生物化学 第八篇 遗传信息的贮存和表达.doc

第八篇 遗传信息的贮存和表达（第三十二四十三章 小结）第三十二章 DNA复制DNA复制是以DNA为模板合成相同DNA分子的过程，其主要特征有：需要模板、四种dNTP和Mg2；被复制的区域必须进行解链；半保留复制；需要引物，作为引物的主要是短的RNA，少数是蛋白质；复制的方向始终是53；具有固定的起点；多为双向复制；半不连续性；高度有序、高度进行和高度忠实。参与DNA复制的主要酶和蛋白质有DNA聚合酶、解链酶、SSB、引发酶、拓扑异构酶、连接酶和端聚酶等。DNA聚合酶是参与DNA复制的主要酶。大肠杆菌细胞中有DNA聚合酶、和。大肠杆菌的DNA聚合酶也称为Kornberg酶，是一种多功能酶，具有53的聚合酶活性、53和35的外切核酸酶活性。使用特殊的蛋白酶处理聚合酶得到的大片段称为Klenow酶，具有35外切酶和53聚合酶活性，Klenow酶的手指-拇指-掌心三维结构模式出现在许多具聚合酶上。聚合酶也具有35外切酶活性，但无53外切酶活性，参与DNA的修复。聚合酶由多个亚基组成，虽然也具有53聚合酶活性和35外切酶活性，但却分属不同的亚基。该酶是参与大肠杆菌染色体DNA复制的主要酶。完整的聚合酶由核心酶、滑动钳和钳载复合物组成。在DNA复制过程中，滑动钳松散地夹住DNA模板，并能自由地向前滑动，大大提高了酶的进行性。DNA聚合酶和属于易错的DNA聚合酶，参与DNA的修复合成。真核细胞中至少有15种以上的DNA聚合酶，除了5种发现较早的聚合酶、和以外，还发现了聚合酶、和等。这些新发现的聚合酶主要参与DNA的跨越合成。、和具有3- 外切酶活性。DNA解链酶是一类催化DNA双螺旋解链的酶，它除了能够结合DNA以外，还能够结合NTP并同时具有依赖于DNA的NTP酶活性。SSB是一种专门与DNA单链区域结合的蛋白质，无任何酶的活性。DNA拓扑异构酶是一类通过催化DNA链的断裂、旋转和重新连接而直接改变DNA拓扑学性质的酶。拓扑异构酶被分型和型。型在作用过程中，只能切开DNA的一条链，而型在作用过程中同时交错切开DNA的两条链。参与DNA复制的是型。所有拓扑异构酶的作用都是通过两次转酯反应来完成的。DNA引发酶是一种特殊的RNA聚合酶，用来合成RNA引物。原核细胞内切除RNA的酶是DNA聚合酶或核糖核酸酶H。真核细胞内负责切除RNA引物的酶核糖核酸酶H/FEN1或FEN1/Dna2。DNA连接酶是一类催化一个双螺旋DNA内相邻核苷酸3- 羟基和5- 磷酸甚至两个双螺旋DNA两端的3- 羟基和5- 磷酸发生连接反应形成3，5- 磷酸二酯键的酶。DNA连接酶在催化连接反应时需消耗能量。有的连接酶使用 NAD+，有的使用ATP。尿嘧啶DNA糖苷酶是一种专门用来切除出现在DNA链上非正常U的水解酶。端聚酶由蛋白质和RNA组成，其中RNA部分序列充当模板，蛋白质具有反转录酶的活性，它所起的作用是复制端粒DNA，维持染色体端粒结构的完整。所有的DNA复制都可以分为起始、延伸、终止和分离三个阶段。复制是以复制子为单位进行的。任何一个复制子都含有一个复制起始区。不同基因组DNA具有不同的复制子结构，像细菌染色体、质粒、噬菌体、病毒和线粒体基因组DNA都只有一个复制子，而真核细胞内的每一个染色体DNA都含有多个复制子。大肠杆菌染色体DNA的复制为复制，起始阶段最重要的事件是对其复制起始区oriC 的识别，直到形成引发体。在此阶段涉及DnaA、DnaC、DnaT、DnaB、PriA、PriB、PriC和DnaG蛋白，它们按照一定的次序在oriC 结合或解离，相互间具有招募作用。复制的延伸首先是复制体的形成，这需要聚合酶全酶加入到引发体。一个双向复制的复制子有两个复制体。在每一个复制体上，同时进行前导链和后随链的合成。