蛋白质组学的研究策略与应用

食品分子生物学进展 蛋白质组学的研究策略与应用 分子生物学 分子生物学 molecularbiology 从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学 生物大分子 特别是蛋白质和核酸结构功能的研究 是分子生物学的基础 食品分子生物学 以人和食物的关系为中心 研究生物大分子的结构与功能从而明确营养素与基因的相互作用及对人类健康的影响 实现食品的分子加工以及食品的安全检测等目的 蛋白质的结构与功能的关系研究是分子生物学研究的一个重要内容 蛋白质的特殊性质和生理功能与其分子的特定结构有着密切的关系 这是形形色色的蛋白质所以能表现出丰富多彩的生命活动的分子基础 蛋白质分子结构的组织形式 一级结构 分子中氨基酸的排列顺序 二级结构 肽链主链原子的局部空间排列 三级结构 二级结构在空间的各种盘绕和卷曲 四级结构 有些蛋白质分子是由相同或不同的亚单位组装成 亚单位间的相互关系叫四级结构 发现和鉴定具有新功能的蛋白质 仍是蛋白质研究的内容 例如与基因调控和高级神经活动有关的蛋白质的研究很受重视 蛋白质组学技术 蛋白质组 proteome 一个基因组在一种细胞 组织或生物体表达的所有蛋白质构成的整体 蛋白质组学 proteomics 研究细胞 组织或生物体中蛋白质组组成 定位 变化及其相互作用规律的科学 主要内容 蛋白质组产生的背景及意义蛋白质组的研究内容蛋白质组研究的思路与策略蛋白质组研究的技术体系蛋白质组策略的应用举例 共享99 基因 研究意义 Whyproteomics 30000 40000个基因 30000个基因 蚕和蚕蛾的基因组相同 但表型却完全不同 后退肉前腿肉里脊肉五花肉 蛋白质组的差异所致 研究意义 Whyproteomics 对于人体 1个受精卵发育成1012细胞 103细胞类型 其 蛋白质组 随 时 空 处于变化之中 而 基因组 则相对处于不变之中 因此 我们可以得出 生命体的统一性源于基因组 生命体的复杂性源于蛋白质组 研究内容与解决问题 研究思路与策略 1 研究基础 1 越来越多生物基因组测序的完成 蛋白质组数据库 2 生物质谱和分离科学的进步 分离和鉴定的技术平台和手段 3 生物信息学的发展 海量数据的解析 研究的思路与策略 研究的思路与策略 4 技术体系 工具 4 1样品制备技术 蛋白质组研究分析流程 样本制备原则 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态 包括多数疏水性蛋白 且制备方法应具有可重现性 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰 如酶性或化学性降解等 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白 从而保证待研究蛋白的可检测性 样品裂解的方法 超声破碎 细胞混悬液高速珠磨 细胞混悬液研磨 细菌 植物细胞匀浆 动植物组织 细菌 酵母 植物细胞冻融裂解 培养细胞低渗裂解 红细胞 细菌去垢剂裂解 组织培养细胞 样品抽提液的主要成份 变性剂 打开氢键 增溶 去垢剂 消除疏水基团之间的相互作用 增强蛋白质在其pI值处的溶解性 两性电解质 在样品中往往能替代盐离子 盐离子才能维持其中蛋白质的溶解 还原剂 打开二硫键 蛋白酶抑制剂 防止蛋白质降解等 盐离子去污剂 SDS 核酸 脂类及多聚糖酚类复合物需要进行样品的纯化处理 去除影响样品制备的干扰物质 盐 NaCl 增加导电性 使得等电聚焦所需时间延长 出现电内渗现象 EEO 导致胶内不均匀的水分布 失水区和水过饱和区 可容忍的盐浓度 10mM胶内水化上样40mM杯上样去除方法 胶过滤 TCA 丙酮沉淀 超滤 100ugE colilysate IEF pH5 8 250V 升压 20min 8000V线性升压 2 5hrs 8000V 25 000Vhrs SDSPAGE4 20 线性梯度 200V 1hr Bio SafeCoomassie染色 50mMTris 100mMTris 合适的离子强度 核酸 通过静电作用与蛋白结合 妨碍聚焦过程 可阻碍丙烯酰胺基质孔道 去除方法 用核酸酶处理 在两性电解质存在的情况下进行超速离心多聚糖 会阻碍丙烯酰胺基质孔道 去除方法 TCA沉淀法 脂类 通过疏水作用与蛋白结合 影响等电点及分子量 蛋白 