版）临床微生物学诊断与图解（第二版）周庭银编著3设备和材料3.1无菌棉拭子。3.2无菌5cm5cm规格板。3.3温箱：361，42。3.4显微镜。3.5灭菌广口瓶：500mL。3.6灭菌三角烧瓶：500mL，250mL。3.7灭菌吸管：10mL、1mL。3.8天菌平皿：90mm15mm。3.9灭菌小试管：内径3mm，长5cm。3.10灭菌毛细管。3.11无菌注射器：5mL、10mL3.12橡皮乳头。3.13载玻片。3.14酒精灯。3.15灭菌金属匙或玻璃棒。3.16接种棒、镍铬丝。3.17 试管架、试管篓。4培养基和试剂4.1 1%葡萄糖肉汤：按GB/T 4789.28中4.1规定。4.2血琼脂平板：按GB 4789.28中4.6规定。4.3SCDLP液体培养基：按卫生部消毒技术规范附录A.23中规定。4.4 麦康凯琼脂：按GB 4789.24中4.4规定。4,5 6.5%氯化钠肉汤：见附录A1。4.6 马尿酸钠培养基：按GB/T 4789.28中3.9规定。4.7过氧化氢酶试验：按GB 4789.28中3.21规定。4.8蛋白胨水、靛基质试剂：按GB 4789.28中3.13规定。4.9氨基酸脱羧酶试验培养基：按GB 4789.28中3.12规定。4.10糖发酵管：按GB 4789.28中3.2规定。4.11溶血性检查：见附录A1。4.12杆菌肽敏感试验：见附录A4。4.13 CAMP 试验：见附录A5。4.14 胆汁-七叶苷试验：见附录A64.15 6.5%NaCl生长试验：见附录A7。4.16 Optochin 敏感试验：见附录A34.17 吡咯烷酮芳氨酶( PYRase) 试验：见附录A9。5检验程序：见图1图1：链球菌检验程序尿液、脓液、痰等涂抹拭子、使用中的消毒剂用相应中和剂肉汤中和后取5mL食物中毒标本血平板平板1%葡萄糖肉汤增菌涂片镜检 361 1824h 361 1824h 挑选具有、或溶血环的可疑菌落转种血琼脂平板分纯培养。具有溶血环的菌落进行涂片染色镜检361 1824h触媒阴性、革兰氏阳性链状或单个排列球菌具有溶血环的菌落进行涂片染色镜检具有溶血环的菌落进行涂片染色镜检链球菌一般对人不致病、必要时进行生化和血清学鉴定触媒阴性，革兰氏阳性链状球菌革兰氏阳性链状或单个排列球菌非革兰氏阳性链状排列球菌触酶试验阳性胆汁溶解试验、6.5%NaCl肉汤生长试验触媒试验阴性排除链球菌胆汁溶解（）、6.5%NaCl肉汤生长（）胆汁溶解（）、6.5%NaCl肉汤生长（）胆汁溶解（）、6.5%NaCl肉汤生长（）杆菌肽敏感试验、CAMP试验进行生化和血清学鉴定见表3、表4肠球菌属肺炎链球菌杆菌肽敏感、CAMP均（）杆菌肽敏感（）、CAMP（）杆菌肽敏感（）、CAMP（）进行生化和血清学鉴定A族溶血性链球菌B族溶血性链球菌6 操作步骤6.1 临床患者标本（如：尿液、脓液、痰等）可直接接种血平板置3611824h进行分离培养，同时做涂片检查；对血液及脑脊液标本可以先用1%葡萄糖肉汤于3611824h进行增菌培养，必要时置5%CO2环境中培养，然后用血琼脂平板进行分离培养。如无菌生长应连续培养7天，无论是否有菌生长均应再次转种血琼脂平板进行分离培养。6.2 涂片染色：链球菌为革兰阳性球菌，常链状排列，在琼脂平板培养基上涂片染色常呈短链或单个存在有时成对。6.3 医院物体表面涂抹拭子及使用中消毒剂用含有相应中和剂的肉汤中和后取5mL接种50mL1%葡萄糖肉汤于3611824h进行增菌培养，然后用血平板进行分离培养。菌落形态如图16.4 菌落特征：在血琼脂平板上361培养1824h，菌落呈灰白色、半透明或不透明，比葡萄球菌菌落小，凸起或扁平（肺炎链球菌），用接种环刮取菌落时，常遇颗粒状不易乳化，不能均匀涂抹。菌落周围有三种溶血情况。（1）-溶血（草绿色）链球菌：菌落周围有灰绿色的狭窄-溶血圈，红细胞不完全溶解，由于链球菌产生作用于血红蛋白毒素，在菌落周围出现绿色环。（2）-溶血（溶血性）链球菌：菌落周围有明显宽广的完全透明环，环内红细胞全部溶解。在厌氧培养更能准确地判定。（3）-溶血（非溶血性）链球菌：菌落周围无任何改变。