十六烷基溴化吡啶与脱氧核糖核酸作用的共振光散射光谱及其分析应用.pdf

十六烷基溴化吡啶与脱氧核糖核酸作用的 共振光散射光谱及其分析应用 冯素玲 31 刘雪平 2 樊 静 1 1 河南师范大学化学与环境科学学院 河南省环境污染控制实验室 新乡453007 2 平顶山学院化学系 平顶山467000 摘 要 在碱性条件下 十六烷基溴化吡啶 CPB 与脱氧核糖核酸 DNA 共存时 体系产生较强的共振光散 射 其强度与DNA浓度呈线性关系 据此提出了基于阳离子表面活性剂的共振光散射法定量测定DNA 在 最佳实验条件下 测得小牛胸腺DNA ctDNA 和鱼精子DNA fsDNA 的线性范围分别为0 2 210 mg L和 012 1 25 mg L 检出限分别为0 07 mg L和0 05 mg L 该方法已应用于合成样品及实际样品中DNA含量 的测定 关键词 共振光散射 脱氧核糖核酸 十六烷基溴化吡啶 2004202212收稿 2004212212接受 本文系河南省自然科学基金资助项目 No 0211020200 1 引 言 DNA是生物体内重要的遗传物质 目前 定量测定DNA的方法通常有分光光度法 1 荧光分析 法 2 5 及放射标记法 6 其中 分光光度法灵敏度低 耗时长 1 荧光分析法应用极为广泛 但是有些 有机染料有毒 价格昂贵 不易获得 放射标记法测定DNA灵敏度高 但受放射周期的限制 同时放射 性试剂污染严重 不易处理 共振光散射 RLS 分析法近年来在生物大分子及离子缔合物的分析中应用越来越广泛 可以用来 测定金属离子 7 蛋白质 8 9 及核酸 10 12 等 对生物分析技术的发展有着重要的意义 采用共振光散 射法测定DNA 主要使用有机染料试剂 其中包括结晶紫 10 天青 A 11 甲基紫 12 等 但没有用于实际 样品分析 本实验研究了带正电荷的十六烷基溴化吡啶 CPB 通过静电作用与DNA结合 使体系的共 振光散射增强 由此定量测定DNA 该方法快速 简便 灵敏度高 稳定性好 检出限达0 05 mg L 已成 功应用于合成样品及实际样品中DNA含量的测定 2 实验部分 2 1 仪器与试剂 FP26200荧光分光光度计 日本分光公司 pHS23C型数字酸度计 杭州东星设备仪器厂 100 mg L DNA储备液 将小牛胸腺DNA ctDNA 德国Sigma公司 和鱼精DNA fsDNA 德国Sigma公司 在4 下溶于水 放置24 h以上 并不时摇动 配好后保存在冰箱中 操作液浓度为25 0 mg L 0 01 十六烷基溴化吡啶 CPB 溶液 Tris2HCl缓冲溶液 pH 10 4 实验所用水均为二次蒸馏水 所用试剂 除标注外均为分析纯 2 2 实验方法 于10 mL比色管中加入适量的25 0 mg L DNA溶液和1 5 mL pH为10 4 Tris2HCl缓冲液 摇匀后 加入1 0 mL 0 01 CPB溶液 再次摇匀并稀释至刻度 于荧光分光光度计上 在波长250 600 nm范 围内进行同步扫描 获得共振光散射光谱 在最大散射波长处 ex em 363 nm 测量共振光散射强 度 IRLS 第33卷 2005年3月 分析化学 FENXIHUAXUE 研究简报 Chinese Journal ofAnalytical Chemistry 第3期 377 380 3 结果与讨论 3 1 光谱特征 图1是体系的共振光散射光谱 从图1可以看出 在碱性介质中 DNA和CPB在250 600 nm波 长范围内的共振光散射十分微弱 图1曲线1和 2 当体系中DNA和CPB共存时 体系在265 363和 图1 体系的共振光散射光谱 Fig 1 The resonance light scattering RLS spectra of the system CCPB 110 0 2 5 0 001 CDNA mg L 1 0 75 2 0 0 3 0 375 4 0 75 5 1 125 Tris2HCl 1 5 mL pH 10 4 CPB Cetylpyridinium bromide DNA Deoxyribonucleic acid 492 nm处产生特征RLS峰 并且在一定范围内IRLS随着 DNA浓度的增大而增大 图1曲线3 5 其中363 nm处 的RLS峰最强 这是因为CPB与DNA分子骨架上带负电 荷的磷酸根之间通过静电作用 形成体积较大的粒子 使共 振光散射增强 3 2 最佳实验条件 3 2 1 介质的种类 酸度及试剂加入顺序的影响 考察了 Tris2HCl Britton2Robinson及Na2HPO42NaOH 3种缓冲溶液 对体系 IRLS的影响 发现在 Tris2HCl介质中 体系的稳定 性好 且灵敏度高 此外 介质pH值 用Tris2HCl和Tris2 NaOH调节 的变化对体系的共振光散射强度影响也很大 当pH值在9 0 11 0之间时 体系 IRLS值变化缓慢 继续 增大pH值 体系稳定性差 本实验选择pH为10 4的 Tris2HCl缓冲溶液为介质 其最佳用量为1 5 mL 试剂加 入顺序对体系的RLS产生影响 3 2 2 离子强度对体系的影响 实验发现 离子强度的变 