Nbn基因对出生后小鼠海马发育的影响.docx

Nbn基因对出生后小鼠海马发育的影响来源：创新医学网作者：王堃,张蕊,郭敏作者单位：辽宁医学院：1. 附属一院;2. 基础学院，辽宁锦州 121001【摘要】目的 通过观察神经特异性Nbn基因敲除(NbnCNSDel)和对照(NbnCNSCtr)小鼠海马发育的形态学变化，探讨DNA损伤修复基因Nbn在生后小鼠海马发育过程中的作用。方法 应用光镜连续切片和体视学方法对生后(postnatal day, P)7、14、21d的实验组和对照组小鼠海马进行系统地形态学观察和定量分析。结果 NbnCNSDel小鼠海马发育比NbnCNSCtr明显滞后，至P21d椎体层和齿状回(DG)颗粒层的截面面积均减小(P0.05)，DG颗粒层和多形层及CA4区的体密度差异均有统计学意义(P0.05)。结论 DNA损伤修复基因Nbn是小鼠海马发育的一个重要基因，影响小鼠海马椎体层成熟和DG颗粒细胞的发育与成熟。【关键词】 Nbn;小鼠;海马发育;体视学Effect of Nbn gene on hippocampus development in postnatal miceWANG Kun, ZHANG Rui, GUO Min(Liaoning Medical University, 1. First Affiliated Hospital; 2. Basic College, Jinzhou 121001, China)ABSTRACT: Objective To investigate the role of neurospecific DNA repair gene Nbn in mouse hippocampus development by observing the morphological differences in NbnCNSDel and NbnCNSCtr mice. Methods Serial sections and stereology were used to quantitatively analyze the development of mouse hippocampus on postnatal day 7, 14 and 21. Results Compared with that of the control group, the hippocampus development of NbnCNSDel mice lagged behind. In NbnCNSDel mice, on day 21, the profile area of pyramidal layer of hippocampus and granular layer of dentate gyrus decreased (P0.05), and the volume densities in granular layer and polymorphic layer of dentate gyrus, and CA4 had significant differences (P0.05). Conclusion DNA repair gene Nbn, an important gene in mouse hippocampus development, affects the development and maturation of hippocampus and granular layer of DG in mice.KEY WORDS: Nbn; mouse; hippocampus development; stereologyNbn(在人类称之为NBS)是一种重要的DNA修复基因，其表达的蛋白Nibrin参与DNA损伤修复1，如小头畸形、智力发育延迟、组织退化、对DNA损伤剂敏感、染色体不稳定、易患肿瘤等23，都与DNA损伤修复密切相关。本研究应用光镜连续切片结合体视学方法对Nbn基因敲除(NbnCNSDel)和对照(NbnCNSCtr)小鼠海马发育进行系统观察和定量分析，了解其不同发育阶段的形态学变化，为进一步认识DNA损伤修复基因Nbn对小鼠海马发育的影响及其研究提供基本的实验依据。1 材料与方法1.1 动物选择和标本制备选用P7、14、21d的(129/SVC57/BL/6)Nbn基因条件敲除的突变系45小鼠，每组6只，对照组取相应的同窝仔鼠，雌雄各半，共36只，体重1820g，以上动物提供及测交试验均由中国医学科学院实验动物中心支持完成。仔鼠经100mL/L水合氯醛麻醉后取出脑组织，沿矢状缝纵向切开，入40g/L中性多聚甲醛固定过夜，常规光镜标本制备，石蜡定向包埋，取连续矢状切片厚3m，HE染色，光镜观察。1.2 体视学指标的测定每个动物的脑组织等间隔选取切片，采用方格测试系统，点计数法，按公式AC=PXa2测算出海马椎体层和DG颗粒层的截面积，Px 为方格系统落在同一海马组织块所有切片上的点数和，a为方格系统中每一小格的边长，在1010倍光镜下相当于实际长度0.01mm;按公式VV=PX/PC分别测算出海马椎体层、CA4区和DG区颗粒层、多形层的体密度，PX为方格系统落在所测结构的点数，PC为方格系统落在参照系的点数(均以各自的海马为参照系)6。1.3 统计学处理采用统计软件SPSS16.0对所测各项数据进行析因设计的方差分析和独立样本t检验，P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 光镜观察海马结构(简称海马)由海马(即CA区，由CA1、CA23和CA4组成)和DG构成。