6.5 分离培养：链球菌的属内鉴别，首先观察在血液琼脂平板上的溶血环，是溶血、溶血还是溶血，根据不同溶血类型进行鉴别。6.5.1 -溶血链球菌的鉴定：-溶血链球菌的鉴定，可检测特异性多糖抗原（链球菌群多糖抗原）来分群，采用商业性试剂盒，当前血清学诊断方法尚未普及之前，传统的对-溶血链球菌的鉴定鉴别仍是需要的。A、B、C、G群细菌，一般可用杆菌肽、CAMP、PYR、VP、及-D-葡萄糖苷酶（BGUR）等试验区别（表1）。表1 来自人类-溶血链球菌的特性鉴别菌种Lancefield群抗原菌落aPYRVPbCAMPBGUR化脓性链球菌咽峡炎链球菌群b无乳链球菌停乳链球菌马样亚种d咽峡炎链球菌群c咽峡炎链球菌群c停乳链球菌马样亚种d咽峡炎链球菌群e咽峡炎链球菌群fAABCCFGG未分群大小大小小大小小NANANANANANA注：a：阳性；阴性；NA，无资料；b,VP试验，无乳链球菌无意义；c曾命名S.mellcri或称米勒链球菌；d:最近资料提示来自人类-溶血性含C、G群抗原菌落形菌株提议命名停乳链球菌马样亚种，在种水平上相关联。目前根据发酵海藻糖和山梨醇活性，区分其他含C群抗原菌种。BGUR-D-葡萄糖苷酶 表2 来自人类和动物含Lancefield C、G群抗原的 -溶血性小菌落形菌株的特征鉴别菌种Lancefield抗原宿主海藻糖山梨醇停乳链球菌马样亚种b停乳链球菌马样亚种b马链球菌马亚种马链球菌兽疫亚种狗链球菌C、G群C、LCCC人类动物动物动物动物注：a，阳性；，阴性；b，分离自人类停乳链球菌马样亚种，显示溶解人纤维蛋白和链激酶活性，而来自动物的停乳链球菌马样亚种则缺乏上述两种特性；可能出现例外；d.狗链球菌对BGUR是阴性，相反大多数-溶血含Lancefield C、G的抗原的大菌落链球菌是阳性。6.5.2 草绿色链球菌的鉴定：革兰氏阳性球菌，触酶阴性，草绿色溶血、胆汁溶菌阴性、Optochin阴性，不存在B、D群抗原，6.5%NaCl肉汤不生长，PYR阴性，10、45不生长、胆汁七叶苷阴性、万古霉素敏感。该类链球菌种类较多，首先推断性鉴定到群，参见表3、表4表3 草绿色链球菌的鉴定菌群试验a甘露醇山梨醇VP精氨酸七叶苷尿酶变异链球菌唾液链球菌缓症链球菌咽峡炎链球菌群bbb注：a：.阳性反应；.阴性反应；.有些菌株阳性而另外菌株阴性；B：偶见例外。表4 缓症链球菌、咽峡炎链球菌、变异链球菌、唾液链球菌和牛链球菌的特性鉴别试验缓症链球菌群咽峡炎链球菌变异链球菌唾液链球菌牛链球菌血液链球菌副血液链球菌戈登链球菌嵴链球菌口腔链球菌缓症链球菌泛口腔链球菌婴儿链球菌咽峡炎链球菌星群链球菌中间链球菌变异链球菌表兄链球菌唾液链球菌前庭链球菌生物1b生物2 b生物3 b星群亚种咽炎亚种酶活性-D-岩藻糖苷酶-D-乙烯半乳糖苷酶唾液酸苷酶-L岩藻糖苷酶-D乙酰葡糖苷酶-D葡萄糖苷酶-D葡萄糖苷酶-阿拉伯糖苷酶-D半乳糖苷酶-D半乳糖苷酶苦杏仁苷（产酸）菊糖甘露醇N-乙酰葡糖胺棉子糖山梨醇熊果甙乳糖蜜二糖塔格糖精氨酸（水解）七叶苷3-羟基丁酮尿素透明质酸酶碱性磷酸酶VVVVNTNTVVVVVNTNTVVVNTNTVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVNTNTNTNTNTNTNTNTVVNTNTNTVNTNTVNTNTVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVNANANANANANAVvdVdV注：.阳性；.阴性；V.不定；NT.未做试验；NA.无资料；b.参考Beighton等生物型。C.阳性菌株的百分比可能不定，取代于应用正确试验。d.试验结果有怀疑为“变异菌株”，变异菌株亦是对葡萄糖苷酶“变异”，不产生细胞外酶。6.5.3 与链球菌属相关菌属的鉴别 乳球菌属：原链球菌属中乳链球菌现成为乳球菌属。乳酸球菌（L.lactis）和乳脂球菌（L.cremoris）在制乳酪和粮食工业生产中使用。临床标本（血液、尿、眼、人工瓣膜心内膜炎）中也常见到。该属菌种与肠球菌相似，唯一不同点是45不生长。 孪生球菌属：原麻疹链球菌（S.morbillorum）现转入孪生球菌属，另一种是溶血孪生球菌（G.haemolysans）。