在一个复制叉内的聚合酶全酶同时催化前导链和后随链的合成，这是因为后随链的模板在复制中形成突环结构。复制结束于终止区，需要Tus蛋白的帮助。最后的两个子代DNA分子的分离需要拓扑异构酶。某些噬菌体DNA和一些小的质粒在宿主细胞内以滚环复制方式扩增DNA，此外，真核细胞染色体DNA的局部扩增也可以通过这种方式进行；线粒体DNA、叶绿体DNA和少数病毒以D-环的方式进行复制。真核细胞的细胞核DNA复制与原核细胞的染色体DNA复制不完全相同。参与细胞核DNA正常复制的聚合酶是、和。前导链和后随链的合成都经历了从DNA聚合酶/引发酶复合物到PCNA/DNA聚合酶的转换；FEN-1/RNaseH负责切除RNA引物，DNA连接酶负责连接相邻的冈崎片段，拓扑异构酶负责清除复制叉移动中形成的正超螺旋，拓扑异构酶a和b则负责将最后的2个以共价键相连的连环体DNA分开。解决线形DNA末端复制难题的机制有：使用端聚酶、经重组形成串联体、将线形DNA暂时转变为环形DNA、滚环复制以及使用蛋白质-dNTP作为引物。DNA复制的调控主要在起始阶段，原核细胞利用甲基化来调控，真核细胞内存在两种机制控制DNA复制的启动，一种是由执照因子控制的正调控，另一种是由增殖蛋白控制的负调控。第三十三章 DNA损伤、修复和突变DNA是唯一的一种损伤后可被完全修复的分子，而其他生物大分子在受到损伤以后被降解或被取代。导致DNA损伤的根源有细胞内在的因素和环境中的因素。属于细胞内在因素的有DNA复制过程中发生的错误、DNA结构本身的不稳定、细胞内活性氧的破坏作用。属于环境因素的有物理因素和化学因素，前者包括紫外辐射和离子辐射，后者包括各种化学诱变剂。DNA损伤分为碱基损伤和DNA链的损伤。碱基损伤包括碱基脱落、碱基转换、碱基修饰、碱基交联和碱基错配。DNA链的损伤包括DNA链的断裂、DNA链的交联和DNA与蛋白质之间的交联。DNA修复可分为直接修复、切除修复、易错修复和重组修复等。直接修复是直接将受到损伤的碱基逆转为正常的碱基，而不需要将它切除。能够被这种机制修复的损伤有嘧啶二聚体和6- 烷基鸟嘌呤。细胞内连接酶将断裂的DNA链重新缝合的修复也属于直接修复。参与嘧啶二聚体直接修复的酶为DNA光裂合酶，此酶能够直接识别和结合DNA上的嘧啶二聚体，利用吸光色素捕捉到的光能将嘧啶二聚体打开，最后再与DNA解离。催化烷基化碱基直接修复的酶是烷基转移酶，该酶以“自杀”的方式参与反应。切除修复就是先切除损伤的碱基或核苷酸，然后以另外一条链上正确的核苷酸为模板，重新合成正常的核苷酸。整个切除修复过程包括识别、切除、重新合成和重新连接。切除修复又分为BER和NER，前者直接识别具体的受损伤的碱基，而后者识别损伤对DNA双螺旋结构造成的扭曲。BER最初的切点一般是N-糖苷键，首先切除的受损伤的碱基，由DNA糖苷酶催化，DNA糖苷酶作用后在DNA分子上留下AP位点，被细胞内的AP内切酶识别后切除。随后的修补合成有短修补和长修补两种途径，其中短修补是主要途径。对于DNA的自发脱碱基作用产生的损伤也通过BER。NER最初的切点是损伤部位附近的3，5- 磷酸二酯键，损伤以寡聚核苷酸的形式被切除。整个修复过程在原核细胞和真核细胞中是非常相似的，共包括5步：识别损伤、特殊的内切酶在损伤部位的两侧切开DNA链、去除切口之间的带有损伤的DNA片段、聚合酶填补缺口、连接酶重新缝合切口。NER分为全局性基因组NER和TCR，前者负责修复整个基因组的损伤，速度慢、效率低；后者专门负责修复那些正在转录的基因在模板链上的损伤，速度快、效率高。两类NER的主要差别在于识别损伤的机制，TCR识别损伤的是RNA聚合酶，当它转录到受损伤部位而前进受阻的时候，TCR即被启动。MMR实际上是一种特殊的核苷酸切除修复，主要用来修复DNA分子上错配的碱基，也能修复一些因“复制打滑”而诱发的核苷酸插入或缺失。