组织DNA提取原理和步骤详细

组织DNA提取 TissueDNAExtraction 实验目的 学习从生物组织中提取DNA 为研究DNA的理化性质与结构功能打好基础 提取DNA总的原则 1保证核酸一级结构的完整性 2其他生物大分子如蛋白质 多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度 3核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子 4其他核酸分子 如RNA 也应尽量去除 粉碎组织DNP裂解液裂解细胞膜 核膜DNP苯酚 氯仿DNA RNA RNA酶Protase 苯酚 乙醇纯DNA紫外定量 原理 各种组织细胞破碎方法 破裂细胞 释放核酸 DNA酚抽提法示意图 DNA鉴定 DNAidentification 浓度鉴定 concentration 纯度鉴定 purity 完整性鉴定 integrity 浓度鉴定 concentrationidentification 1 紫外分光光度法 ultravioletspectrophotometery 测定DNA在A260nm的光吸收值 A260 稀释倍数 50 g ml紫外分光光度法只用于测定浓度大于0 25ug ml的核酸溶液 A值等于1时 相当于50 g ml双链DNA 40 g ml单链DNA或RNA 20 g ml单链寡核苷酸 各种碱基的紫外吸收光谱 2 荧光光度法荧光染料溴化乙锭 ethidiumbromide EB 可嵌入到碱基平面 而发出荧光 且荧光强度与核酸含量呈正比 适用于低浓度核酸溶液的定量分析 1 5ng EB与DNA的结合 500 l全血提取的基因组DNA电泳 动物组织提取基因组DNA 纯度鉴定 purityidentification 紫外分光光度法 在260nm和280nm处测定DNA溶液的光吸收 纯的DNA A260与A280之比应在1 80 低于此值表明制备物中留有蛋白质成份 高于此值表明有RNA的残留量 纯的RNAA260与A280之比应在2 0 A260 A280比值是纯度检测的重要指标 完整性鉴定 integrityidentification 凝胶电泳法 基因组DNA电泳 在电场中泳动慢 如果发生降解 可出现电泳图谱脱尾现象 总RNA电泳 观测各条带的含量 提示是否存在RNA降解 如加样槽中存在条带 可能是DNA污染 核酸的贮存 DNA保存 storage 1 短期贮存 4 或 20 存放于TE tris和EDTA 缓冲液中 TE缓冲液的pH与DNA贮存有关 pH为8时 可减少DNA脱氨反应 pH低于7 0时DNA容易变性 2 长期贮存 TE缓冲液中 70 保存数年 在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染 每克组织 ml裂解液组织匀浆器 匀浆取2 0ml匀浆 加等体积苯酚 氯仿 摇匀5min 2 500rpm10min取水相加等体积氯仿 异戊醇 摇匀5min 2 500rpm10min 方法 取水相加5MNaCl至终浓度0 3MNaCl 加2 5倍体积冰无水乙醇 摇匀见白色沉淀 玻棒挑起DNA70 乙醇洗涤一次沉淀溶于1mlTE适当稀释紫外分光光度计测A260nm A280nm 吸取DNA原液 l 用ddH2O稀释至 l 在紫外分光光度计上测定A260nm及A280nm 计算A260nm A280nm比值及DNA浓度 一般以A260nm 280nm 1 8为标准 A260nm A280nm若 1 6 提示有蛋白质或酚污染 应进一步纯化 定量 DNA浓度 g ml A260nm 50 稀释倍数 1 光径 1OD值相当于50 g mldsDNA 40 g mlssDNA或RNA 2O g ml寡核苷酸 浓度计算 1 裂解液 Homogenizationbuffer 10mmol LpH8 0Tris HCl1mmol LEDTA0 1mol LNaCl1 SDSEDTA 抑制DNA酶活性 试剂及其作用 SDS是离子型表面活性剂 主要功能 溶解细胞膜蛋白而破坏细胞膜 解聚细胞中的核蛋白 与蛋白形成复合物 2 苯酚 氯仿 Phenol Chloroform 苯酚 强蛋白变性剂氯仿 蛋白变性剂 与水不互溶 与苯酚互溶 可以带走残余的酚 为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离 苯酚在空气中经常被氧化生成醌 它能够产生自由基 直接用于DNA分离 会使磷酸二酯键断裂 造成DNA降解 氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物 并用Tris Hcl饱和酚 并调节至中性 3 氯仿 异戊醇 Isoamyl alcohol 能降低分子表面张力 所以能减少抽提过程中泡沫的产生 同时异戊醇有助于分相 使离心后的上层水相 中层变性蛋白质及下层有机溶剂相维持稳定 4 冰无水乙醇 Absoluteethonal 和70 乙醇 70 Ethonal 无水乙醇会夺去DNA周围的水分子 使DNA失去水而易于聚合 可除去残余的氯仿 70 乙醇洗涤可去除残余的盐离子 盐离子的存在会使之不易溶解 并可抑制酶反应 5 TE缓冲液 TEBuffer 10mmol LpH8 0Tris HCl1mmol LEDTA 缓冲对Tris HCl不存在金属离子的干扰作用 EDTA能稳定DNA的活性 6 20 SDS 十二烷基磺酸钠 抑制Dnase活性 7 10mg ml蛋白酶K ProtaseK 分解蛋白质 破坏细胞膜8 10mg mlRNA酶 RNase 分解RNA 9 5mol LNaCl 减少DNA分子间的同性电荷相斥力 使DNA易于相反聚合而形成DNA钠盐沉淀 DNA提取试验中常遇到的问题 基因组DNA收率较低或无基因组DNA样本材料太少细胞破裂不够充分 DNA释放不完全离心力偏小两相分离不完全 DNA降解的原因样本不够新鲜 采集材料过陈旧样本本身存在大量DNA酶提取DNA的生物活性差的原因 提取的基因组DNA盐浓度过高基因组DNA中乙醇未清除净基因组DNA中可能存在其他抑制因素提取基因组DNA 有时加入蔗糖的原因加入多糖 保护DNA长度 注意事项 1 处死动物取出所用脏器后应尽快放入液氮中 以免DNase引起DNA降解 在纯化过程中要加核酸酶抑制剂 eg EDTA 以防DNA自身降解 2 组织要尽量研磨得细一点 颗粒太大细胞裂解不彻底 在随后过