化对试剂空白几乎没有影响 加入DNA后 随着离子强度的增大 体系信号逐渐降低 这是由于Na 与DNA分子骨架上的PO 3 4 发生静电吸引 从而排斥CPB与DNA分子的作用 同时 DNA浓度越大 离子强度的影响也越大 因此 本实验通过加入固定体积的缓冲溶液以保持稳定的 较低的离子强度 3 2 3 表面活性剂种类及其用量的选择 实验了Triton X2100 十二烷基磺酸钠 SLS 十二烷基三甲 基溴化铵 DTAB 十六烷基三甲基溴化铵 CTAB 十四烷基二甲基苄基铵 Zeph 和CPB 6种表面活 性剂 发现阳离子表面活性剂Zeph CTAB和CPB对体系的共振光散射有增强作用 而非离子表面活性 剂 Triton X2100 及阴离子表面活性剂 SLS 几乎不起作用 这是因为阳离子表面活性剂带正电荷 能 与DNA发生静电作用 其中DTAB由于碳链较短 分子体积小 体系的共振光散射强度增加不明显 CTAB的灵敏度比Zeph和CPB的都要小 可能是因为Zeph CPB含有芳香环的缘故 实验表明 体系共 振光散射增强的程度与CPB的浓度有关 当体系中CPB浓度为0 001 时 IRLS值最大 继续增大 CPB浓度 IRLS值反而降低 3 2 4 热变性实验 取一定量的25 0 mg L DNA溶液 于沸水浴中加热30 min 使双链DNA ds2 DNA 分解为单链DNA ss2 DNA 放入冰水中冷却 以防止其复性 然后放置至室温 按实验方法进行操 作 发现热变性DNA的灵敏度降低 3 3 共存物的影响 在实验条件下 研究了金属离子 酸根离子 核苷酸 蛋白质 糖类及表面活性剂等近30种共存物质 对体系的影响 若允许 IRLS的变化率不大于10 当DNA的浓度为0 75 mg L时 允许301 mg L K 102 mg L NO 3 96 mg L SO 2 4 H2PO 4 30 mg L 2 CD 24 1 mg L Ca 2 Mg 2 16 8 mg L牛血清蛋白 7 mg L氨基乙酸 DL2 赖氨酸 尿素 5 mg L Cu 2 Ni 2 4 mg L胸腺嘧啶 3 5 mg L Zeph 葡萄糖 3 mg L Mo 麦芽糖 乳糖 2 mg L Triton X2100 1 mg L Al 3 Cd 2 0 8 mg L Co 2 CTAB 鸟嘌呤 0 2 0 7 mg L Bi 3 Hg 2 Zn 2 腺嘌呤 人血清蛋白 0 04 mg L Fe 3 0 8 10 2 mg L SLS存在 发 现在碱性条件下 易水解的金属离子 如Fe 3 Hg 2 和蛋白质干扰较大 然而 在实际样品中 这些物 质的含量都很低 并不干扰测定 873 分 析 化 学第33卷 3 4 工作曲线 灵敏度 精密度及体系的稳定性 按实验方法制作了工作曲线 结果列于表1 由表1可知 DNA的种类不同 方法的线性范围和灵 敏度也不同 一般测定fs DNA的灵敏度要比ctDNA的高 而热解DNA的最低 对含量为0 75 mg L的 fsDNA标准溶液进行了10次平行测定 其相对标准偏差为2 2 在实验条件 下 体系的 IRLS在2 min内达到最大 值 并在3 h内保持稳定 3 5 样品的测定 3 5 1 合成样品的测定 根据共存物 的干扰特性 在DNA标准溶液中加入不 同种类 不同浓度的干扰物 合成了5个 样品 实验结果列于表2 表1 DNA的测定参数 n 6 Table 1 Analytical parameters of deter mination n 6 DNA 线性回归方程 Linear regression equation C mg L 线性范围 Linear range mg L 检出限 Detection limit mg L 相关系数 Correlation coefficien fs DNA I 64 4C 2 080 2 1 250 050 9983 ctDNA I 48 0C 1 960 2 2 00 070 9986 ss2DNA I 27 0C 1 120 5 2 00 120 9979 DNA Deoxyribonucleic acid fs 鱼精 fish sperm ct 小牛胸腺 calt thy2 mus 单链 single strand 表2 合成样品测定结果 n 6 Table 2 Aanlytical results for synthetic samples n 6 样品 Samples CDNA mg L 主要共存物 a Main additives mg L 测得值 Found mg L 回收率 Recovery RSD fsDNA15 0 2 CD Cu2 Ni2 Zn2 14 492 0 1013 2 fsDNA20 0BSA Fe3 Ca2 Mg2 19 593 0 1094 5 fsDNA25 0 腺嘌呤Adenine 鸟嘌呤Guanine 胸腺嘧啶Thymine HSA 25 197 8 1021 5 ctDNA15 0Triton X2100 Zeph Al3 Cd2 15 8101 1093 3 ctDNA20 0 麦芽糖Maltose 葡萄糖Glucose 