大肠杆菌的MMR系统为甲基化导向的错配修复，它利用甲基化来区分子链和母链的。DNA双链断裂修复机制一是精确性较高的同源重组，二是非同源末端连接。非同源末端连接是人类修复双链断裂的主要方式，需要Ku70与Ku80蛋白、Artemis、DNA-PKCS和DNA连接酶以及XRCC4，这种方式容易发生错误。损伤跨越仅仅是整个细胞面对DNA损伤做出的一种反应，损伤并没有真正消失。反应的目的是为了维持复制的连续性，克服损伤对复制的阻碍。反应的手段一是通过重组，第二种是所谓的“跨越合成术”。重组跨越使用同源重组的方法将DNA模板进行交换以避免损伤对复制的抑制；跨越合成由专门的一般无校对能力的DNA聚合酶与取代停留在损伤位点上原来的催化复制的聚合酶，在子链上随意插入核苷酸结果导致对损伤位点的跨越。发生在DNA分子上可遗传的结构变化通称为突变。突变可分为点突变和移码突变。点突变是指DNA 分子某一位点上所发生的一种碱基对变成另外一种碱基对的突变，有转换和颠换两种形式。其后果取决于突变位置和具体的变换方式。根据突变的后果，发生在蛋白质基因编码区的点突变可分为沉默突变、错义突变、无义突变和通读突变。移码突变是指在一个蛋白质基因的编码区发生的一个或多个核苷酸的缺失或插入，其危害性最大。突变的原因有内外两种元素。由内在因素引起的突变被称为自发性突变，由外在因素引发的突变被称为诱发突变。自发突变有自发点突变和自发移码突变。自发移码突变的主要原因有“复制打滑”和转座作用。诱发突变也有诱发点突变和诱发移码突变。能够诱发点突变的试剂有碱基类似物、烷基化试剂、脱氨基试剂和羟胺。诱发移码突变的主要是嵌入试剂，它们都是一类扁平的多环分子，能插入到DNA分子上的碱基之间。DNA突变并不是不可逆转的，如果在老的突变位点上发生第二次突变，致使原来的表现型得到恢复，这样的突变被称为回复突变。抑制突变有时被称为假回复突变，它是指发生在非起始突变位点上但能够掩盖或抵消起始突变的第二次突变，它分为基因内校正和基因间校正。基因内校正与起始突变发生在相同的基因内。基因间校正发生在与第一次突变不同的基因上，绝大多数是在翻译的水平上起作用。真核细胞内的DNA损伤能激活损伤监察机制或者激活细胞凋亡机制。从损伤发生到最后的反应出现前后经历了DNA损伤损伤探测信号转导反应等四个阶段。损伤探测由一系列专门的损伤探测蛋白组成。第三十四章 DNA重组DNA重组是指发生在DNA分子内或DNA分子之间核苷酸序列的交换、重排和转移现象，主要包括同源重组、位点特异性重组和转座重组。同源重组是两个DNA分子的同源序列直接进行交换。细菌的接合、转导、转化和真核细胞的同源染色体之间的交换等都属于同源重组。解释同源重组的模型有Holliday 模型、Aviemore模型（单链断裂模型）和双链断裂模型。三种模型在重组过程中形成 状的Holliday结构是一致的。同源重组的基本步骤包括：链断裂与切除、链侵入、退火与合成、形成Holliday 结构、Holliday结构的分离和交换。重组是在特定的蛋白质和酶的协助下完成的。参与大肠杆菌同源重组有关的蛋白质包括：RecA蛋白、RecBCD蛋白、RuvA、RuvB和RuvC蛋白等。RecA蛋白是同源重组中最重要的蛋白质，它参与大肠杆菌所有的同源重组途径。RecA的主要功能有促进2个DNA分子之间链的交换，以及作为共蛋白酶促进LexA 阻遏蛋白的自我水解。RecBCD蛋白由RecB、RecC和RecD三个亚基组成，具有外切核酸酶、解链酶、内切核酸酶、ATP酶和单链DNA外切酶共5个酶活性。RecBCD蛋白的功能是参与细胞内的RecBCD同源重组途径。RuvA蛋白的功能是识别Holliday结构，协助RuvB蛋白催化分叉的迁移。RuvB蛋白是一个解链酶，其功能是催化Holliday结构中分叉的迁移。