高效液相色谱测定米糠中水溶性维生素.doc

高效液相色谱法测定米糠中的水溶性维生素（江南大学化工与材料工程学院，江苏无锡214122）摘要：高效液相色谱法同时测定米糠中四种水溶性维生素VB1，VB6，烟酸，烟酰胺的含量。在Hypersil C18 （250 cm4.6 mm i.d., 5.0 m）上，以体积比为88:12的0.1磷酸水溶液-甲醇为流动相，以0.6 mL/min流速等度洗脱，在266nm波长下检测。各组分在8min能基线分离。四种维生素在0.610-6g/mL8.510-5g/mL范围内呈线性关系，VB1、VB6、烟酸和烟酰胺的检出下限分别为0.4310-6 g/mL、0.3410-6g/mL、0.3210-6 g/mL、0.3010-6 g/mL。经简单预处理，可以对米糠和淘米水中的这四种维生素的含量进行测定，平均回收率在96.099.9之间。该法简便、快速、准确、灵敏，对复杂体系水溶性维生素的测定具有重要的参考价值。关键词：水溶性维生素；米糠；高效液相色谱Determination of four water-soluble vitamins in rice bran by reverse-phase high performance liquid chromatographyCAO Rui, CAO Yu-hua, LI Nan, GONG Wen-jun, KONG Ling-yao, WANG YunSchool of Chemical and Material Engineering, Southern Yangtze University, Wuxi 214122Abstract: High performance liquid chromatography (HPLC) has been applied for the simultaneous determination of four kinds of water-soluble vitamins including vitamin B1, vitamin B6, nicotinic acid, and nicotinamide in rice bran. The separation was performed on a Hypersil C18 column (250 cm4.6mm i.d., 5.0 m) with a mobile phase of 0.1% H3PO4- methanol (88:12, V/V) at flow rate of 0.6 mL /min, and detection wavelength was 266 nm. Four vitamins had good linearity in the range of 6.010-7g/mL - 8.510-5g/mL, with detection limit of 4.310-7 g/mL, 3.410-6g/mL, 3.210-7g/mL and 3.010-7 mg/L for vitamin B1, vitamin B6, nicotinic acid and nicotinamide, respectively. Baseline separation of four vitamins can be achieved within 8 minutes. Without complicated pretreatment, four analytes in rice bran samples, as well as extracts from rice with water, were successfully determined with recoveries between 96.0% and 99.9%. The approach could be applied to determine water-soluble vitamins in complicated samples owing to simplicity, convenience, sensitivity and accuracy. Key words: water-soluble vitamins; rice bran; high performance liquid chromatography米糠是一类具有广泛开发潜力的高附加值资源，含有稻米的64营养物质及90人体所需要的各种营养元素1，包括维生素、氨基酸、脂肪酸、矿物质，还有米糠多糖、二十八碳烷醇、神经酰胺等生理功能卓越的活性物质2。