脂类复合物在水溶性溶液中不溶解 处理 去除方法 在高浓度的去污剂存在下脂类会被聚集而除去 而蛋白会溶于溶液中富含脂类样品 脑 采用有机溶剂进行化学去除 离子去污剂 SDS 与蛋白形成带强负电荷的复合物 干扰聚焦过程 处理方法 将含SDS的样品用高浓度的非离子或两性去污剂进行稀释 比例为8 1 SDS终浓度为0 25 酚类复合物 植物 还原状态 通过氢键与蛋白结合 氧化状态 醌 发生共价结合 处理方法 添加polyvinylpolypyrrolidone PVPP 形成多酚物 添加还原剂 DTT 抗坏血酸 亚硫酸盐 不溶物质 阻塞凝胶孔道导致聚焦不好 出现严重的拖尾 去除方法 高速离心 e g 40000g 30min 20 C 去除影响样品制备的干扰物质 样品制备中的纯化处理效果 E colicelllysatesspikedwith1 SDS 采用TCA 丙酮沉淀法处理 未处理 血浆蛋白质组的动态范围 整体蛋白质组预分离分析技术路线 4 2分离技术 特定或目标蛋白质组分离分析技术 4 2分离技术 整体蛋白质或肽段混合物分离方法选择 依据形状和大小 如超滤 体积排阻 PAGE等 依据溶解性或密度性质 如丙酮沉淀 蔗糖梯度密度离心技术 依据等电点不同 如离子交换 等电聚焦 依据疏水性不同 如反相色谱 疏水色谱 依据亲和性不同 如亲和色谱 依据与金属离子螯合性质不同 如IMAC法提取磷酸化肽段 依据特殊化学反应基团 如巯基填料选择性富集含巯基的肽段 常用的两种高效分离技术 2DE MALDI TOF TOFMS 非胶多维分离 质谱分析 液相色谱和毛细管电泳等 4 3鉴定技术 生物质谱 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 电喷雾电离质谱 串联质谱 生物质谱的应用 蛋白质鉴定分子量测定 蛋白酶切 一级质谱蛋白质的氨基酸序列测定蛋白酶切 二级 串联 质谱翻译后修饰糖基化 磷酸化 生物大分子非共价相互作用微生物分析蛋白质组 质谱仪与质谱分析 质谱仪 按离子质量数m与电荷数z的比值 称质荷比m z 大小顺序排列 应用电磁学原理 分离和测定离子化了的分子或原子质量 它是一种物理方法 即物质粒子的质量谱 质谱分析 测定样品离子的质荷比 m z 进行成分和结构分析的分析方法 M nH n 质荷比 m z M n nm z为质荷比 n为质子化数 即电荷数 M为分子质量 离子源的作用 将样品中的原子 分子电离成为离子 并使这些离子在离子源系统中形成具有一定几何形状和一定能量的离子束 然后进入质量分析器被分离 生物质谱的分类 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱MALDI TOF MS 离子源 基质辅助激光解吸电离 MALDI 基本原理 将分析物分散在基质 Matrix 分子中并形成共结晶 当用激光 337nm的氮激光 照射晶体时 基质分子吸收激光能量与样品解吸附 基质 样品之间发生电荷转移使样品分子电离 常用基质 激发波长337nm 355nm 基质的作用 吸收了激光的大部分能量并气化 同时将样品分子带入气相 样品分子只吸收少量激光能量 避免了分子化学键的断裂 基质在样品离子形成过程中充当了质子化或去质子化试剂 使样品分子带上正电荷或负电荷 电喷雾电离质谱 ESI MS 基本原理 利用高电场使质谱进样端的毛细管柱流出的液滴带电 在N2气流的作用下 液滴溶剂蒸发 表面积缩小 表面电荷密度不断增加 直至液滴爆裂为带电的子液滴 这一过程不断重复使最终的液滴非常细小呈喷雾状 这时液滴表面的电场非常强大 使分析物离子化并以带单电荷或多电荷的离子的形式进入质量分析器 ESI源示意图 串联质谱 质量分析器的作用 使离子按照质荷比的大小进行分离 并得到按质荷比大小顺序排列成的谱图 质谱图 有机质谱和生物质谱常用的质量分析器有 a磁场 或电场 质量分析器 b四极杆质量分析器 c飞行时间质量分析器 d离子阱质量分析器 e离子回旋共振质量分析器 f轨道离子阱 ORBITRAP 4 4数据处理 结构预测 蛋白质结构预测主要有两大类方法 1 理论分析方法或从头算方法 Abinitio 2 统计方法 该类方法对已知结构的蛋白质进行统计分析 建立序列到结构的映射模型 进而对未知结构的蛋白质根据映射模型直接从氨基酸序列预测结构 经验性方法结构规律提取方法同源模型化方法25 30 同源序列 相似的空间结构 蛋白质数据库的构成图