RuvC蛋白是一种特殊的核酸内切酶，催化Holliday结构的分离，因此被称为解离酶。发生在大肠杆菌的同源重组途径有RecBCD途径、RecF途径和RecE途径。真核生物的同源重组主要发生在细胞的减数分裂的前期的两个配对的同源染色体之间，其中，在细线期和合线期，形成联会复合体，在粗线期进行交换。同源重组也会发生在DNA修复之中，用以修复DNA双链断裂、单链断裂和链间交联。适合真核生物同源重组的模型应该是双链断裂模型，参与同源重组的主要蛋白质有Rad50、Mre11、Nbs1、Spo11、MSH4、Dmc1、PCNA、RPA和DNA聚合酶/等。位点特异性重组是指在DNA特定位点上发生的重组，需要专门的蛋白质识别发生重组的特异性位点并催化重组反应。位点特异性重组也发生链交换、形成Holliday结构、分叉迁移和Holliday结构解离。位点特异性重组可以发生在2个DNA分子之间，导致2个DNA分子之间发生整合。位点特异性重组也可以发生在1个DNA分子内部，可能导致缺失或倒位。位点特异性重组的功能包括：调节噬菌体的整合、调节基因表达、调节胚胎发育期间程序性的DNA重排。转座重组是指DNA上的核苷酸序列从一个位置转位或跳跃到另外一个位置的现象，在原核生物和真核生物的基因组内均可以发生，发生转位或跳跃的核苷酸序列被称为转座子。转座子的靶点与转座子并不存在序列的同源性，接受转座子的靶位点可能是随机的，也可能具有一定的倾向性，这与转座子本身的性质有关。转座事件可导致基因组内核苷酸序列发生转移、缺失、倒位或重复。转座子本身还可能作为细胞内同源重组系统的底物。两个转座子之间发生的同源重组可导致缺失、插入、倒位和移位。细菌内的转座子分为插入序列、复杂型转座子、复合型转座子和Mu噬菌体四类。转座机制分为 “剪切”和“粘贴”机制以及“复制”和“粘贴”机制。原核转座子与真核转座子的差别主要反映在转座的机制上：真核生物转座过程中的剪切和插入是分开进行的，转座子的复制很多通过RNA中间物来进行。根据转座的机制将真核生物的转座子分为反转座子和DNA转座子。反转座子在结构、性质和转位的方式上与反转录病毒的复制相似。根据两端的结构，反转座子可进一步分为LTR反转座子和非LTR反转座子。果蝇基因组上的Copia 元件和酵母体基因组上的 Ty元件属于LTR反转座子，LINE和SINE属于非LTR反转座子。DNA转座子又分为复制型DNA转座子和保留型DNA转座子。每一类转座子都有自主型和非自主型。自主型转座子含有开放的阅读框，它们编码转座所必需的酶或蛋白质；非自主型转座子缺乏足够的编码能力，却保留了转座所必需的顺式序列，在合适的自主型转座子编码的转座酶的作用下，它们照样可以进行转座。第三十五章 DNA转录以DNA作为模板合成RNA的过程被称为转录，它是基因表达的第一步。转录具有以下特征：发生在DNA分子上某些特定的区域；以四种NTP为原料，并需要Mg2+的激活；需要模板，需要解链，但不需要引物；第一个被转录的核苷酸通常是嘌呤核苷酸；转录的方向总是从53；具有高度的忠实性和进行性；转录是受到严格调控的。参与转录反应的主要酶是RNA聚合酶，它不需要引物，缺乏3- 外切酶活性。在三维结构结构上，RNA聚合酶类似于DNA聚合酶的“手掌”状结构。形成原核细胞RNA聚合酶只有一种，有核心酶和全酶两种形式，全酶由核心酶2和可变的因子组装而成，负责起始阶段的反应，纯粹的核心酶只负责延伸阶段的反应。原核细胞RNA聚合酶特异性的抑制剂有利福霉素和利链霉素。在真核细胞有RNA聚合酶、和，它们分别催化不同性质的RNA的合成。真核RNA聚合酶对- 鹅膏蕈碱高度敏感。所有的真核细胞RNA聚合酶最大亚基的羧基端都含有一段7个富含羟基氨基酸残基组成的高度重复的序列，为CTD，CTD的磷酸化参与调节RNA聚合酶的活性。