乳糖Lactose 2CD 20 9100 1092 8 a Fe3 0 045 mg L Al3 0 1 mg L 麦芽糖 maltose 葡萄糖 glucose 乳糖 lactose 腺嘌呤 ademine 鸟嘌呤 guanine 胸腺 嘧啶 thymine Cd2 1 0 mg L Zn2 4 0 mg L Cu2 Ni2 10 0 mg L 2 CD Ca2 20 0 mg L Mg2 25 0 mg L Triton X2100 Zeph 2 0 mg L BSA 6 7 mg L HSA 0 69 mg L 3 5 2 大肠杆菌DNA的测定 取一份提取的大肠杆菌DNA样品 适当稀释后按照上述实验方法进行 测定 并进行样品的加标回收实验 所得结果列于表3 表3 样品测定结果 n 4 Table 3 Determination results for real samples n 4 DNA加入量 DNA Added mg L 测得量 Found mg L 回收率 Recovery RSD DNA加入量 DNA Added mg L 测得量 Found mg L 回收率 Recovery RSD 00 293 4 70 3750 713112 01 2 0 751 073104 03 0 References 1 Sheridan R E Odonnell CM Pautler E L Anal B iochem 1973 52 2 657 659 2 Chen Q LiD Zhao Y Yang H Zhu Z Xu J Analyst 1999 124 6 901 906 3 Zheng H LiD Zhu C Chen X Xu J Fresenius J Anal Chem 2000 366 5 504 507 4 Guo X Li F Zhao Y Anal Lett 1998 31 6 991 1005 5 Yang H Zhu Q Chen Q LiDi Xu J Fresenius J Anal Chem 2000 366 3 303 306 6 Maxam A M GilbertW M ethods Enzymol 1980 65 Nucleic acids Pt I 499 560 7 Cao Q Zhao Y Yao X Hu Z Xu Q H Spectro Acta A 2000 56 7 1319 1327 8 DongL Jia R LiQ Chen X Hu Z Analyst 2001 126 5 707 711 9 Yang C Li Y Huang C Anal Lett 2002 35 12 1945 1957 10 ZhangW Xu H Wu S Chen X Hu Z Analyst 2001 126 4 513 517 11 Li Y Huang C Huang X LiM Anal Chi m Acta 2001 429 2 311 319 12 ZhangW Xu H Xue C Chen X Hu Z Anal Lett 2001 34 4 553 568 973 第3期冯素玲等 十六烷基溴化吡啶与脱氧核糖核酸作用的共振光散射光谱及其分析应用 Resonance L ight Scattering Spectra of Cetylpyridin ium Brom ide and Deoxyribonucleic Acid System and Its Application to Deoxyribonucleic Acid Assay Feng Suling3 1 Liu Xueping 2 Fan Jing 1 1 Henan Key Laboratory for Environm ental Pollution Control College of Chem istry and Environmental Science Henan Nor m alUniversity X inxiang453007 2 Pingdingshan University Pingdingshan467000 Abstract A cationic surfactant cetylpyridinium bromide CPB was used to deter mine deoxyribonucleic acids DNA at nanogram levelwith a resonance light scattering RLS technique The electrostatic interac2 tions between CPB and DNA gave rise to three characteristic peaks of RLS at 263 nm 363 nm and 492 nm Under optimal conditions the enhanced intensity of RLSwas proportional to the concentrations ofDNA in the range of 0 2 2 0 mg L for