其中水溶性维生素是一类重要的营养成分，在各种保健品3，功能型饮料中得到应用。烟酸和烟酰胺能够促进头皮血液循环，防止脱发；VB6具有美发功效；VB1具有滋养与深层清洁的作用，因此化妆品中也常添加微量的维生素4。淘米水中也含有维生素，用淘米水洁肤洗发，刺激性小，有润肤护发功效。因此，测定米糠和淘米水中的维生素含量很有必要。测定维生素的方法有紫外分光光度法5、荧光法6和高效液相色谱法（HPLC）7。但HPLC技术用于米糠中水溶性维生素的测定还未见报道。本文采用HPLC建立了米糠及淘米水中的水溶性维生素的测定方法，对样品前处理方法进行了研究，对测定体系各影响因素进行了优化。方法简便快速，准确可靠，对复杂体系中水溶性维生素的测定具有重要的参考价值。1 实验部分1.1 仪器、试剂与样品仪器： Waters505高效液相色谱仪（包括2487紫外检测器）， Empower色谱工作站。色谱柱：Hypersil C18（250 cm4.6mm i.d., 5.0m）。超声波振荡器（BRANSON SB 3200T，上海）；固相萃取柱（固相PT-系列，河北省津杨滤材厂）等。试剂： VB6（纯度 99）、烟酰胺（纯度 99）、烟酸（纯度99.5）、VB1（纯度98）。均购自国药集团化学试剂有限公司（上海）；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。米糠样品来源于无锡秦良商贸有限公司。糯米样品产地：云南西双版纳自治州。1.2 色谱条件色谱柱：Hypersil C18 柱（250 cm4.6mm i.d., 5.0m）, 流动相：A: 0.1 %磷酸水溶液, B:甲醇，以体积比 A:B=88:12等度洗脱；流速为0.6 mL/min。检测波长：266nm；进样量 20 L。1.3试液的制备1.3.1标准溶液的制备精确称取约0.05g的四种维生素标准品，用0.01mol/L盐酸溶解并稀释到50 mL，摇匀，分别得到1.3610-3 g/mL，1.1810-3 g/mL，1.0410-3g/mL和1.00 10-3.g/mL的 VB1，VB6，烟酸和烟酰胺的标准储备液，于4冰箱中保存。储备液用流动相稀释得所需浓度的标准溶液。1.3.2 米糠供试品溶液的制备取10.00g米糠于100mL锥形瓶中，加入20mL混合溶剂（体积比为80:20的甲醇0.01mol/L盐酸溶液）超声提取30min，过滤，滤渣用相同的条件重复提取两次，合并提取液。用旋转蒸发仪蒸发浓缩，浓缩液用无水乙醚萃取两次脱脂，水相经0.45m滤膜过滤，再过固相萃取柱，定容至10mL容量瓶中，即得米糠供试品溶液。1.3.3 淘米水供试品溶液的制备取100g云南产糯米加100mL自来水搅拌20min，沥出洗米水，然后定容至100mL。过滤，将滤液在12000r/min下离心15min，取上清液，经0.45m滤膜过滤，再过固相萃取柱，即得淘米水供试品溶液。2. 结果与讨论2.1样品预处理8方法优化米糠的主要成分有蛋白质、脂肪酸、胆甾醇、多糖等。虽然VB1、VB6、烟酸和烟酰胺都是水溶性物质，但采用水为提取剂，蛋白质、碳水化合物也会随之被提取出来，干扰测定并污染色谱柱。尝试了纯甲醇以及90甲醇和10的0.01mol/L盐酸水溶液提取维生素，发现不能将水溶性维生素提取完全；70的甲醇和30的0.01mol/L盐酸水溶液虽能将水溶性维生素提取完全，但米糠中的蛋白质也会随之被提取出来；用80甲醇和200.01mol/L盐酸水溶液提取，蛋白质会变性产生沉淀，碳水化合物也不溶，而VB1、VB6、烟酸和烟酰胺又有较好的溶解度，因此实验采用80甲醇的酸性水溶液提取三次，浓缩，脱脂，再过固相萃取柱去除残余的干扰物质。糯米淘米水中也含有大量的蛋白质，脂肪酸，多糖等，尝试了用等体积的10的三氯乙酸去蛋白，由于酸性太强，体系不稳定；用sevag法去蛋白，需要多次重复，才能较彻底的去除蛋白，比较耗时；而用高转速离心机将蛋白离心下来，分离效果良好。再过固相萃取柱以去除残余的干扰物质，可以避免污染色谱柱。2.2色谱条件的优化文献中测定B族维生素大多采用在流动相中加KH2PO4调节酸度或加磺酸盐 7，9 -11 等离子对试剂抑制分析物的极性，但加盐后会对高效液相色谱仪的泵头产生一定的损伤；还有一些报道采用的是耐水色谱柱7，11，采用全水体系做流动相，但耐水色谱柱价格昂贵。