一种安全制备活化琼脂糖树脂的方法.pdf

经验交流 一种安全制备活化琼脂糖树脂的方法 伍学勤 吴岑 凌晓红 陈建文 赫荣乔 中关村医院内分泌科 北京 中国科学院生物物理研究所 中国科学院视觉信息加工重点实验室 北京 摘要溴化氰是常用载体 树脂 活化剂 但其毒性很强 具有挥发性 活化后树脂带较强的电荷而导致非特 异性吸附 羰基二咪唑 4 年 使用溴化氰作为亲 和层析载体活化剂 2 1 1 A 4 0 B 4 以来 溴化氰便成为应用最广泛的载体活化剂 溴化氰活 化载体与配基 1 B 其活化与偶联效率较 高 操作简便 偶联反应容易控制 在此 我们介 绍5 6 7活化琼脂凝胶 E 4 F G H 4 5 I J 的方法及 其影响偶联效率的关键点 材料与方法 材料 羰 基 二 咪 唑 溴 化 氰 山 梨 醇 K 1 H L L 2 1 J购于M G 2 1 公司 糖基化亲和层析微柱购于E 4 1 B N L公司 K N 无水二氧六环 一级 购于北京化工 厂 其他试剂为国产分析纯 溴化氰活化及配基偶联 根据 4 等 以及 O 1 G 4 N等 建立的方 法进行操作 羰基二咪唑活化及糖基化蛋白亲和配基的偶联 配制二氧六环梯度 0 1 J 用 2 无离子水洗涤 在布氏漏斗中将树脂逐 渐由水相通过二氧六环梯度溶液 J 5 各 2 转移到无水二氧六环中 不可在溶液置换 时 将树脂抽干 否则将影响活化效果 将树脂 悬浮在 2 无水二氧六环中 加入 R B5 6 7 D S震摇 D2 1 洗涤 用 2 无水二氧六环反复抽滤洗 涤三次 按活化的相反顺序 将活化后的树脂分别 用5 J 溶液 各 2 置换到 R 2 I T U 5 V8 R D2 IT 5 F U R 水相中 如果 暂时不偶联 则可将其抽干 S保存 备用 配基偶联 按 2 活化树脂加入 R B间 氨基苯硼酸的比例偶联 S 摇床8 2 1 通讯联系人 K 4 W 2 1 G 4 X H L D 1 F 收稿日期 接受日期 8 生物化学与生物物理进展 抗 凝 2 9 A B 溶解红细胞 在 C 3 4 5 B D E B F 5亲和层析柱中进行分离分析 糖基化血红蛋白的分离 分析以及溶液配制见参考 文献 G 糖基化 B磷酸甘油醛脱氢酶的分离 兔肌H B磷酸甘油醛脱氢酶 I 3 4 8 的分离 纯化以及糖基化I 3 4 8 的亲和层析分离 分析以 及活力测定见参考文献 G 蚯蚓蛋白水解酶的固定化 根据J K等 使用的方法分离纯化蚯蚓蛋白 水解酶 7 L 7 B B 固定化酶的操作过程见参考 文献 F 结果与讨论 8 M为白色粉末状试剂 由于直接接触会刺激 皮肤 可将其制备为 N 储液 O 1 由 于树脂的活化 在无水二氧六环中进行 8 M被水 解破坏较少 由表 可见 用姜黄法 6 测定间氨基 苯硼酸的偶联率 8 M的活化效率明显相对较高 仅仅用 CN 树脂 即可达到 2溴化氰活 化的效果 对照实验表明 如果减少溴化氰的量 将达不到相应的偶联效率 溴化氰活化效率较低的 原因 可能是由于其活化在水溶液中进行 部分溴 化氰被水解所致 表 0 1 2 3 4 5 6 78 2 9 9 2 4 5 0 1 3 A Q R N 8 M S T R U E N 6 CN N 9 V P S RQ S E E W V E P Y K SK E N Y K R D P Z E K 2 R V 2 8 D 3 P Q N E Q T E K R V W 3 K YW E NW Y P Q R Q K Y E C U E Y P T E 2 0 6 6 4 P N Y N T TW 3 4 5 B P K 另外 8 M活化操作过程相对安全 可以在实 验台上进行 如果暂时没有通风厨 而溴化氰的 活化则绝对不能在通风厨外的实验台上进行 而且 即便在通风厨内进行 也要十分小心 并且需要进 行一系列防护措施 以防意外事件的发生 H 与5 B R生产的糖基化血红蛋白离子交换柱 的结果相比较 8 M活化的D E B F 5亲和 层析柱的分析N T效果与其基本相同 但是溴化 氰活化的亲和层析柱 分析的数值误差相对偏高 其原因是由于溴化氰的活化将使树脂所带的电荷增 加 导致分析中的非特异性吸附增加 表 采用3 4 5 B D E B F 5 我们从经硫酸铵 沉淀法纯化的兔肌I 3 4 8 中分离出了糖基化 N I 3 4 8 0 8 M与溴化氰活化制备的亲和层 析结果表明 溴化氰活化的亲和层析柱的非特异性 吸附较对照高出约 6 2左右 另外 7 L 7 B B 的 固定化实验表明 溴化氰活化固定的蛋白酶活力较 8 M低了 2左右 造成这一结果的原因可能是 溴化氰活化引入的强离子基团影响了7 L 7 B B 的 空间结构所致 以上结果表明 8 M活化琼脂糖不 但具有安全操作简单的优点 同时活化与偶联效率 也较高 因此 在制备亲和层析柱或固定化酶时 8 M应该考虑作为活化树脂的选择试剂 G H B 生物化学与生物物理进展 C 1 D E 2 E 2 0 F 3 E 7 3 4 7 3 A B 0 C 3 D 5 B FA B 5 D B F G 7 6 9 3 H 9 F J J K L 9 7 M 7 H 8I 1 2 7 5 C O 5 C O 5 G 7 M 9 7 M 7 H 8 3 I 1 2 7 7 9 9 U T VT 9 3 7 H 8 6 6 3 F O J F O F C 7 1 IL G V 2 4 7 IV 9 6 7 6 G a 3b 7 V 7 83 H 9 G c 3 a 3 b V 7 G V 9 7 R 7 8 9 7 M 7 H G 7cI b V 9 7 M 7 4 2 5 1 2 4 1 A B F F 1 41 G G D C 2 1 D 2 4 1 F C 2 B 1 2 I E D B D 1 1 H 1 F 2 2 A D 1E 2 B 1 D B H 1 D 2 G 1 D A C 2 B C 1 G