由外向内有分子层、椎体层和多形层三层结构，在大脑半球矢状切面上，呈双重“C”形环抱外形，大“C”即为海马，开口朝向腹内侧，小C代表齿状回，位于海马沟背内侧，开口向背外侧。主要由主细胞层和非主细胞层组成，主细胞层由位于海马的锥体层和DG的颗粒层组成,锥体层由锥体细胞组成,颗粒层由颗粒细胞组成,非主细胞层主要由神经纤维组成78。小鼠海马NbnCNSCtr组，P 721d，均可见大“C”形外形，结构已发育完全，各分区各层截面面积均随时间推移逐渐增大，海马椎体层细胞因分区不同而发育不同步，表现为CA23区细胞比CA1区分化早，分化程度好，分化速度快。此外，在同一区也有一定的规律：位置较深的细胞(近多形层)比较浅的(近分子层)分化早，且分化程度好，分化速度快;Nbn1CNSDel组与NbnCNSCtr组相比，P721d，大“C”外形和海马各区分层仍清晰可见，但截面面积明显减小约4倍;同时海马CA区还伴有椎体层细胞层数和数目的减低(图1)。DG区NbnCNSCtr组颗粒层细胞排列密集，小“C”形，P7d颗粒层细胞从外臂向内臂染色逐渐加深，越向内侧胞体越小，胞浆深染;CA4及DG多形层内有较多的细胞分布。P14d颗粒层增厚，外臂细胞胞体变大，胞浆内尼氏体丰富呈颗粒状，内臂仍有数层染色较深的细胞;多形层内细胞数目减少，与CA4之间的分界清晰。P21d颗粒细胞均匀的密集分布于颗粒层，染色均匀，内臂消失;CA4细胞数进一步减少，多形层增宽。Nbn1CNSDel组与NbnCNSCtr组相比较，P7d颗粒层小“C”结构部分形成，颗粒细胞稀疏的分散于颗粒层，无明显的内外臂之分;多形层与CA4之间的分界不清晰。P14d “C”形结构清晰可辨，颗粒层细胞厚度明显较NbnCNSCtr组变薄，伴有细胞层数和数目的明显减低;无明显内外臂之分;多形层内细胞较多，与CA4之间分界不清。P21d颗粒细胞层细胞数目较前增多，较密集的分布，内侧的内臂所在区仍可见少量的胞体较小的深染区;多形层和CA4区仍有较多的细胞分布(图2)。2.2 体视学测量结果NbnCNSDel与NbnCNSCtr小鼠比较，海马发育明显滞后，海马椎体细胞层和DG颗粒细胞层的截面积均有统计学差异(P0.05)。随时间推移发育差异更加显著，P21d时相差达4倍左右(图3);海马CA4和DG的颗粒层和多形层的体密度差异逐渐增大，有统计学意义(P0.05)。3 讨论实验结果显示：NbnCNSCtr组小鼠各时间点均可见海马结构呈双重“C”形环抱的外形，各分区分层清晰;P7P21d，海马截面面积先增加之后稍减低，而体密度值无变化，说明生后海马椎体层细胞主要经历了随海马体积增大而发育成熟的过程;而齿状回颗粒层截面面积持续增加伴有体密度逐渐增加，P7d颗粒层颗粒细胞外臂较薄，内臂较厚，P14d外臂明显增厚，内臂仍有一条染色较深的条带，至P21d内臂消失，颗粒细胞密集分布于整个颗粒层(外臂所在区域)，伴有细胞胞体增大，染色均一;多形层和CA4的体密度则在P7P14d逐渐减少，至P21d基本消失。颗粒层与CA4之间的分界越来越清晰，随着CA4区细胞数目的减少，多形层内细胞数目也随之减少，到P21d时基本消失;说明生后颗粒细胞层P7P14d主要经历了从CA4区经过DG多形层至内臂再至外臂的迁移过程，P14P21d则主要表现为颗粒细胞发育成熟的过程。席刚明等9研究表明：小鼠生后海马椎体层细胞随脑体积的增大和功能逐渐完善而逐渐成熟;而生后海马齿状回内臂逐渐延长，P14d接近成年水平，以后随时间增加，颗粒层细胞数仍呈增加趋势;齿状回基质要经过三次迁移后形成二、三代基质后才转化为颗粒细胞;国内学者蔡文琴等10认为：海马的椎体细胞主要在生前发育迁移完成，海马锥体层生后的变化不再涉及神经元的发生过程,而主要是细胞的进一步成熟、功能的完善和神经元之间联系的建立。而颗粒细胞在胚胎时期仅发生一小部分，大部分发生在出生后。我们的实验结果与其相一致。NbnCNSDel小鼠各时间点仍均可见海马结构呈双重“C”形环抱的外形，但较NbnCNSCtr小鼠海马截面面积明显减小、体密度减低，约为同窝NbnCNSCtr仔鼠的海马截面面积的1/1.44倍不等;P7P14d，NbnCNSDel海马截面面积无增加趋势但伴有体密度的增高。NbnCNSDel较NbnCNSCtr小鼠DG颗粒层的截面面积均减小，以P14d最显著，而体密度随时间的推移逐渐缓慢增加;P7P21d多形层和CA4区的体密度则呈缓慢下降趋势，一直延续至P21d，且多形层和CA4区仍有较多的细胞分布。所以，NbnCNSDel较NbnCNSCtr相比生后小鼠海马结构仍可以形成，但截面面积变小的同时伴有体密度的增加趋势，以颗粒层最显著;CA4和多形层的体密度虽也呈减低趋势，但至P21d仍均未消失。综上所述，正常小鼠生后海马椎体层发育迁移已经完成，而DG颗粒层在P7d已部分形成，P14d细胞移行变化最显著，P21d颗粒细胞基本发育成熟;敲除Nbn基因对生后小鼠海马发育的影响主要表现在椎体细胞的发育成熟、颗粒层形成和颗粒细胞成熟过程的延缓，具体机制有待于进一步深入研究。本实验首次运用体视学方法定量研究了敲除Nbn基因小鼠的生后海马发育过程的形态学变化，为Nbn基因条件敲除小鼠的功能学研究提供一定的形态学依据。【参考文献】1MARASCHIO P, SPADONI E, TANZARELLA C, et al. 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