小麦条锈菌生理小种国际鉴别寄主Spaldings Prolific 中抗条锈病基因YrSpP 的微卫星标记.pdf

中国农业科学 2005 38 8 1574 1577 Scientia Agricultura Sinica 收稿日期 2005 03 29 基金项目 国家 973 计划项目 G2000016200 国家 863 计划项目 2002AA245041 和国家自然科学基金资助项目 30270867 及 30471131 作者简介 关海涛 1979 男 辽宁沈阳人 硕士研究生 主要从事植物抗病遗传研究 Tel 010 62816081 E mail guanhaitao1979 徐世昌为通讯作者 E mail shichangxu317 小麦条锈菌生理小种国际鉴别寄主 Spaldings Prolific 中抗条 锈病基因YrSpP的微卫星标记 关海涛 1 2 郭玉华2 王悦冰1 刘太国1 蔺瑞明1 徐世昌1 1中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点实验室 北京 100094 2 沈阳农业大学 沈阳 110161 摘要 Spaldings Prolific 是国际小麦条锈菌鉴别寄主和国内外重要抗源 以含有小麦抗条锈病基因YrSpP 的近等基因系 Taichung29 6 YrSpP及其轮回亲本 Taichung29 为材料 用目的基因所在 2B 染色体上 88 对微卫星 引物对其基因组 DNA 进行 PCR 扩增和电泳分析 发现用 WMC441 引物在近等基因系与轮回亲本间稳定扩增出特异性 DNA 片段 经 F2代群体 162 个抗 感单株检测证实 该片段位点与抗条锈病基因YrSpP连锁 遗传距离为 10 9 cM 确定 WMC441 为抗条锈病基因YrSpP的标记 并可用于该基因的检测和辅助选择 关键词 小麦 抗条锈病基因 YrSpP 微卫星标记 Microsatellite Marker of the Resistance Gene YrSpP to Wheat Stripe Rust GUAN Hai tao1 2 GUO Yu hua2 WANG Yue bing LIU Tai guo1 LIN Rui ming1 XU Shi chang1 1Institute of Plant Protection Chinese Academy of Agricultural Sciences State Key Laboratory Biology for Plant Diseases and Insect Pests Beijing 100094 2 Shenyang Agricultural University Shenyang 110161 Abstract Spaldings Prolific is one of the 15 wheat cultivars in a set of differential cultivars used in Europe and the world SSR analysis was performed between a near isogenic line NIL Taichuang29 6 Spaldings Prolific carrying the resistance gene YrSpP to wheat stripe rust and its recurrent parent Taichung29 Eighty eight SSR primers on 2B chromosome were screened and reproducible polymorphic DNA fragment was amplified by WMC441 Genetic linkage was tested on 162 segregating F2 plants It showed that microsatellite marker WMC441 was linked with the resistance gene YrSpP to wheat stripe rust and the genetic distance was 10 9 cM Key words Wheat Resistance gene against stripe rust YrSpP Microsatellite marker 小麦条锈病是中国小麦生产上的重要病害 由于 小麦条锈菌尚未发现有性阶段 利用鉴别寄主抗病基 因是检测小种致病基因的唯一途径 Spaldings Prolific 是国际小麦条锈菌鉴别寄主 含 1 对显性抗条锈病基 因 1 McIntosh 将 Spaldings Prolific 中含有的抗条锈 病基因命名为YrSpP Gosal将来源于Spaldings Prolific 的抗条锈病基因 YrSpP 定位在 2B 染色体上 2 此外 Spaldings Prolific 对目前国内流行的条中 31 号小种有 良好的抗性 3 在国内外仍是良好的抗性基因供体 4 因此 标记定位 Spaldings Prolific 中的抗条锈病基因 利于在基因水平上研究病原物生理专化 并将抗病性 分析提高到基因分析水平 同时也为抗病育种的分子 标记辅助选择提供目的基因快速检测手段 本文报道 了利用SSR技术标记定位小麦抗条锈病基因YrSpP的 研究结果 1 材料与方法 1 1 材料 含 有 YrSpP 的 小 麦 抗 条 锈 病 近 等 基 因 系 Taichung29 6 YrSpP 及其轮回亲本 Taichung29 和抗性 基因供体 Spaldings prolific 1 2 抗性鉴定和 F2代群体构建 8 期 关海涛等 小麦条锈菌生理小种国际鉴别寄主 Spaldings Prolific 中抗条锈病基因 YrSpP 的微卫星标记 1575 采用常规杂交法 以轮回亲本 Taichung29 为母本 