该属菌种曾从临床标本中检到，见于临床感染如心内膜炎。其特点是生长缓慢，可能被误认为营养缺陷链球菌，应用“卫星现象”试验区别开来。菌种鉴定参照表5 表5 孪生球菌属菌种鉴定菌种试 验革兰染色菌细胞排列PYR甘露醇山梨醇溶血孪生球菌麻疹孪生球菌www成双，四联，成族成对。短链注：，阳性；，阴性；w，弱阳性反应。 片球菌属：该属菌种对万古霉素，PYR阴性，发酵葡萄糖不产气，胆汁七叶苷、精氨酸阳性，含有D群抗原，不发酵乳糖，在含盐肉汤中生长缓慢，属内鉴别见表6。乳酸片球菌（P.acidilactici）和戊糖片球菌（P.pentosaceus）曾从临床标本中分离到。 附录AA1 触酶试验(过氧化氢酶试验)原理：触酶2H2O 2 2H2O+ O2 试剂：3% H2 O2 溶液，置棕色瓶内于4C阴暗处保存。方法：先挑取固体培养基上的菌落，置于洁净的玻片上，然后滴加3%过氧化氢12滴。静置，1min内产生大量气泡为阳性，不产生气泡为阴性。附注：1. 过氧化氢为3%，应用30%浓的H2 O2，用时稀释10倍。放置时间较久的30%浓的H2 O2使用时应重新测定浓度，以实际浓度进行稀释。2. 不应在培养基上做试验。挑取菌落时不可刮到培养基。3. 每次试验时，应以阳性和阴性菌株做对照。A2 溶血性检查溶血性是鉴定链球菌最常用的项目，也是鉴定过程中重要的一步。材料:羊血琼脂平板。方法:将标本接种于手血平板t，用接种针在已接种过的血平板上扎2-3处，使细菌被接种到琼脂层深处，35孵育过夜。观察结果:在接种针穿刺过处，羊红细胞完全榕解，形成无色透明区，为-溶血。羊红细胞部分溶解或不溶解呈草绿色的环，为-溶血。不溶解无溶血环为-溶血。注意点:甲型溶血链球菌与A 群链球菌不是同一概念，前者是指细菌生长血琼脂平板上对羊血球溶血性试验，而后者是指根据Lancefield 血清学分群。A3 Optochin 敏感试验材料:Optochin( 乙基氧化羟基奎宁EthylhydrocupreineHCL)纸片(直径6 mm) ，每片5g；血琼脂平板。方法:挑取被检菌落，涂在血平板上，贴Optochin纸片于接种处，35，烛缸孵育18 h。观察结果:抑菌环直径 14 mm 为敏感，推断为肺炎链球雨。抑菌环直径 14 mm 时参照胆汁溶菌，或为其他草绿色链球菌。A4 杆菌肽敏感试验材料:每片含0.04 U 的杆菌肤纸片，血琼脂平板。方法:挑取被检菌落，密涂于血琼脂平板上，接种量应大，以免出现假阳性。贴上杆菌肤纸片，35过夜。观察结果:形成抑菌环为敏感，则推断被检菌为A 群链球菌。A5 CAMP 试验材料:血平板，金黄色葡萄球菌ATCC 25923。方法:在血平板上，用金黄色葡萄球菌划种4条直线，再将被检菌距金黄色葡萄球菌接种线3 mm处呈直角接种一短线。 用同样方法接种阴性和阳性对照菌。35 c孵育过夜。观察结果：在被检菌接种线与金葡菌接种线之间有一个矢形(半月形)加强溶溶区，此即CAMP 试验阳性，否则为阴性。A6 胆汁-七叶苷试验培养基：牛肉膏 3g 七叶苷 1g 蛋白胨 5g 枸橼酸铁 0.5g 胆盐 10g 蒸馏水 1000mL将各成分溶于蒸馏水中调pH至7.27.4。分装试管，每管3mL于10820min灭菌备用。方法：接种被检菌13个菌落，置36培养2448h。观察结果：生长并使培养基变黑色或棕褐色为阳性，不变色为阴性。A7 6.5%NaCl生长试验培养基：NaCl 6.5g 蛋白胨 1g 牛肉膏 0.3g 葡萄糖 0.1g 蒸馏水 100mL 调pH至7.4 分装小试管，每管23mL高压蒸汽12115min灭菌后备用。方法：接种被检菌，36培养过夜，培养基混浊有菌生长为阳性，接种菌应注意不可接种量过多使培养基未经培养液即显混浊，出现假阳性。A8 色素试验色素试验在鉴定B群链球菌的方法中，特异性最好，是Noble改良的 Islam法。培养基： 水溶性淀粉 5g 胨（3号月示胨） 23gNaH2PO4 1.48g Na2HPO4 5.75g琼脂 10g 水 1000mL调整pH7.4，高压蒸汽121 15min灭菌后冷至55，加入50mL灭菌