本实验采用普通的C18色谱柱，在流动相中加入稀酸调节酸度，对B族维生素进行测定。实验中首先尝试流动相为0.6醋酸水溶液甲醇（体积比为88:12）等度洗脱，对四种水溶性维生素进行分离，发现烟酸和VB6在此条件下不能分开。也尝试了0.05三氟乙酸甲醇体系，四种维生素同样无法得到分离。将流动相中的水相改换为磷酸水溶液，调整磷酸浓度来实现四种水溶性维生素的分离。实验中尝试了0.08，0.10，0.12的磷酸水溶液进行实验。采用0.08磷酸水溶液时，四种维生素混合标准溶液得到了较好的分离。但是米糠实际样品测定时，发现VB1、VB6与相邻未知物质的峰未达到完全分离。改用0.1磷酸水溶液，米糠样品中的待测维生素分离的较好；换用0.12磷酸水溶液时，效果与0.1磷酸水溶液相当。但酸性加大会对柱子有一定的伤害，综合各种因素，选用0.1磷酸水溶液甲醇体系，以体积比为88:12等度洗脱。考察了0.1磷酸水溶液与甲醇不同配比时对四种维生素分离的影响，发现流动相中水相比例降到85时四种维生素无法达到分离，水相比例为88时，四种维生素在8min内达到基线分离。在上述优化色谱条件下得到4种维生素的标样图，见图1t/min图1 水溶性维生素混合标准溶液色谱图 峰标：1.VB1； 2.烟酰胺；3.烟酸；4.VB62.3方法学评价2.3.1 重现性试验取4种维生素的标准储备液等体积混和，然后稀释16倍，在上述优化实验条件下连续5次进样，测得其峰面积及保留时间的相对标准偏差（RSD）均小于2，结果表明其重现性较好。如表1所示表1 重现性试验组分RSD（%） (n=5)保留时间峰面积VB10.040.70烟酸0.050.50VB60.122.0烟酰胺0.040.792.3.2标准曲线及检出限配置了一系列不同浓度的 VB1、VB6、烟酸和烟酰胺的混合标准溶液，在优化的实验条件下，进行了测定，得出各组分的线性回归方程、线性范围，并以3倍信噪比得到检测限，结果如表2所示。结果显示线性范围宽，检测限低。表2 回归方程及检测限组分线性范围/（g/mL）回归方程R2检测限/ (g/mL）VB18.510-78.510-5Y=5.84107X+28.420.99994.310-7烟酸9.310-76.510-5Y=4.91107X+7.070.99993.210-7VB61.010-67.410-5Y=1.45107X+65.270.99993.410-7烟酰胺6.010-76.210-5Y=6.06107X5.910.99993.010-72.4 样品的测定及回收率实验按1.3.2和1.3.3方法处理好样品，在优化好的色谱条件下，进行测定。米糠样品的色谱图见图2；米糠及淘米水中维生素测定结果见表3。t/min图2 米糠样品的色谱图表3 米糠及糯米淘米水中维生素的测定结果 (n=3)样品组分含量 RSD（）米糠VB17.710-6 g/g1.6烟酸14.910-6 g/g2.1VB61.310-6 g/g1.2烟酰胺16.210-6 g/g0.7淘米水VB10.910-6 g/mL2.0烟酸5.910-6 g/mL0.9VB6 未检出烟酰胺1.610-6 g/mL2.1取米糠供试液做加标回收试验。结果见表4。回收率在96.099.9，结果可靠。表4 4种水溶性维生素的回收率测定结果 （n=3）维生素试液浓度(g/mL)加标准试液(g/mL)测定含量(g/ml)平均回收率/(%)RSD/(%)VB17.610-6 8.510-615.7610-696.00. 5VB514.810-6 6.510-6 21.0710-696.41.6VB61.310-67.410-6 8.6910-699.94.9烟酰胺 16.410-6 6.310-6 22.810-698.03.03. 结语： 采用80甲醇的0.01 mol/L 盐酸溶液超声提取，石油醚脱脂，并经固相萃取柱除去杂质，对米糠和淘米水试样进行了提取和纯化。采用普通的C18液相色谱柱，在流动相中加入稀酸调节酸度，可以简单、快速地测定米糠中的四种水溶性维生素VB1，VB6，烟酸，烟酰胺。本法简便准确、可靠、重现性好，对复杂体系中的水溶性维生素的测定具有一定的参考意义。同时本文的测定结果也为开发天然绿色米糠化妆品提供了一定的依据。参考文献1毛金水,贺绪军,