与近等基因系 Taichung29 6 YrSpP 杂交 自交和测交 获 F1 F2 BC1代 抗性鉴定用条锈菌小种条中 17 号 扫抹法接种 置自控温室 昼 15 18 夜 12 14 光照 12 h d 1 光强 6 000 lx 潜育发病 调查标准在 传统的 6 级基础上 用 进一步详细划分 为 11 级 根据双亲 F1 F2 BC1代侵染型级别及各 级侵染型数目划分抗 感类型 刘孝坤 1988 建 立包括 162 个单株的 F2代群体 1 3 基因组 DNA 提取 提取参照 Rogers 和 Bendich 1985 Micheli 等 1994 方法略改进 取 0 5 g 新鲜小麦叶片 置液氮 中研磨成粉末 加入 2 CTAB 提取缓冲液 65 水 浴 30 min 加入等体积的氯仿 异戊醇 24 1 反复 抽提 取上清加入 RNase 至终浓度 100 g ml 1 37 水浴 60 min 氯仿 异戊醇 24 1 抽提 1 次 取上 清加入2倍体积预冷的无水乙醇沉淀DNA 挑出DNA 沉淀 用 70 乙醇洗涤 弃上清 加入适量的 TE 缓 冲液溶解备用 1 4 SSR 扩增 引物序列来自 R der 实验室 5 由博亚公司合成 微卫星反应体系 20 l 包括 10 mmol L 1 Tris HCl pH 8 3 1 5 mmol L 1 MgCl2 50 mmol L 1 KCl 0 2 mmol L 1 dNTP 引物各 0 25 mol L 1 1U Taq 酶 50 ng 基因组 DNA 反应条件 94 5 min 95 40 s 56 60 s 72 60 s 30 个循环 72 10 min 扩增在 PTC 220 型 PCR 仪上进行 1 5 电泳及银染 采用 6 变性的聚丙烯酰胺凝胶 电泳恒功率 65W 泳动 1 5 h 银染法显色 2 结果与分析 2 1 基因供体抗性遗传分析 近 等 基 因 系Taichung29 6 YrSpP及 其 与 Taichung29 杂交的 F1代对条中 17 号小种表现高抗 侵染型为 0 型 轮回亲本 Taichung29 对条中 17 号高 感 侵染型为 4 型 根据双亲 F1 F2 BC1侵染型 级别及各级侵染型数目将 0 2 型植株划为抗病类型 株 3 4 型划为感病类型株 则由 162 株 F2代群体中 分离出 119 株抗病株 43 株感病株 抗感分离比为 119R 43S 卡方测验符合由 1 对显性基因控制的 3R 1S 的理论比例 2 3 1 0 206 P 0 05 与 BC1代的分析结果相同 2 1 1 0 014 P 0 05 表 表明 Taichung29 6 YrSpP 对条中 17 号的抗 性由 1 对显性基因控制 表 亲本和组合对条中 17 号小种的抗性表现 Table Distribution of plants in parents or cross for resistance to the race CY17 of Puccinia striiformis 侵染型 Infection types 亲本和组合 Parents or cross 世代 Generation 0 0 0 11 22 3 33 4 理论比例 Expected ratio 2值 Chi square value P 值 Probability T29 6 YrSpP P1 30 T29 P2 30 Spaldings Prolific P3 40 T29 T29 6 YrSpP F1 25 F2 90 25 112241 3 1 0 206 0 75 0 50 BC1 20 6 221 1 0 014 0 90 0 75 T29 Taichung29 2 2 基因组 DNA 多态性分析及回检 根据微卫星引物的锚定性 选用 YrSpP 基因所在 2B 染色体上 88 对引物对含有 YrSpP 的小麦抗条锈近 等 基 因 系Taichung29 6 YrSpP及 其 轮 回 亲 本 Taichung29 和抗性基因供体品种 Spaldings Prolific 基 因组 DNA 进行了多态性分析 结果显示 用引物 WMC441 在近等基因系 Taichung29 6 YrSpP 与轮回 亲本 Taichung29 间能稳定扩增出共显性的差异 DNA 片段 近等基因系 Taichung29 6 YrSpP 的抗性基因供 体品种 Spaldings Prolific 也稳定扩增出与近等基因系 相同的带 图 2 3 遗传连锁性分析 为检测目的基因位点与所获标记位点的遗传连锁 性 对构建的 F2代群体 162 个单株分别提取基因组 DNA 用引物 WMC441 进行 PCR 扩增和电泳分析 结果显示 在抗性鉴定确认的 119 个抗病单株中 有 1576 中 国 农 业 科 学 38 卷 44株扩增出与近等基因系Taichung29 6 YrSpP相同的 A 带 68 株扩增出杂合带 即 H 带 既有近等基因系 的扩增带又有轮回亲本的扩增带 7 株检测到与感 病的轮回亲本相同的 B 带 在 43 株感病单株中 有 34 株扩增出与感病的轮回亲本相同的 B 带 对 162 个 F2单株的扩增带型进行统计分析 发现在抗 感单 株中有 16 株发生了标记位点交换 即标记位点与目的 基因发生分离 交换率为 9 89 说明该标记位点与 抗条中 17 号小种的 YrSpP 基因存在连锁关系 比较 162 个 F2代单株抗性鉴定中的侵染型及其扩增带型 用 MapMaker3 0 软件进行遗传距离测定 确定遗传距 离为 10 9 cM P1 Taichung29 P2 Taichung29 6 YrSpP P3 Spaldings Prolific R 抗性植株 S 感性植株 A 抗性带型 B 感病带性 H 杂合带型 M 分子量标准 180 bp P1 Taichung29 P2 Taichung29 6 YrSpP P3 Spaldings Prolific R Resistant plant S Susceptible plant A Homozygote for the allele from Taichung29 6 YrSpP B Homozygote for the allele from Taichung29 H Heterozygote carrying both alleles A and B M Molecular standard 180 bp 图 SSR 引物 WMC441 对 Taichung29 6 YrSpP Taichung29 部分 F2单株的扩增图谱 Fig Amplification of part F2 plant Taichung29 6 YrSpP Taichung29 using SSR primer WMC441 3 讨论 微卫星即简单序列重复 SSR 最早由 Condit 和 Hubbel 在植物中发现 6 1992 年 Akkaya 等在玉米中 发现了 SSR 的长度多态性 7 由此开发了一种以 PCR 为基础的新的分子标记技术即 SSR 技术 由于 SSR 在动植物中普遍存在 与 RFLP 和 RAPD 相比多态性 高 8 近年来得到广泛应用 本研究采用 SSR 技术 以含有小麦抗条锈病基因 YrSpP 的近等基因系 Taichung29 6 YrSpP 及其轮回亲本 Taichung29 为材 料 用目的基因所在 2B 染色体上 88 对微卫星引物对 其基因组 DNA 进行 PCR 扩增和电泳分析 结果发现 用 WMC441 引物在近等基因系与轮回亲本间稳定扩 增出特异性 DNA 片段 该片段位点与 YrSpP 基因连 锁 遗传距离为 10 9cM 确定 WMC441 为抗条锈病 基因 YrSpP 的标记 可用于该基因的检测和辅助选择 小麦的第一张微卫星遗传图谱由R der等于1998 年建立 5 与 RFLP 相比 大多数小麦 SSR 标记都是 基因组专化性的 只在小麦 A B D 基因组中含有 一个特定的扩增位点 5 因而具有锚定性 本实验依 据 Gosal 的结果对 2B 染色体上的引物进行筛选 建立 了与 Spaldings Prolific 中抗 CY17 的 YrSpP 基因连锁 的 WMC441 标记 由于 WMC441 引物在除 2B 染色 体 外 其 他 染 色 体 上 均 未 发 现 有 扩 增 位 点 且 Taichung29 6 YrSpP 对条中 17 号小种的抗性由 1 对 显性基因控制 因此可以确认 WMC441 为 YrSpP 基 因的 SSR 标记 因 WMC441 位于小麦的 2B 染色体的 长臂上 故而将 YrSpP 基因定位在 2B 染色体的长臂 上 若再获得 1 个标记 可进一步将 YrSpP 基因定位 在小麦遗传图谱上 当有更多的 SSR 位点被发现时 也可筛选到距离更近的标记 目前生产上的当家品种对新的生理小种条中 31 32 均表现为不抗病 9 而 Spaldings Prolific 对国内流 行的条中 31 号小种有良好的抗性 3 可用作育种有效 抗源 所以本研究所获的 SSR 标记可作为 Spaldings Prolific中的抗条锈基因YrSpP的辅助选择标记加以利 用 在抗病育种中有重要应用价值 References 1 Johnson R Stubbs R W Fuchs E Chamberlain N H Nomenclature for physiologic races of Puccinia striiformis infecting wheat Transactions of the British Mycological Society 1972 58 75 80 2 McDonald D B McIntosh R A Wellings C R Singh R P Nelson J C Cytogenetical studies in wheat Location and linkage studies M P1 P2 P3 S S S S S R R R R R R R R B A A B B B B B H H H H H A A A 180bp 8 期 关海涛等 小麦条锈菌生理小种国际鉴别寄主 Spaldings Prolific 中抗条锈病基因 YrSpP 的微卫星标记 1577 on gene Yr27 for resistance to stripe yellow rust Euphytica 2004 136 3 239 248 3 赵文生 徐世昌 张敬原 万安民 小麦条锈菌鉴别寄主尤皮 II 号抗条锈性遗传分析 植物保护学报 2004 31 2 127 133 Zhao W S Xu S C Zhang J Y Wan A M Inheritance of stripe rust resistance in wheat cultivar Jubeljna Acta Phytophylacica Sinica 2004 31 2 127 133 in Chinese 4 Su H Conner R L Graf R J Kuzyk A D Virulence of Puccinia striiformis f sp tritici cause of stripe rust on wheat in western Canada from 1984 to 2002 Canadian Journal of Plant Pathology 2003 25 312 319 5 R der M S Korzun V Wendehake K Plaschke J Tixer M H Leroy P Ganal M W A microsatellite map of wheat Genetics 1998 149 2 007 2 023 6 Condit R Hubbel S Abundance and DNA sequence of two bas