转录过程分为起始、延伸和终止三个阶段。转录起始阶段最重要的事件是识别启动子，形成转录起始复合物。原核转录系统中，RNA聚合酶能够直接识别启动子。而真核转录系统之中，直接识别启动子序列的是特定的转录因子。原核生物属于启动子的序列通常包含称为“-35”区和Pribnow盒（或-10区），其中-35区的一致序列为TTGACA，Pribnow盒的一致序列是TATAAT。起始复合物的形成为转录的限速步骤，起始频率主要取决于启动子强度。一旦启动发生，RNA合成的速度与启动子强度无关。转录的起始实际上是RNA聚合酶与启动子相互作用并形成活性转录起始复合物的过程，大肠杆菌转录起始反应依次为：RNA聚合酶全酶与dsDNA非特异性结合；全酶与启动子形成封闭复合物；封闭复合物异构化成开放复合物；形成第一个磷酸二酯键；启动子清空。在大肠杆菌中，当因子释放后，转录即进入延伸阶段。失去因子的核心酶通过“滑动钳”构象握住DNA，以更快的速度沿着DNA模板链向前移动，催化RNA链的延伸。原核系统转录的终止有两种方式：一种依赖于被称为因子；另一种方式则不需要因子，而需要RNA转录物3- 端的终止子序列。转录的忠实性除了聚合酶本身的高度选择性以外，还与转录过程中的校对机制有关。转录校对有两种方式：一种是焦磷酸解编辑，使用聚合酶的活性中心，以逆反应形式，通过重新参入焦磷酸，催化错误插入的核苷酸的去除；另一种是水解编辑，需要聚合酶倒退一到几个核苷酸，然后通过GreA和GreB切除 3- 端几个核苷酸，包括错配的核苷酸。真核转录系统与原核系转录系统的差别有：染色质和核小体结构对转录有深刻的影响；真核细胞RNA聚合酶高度分工；需要许多转录因子；启动子以外的序列参与调节基因的转录；转录与翻译不存在偶联关系；转录的产物多为单顺反子。真核细胞RNA聚合酶负责28S rRNA、18S rRNA和58S rRNA的基因转录，转录的场所为核仁。这三种rRNA共享一个启动子，由核心启动子上游启动子元件组成。转录需要UBF和SL1两种转录因子。UBF作为组装因子，SL1作为定位因子将聚合酶招募到启动子上。转录的终止于一个分散的由18个nt组成的终止子区域，需要转录终止因子。RNA聚合酶负责小分子RNA的转录，包括tRNA、5S rRNA、7S RNA、snoRNA和无帽子结构的snRNA和某些病毒的mRNA等。转录需要的转录因子有TFA、B和C。其中TFC为组装因子，TFB为定位因子。转录终止与原核生物不需要因子的终止机制相似。RNA聚合酶负责催化mRNA、具有帽子结构的snRNA和某些病毒RNA的转录。 控制蛋白质基因的转录顺式作用元件包括核心启动子、调控元件、增强子和沉默子。属于核心启动子的元件有：TATA盒、起始子、TFB识别元件、下游启动子元件和GC盒。调控元件的作用需要特殊的反式作用因子的结合。增强子是一种能够大幅度增强基因转录效率的顺式作用元件，沉默子则是一种抑制基因表达的顺式作用元件。增强子和沉默子的作用与距离、方向、位置均无关，对临近的基因作用最强。参与蛋白质基因转录的转录因子有所有的蛋白质基因转录都需要的基础转录因子和特定基因转录才需要的特异性转录因子。已知的基础转录因子有TFA、B、D、E、F、H和J等。转录因子和RNA聚合酶与启动子结合的可能次序是：TFDTFATFB(TFF+RNAP ) TFETFH。第三十六章 转录后加工基因转录的直接产物在细胞内必须经历转录后加工才会转变成有活性的成熟RNA分子。RNA经历的后加工反应主要有：去除或添加某些核苷酸序列，修饰某些特定的核苷酸。原核系统的mRNA很少经历后加工。原核细胞的rRNA前体的后加工主要是剪切、修剪和核苷酸的修饰。原核细胞的三种rRNA和某些tRNA作为一个共转录物被转录，需要通过剪切将三种rRNA从共转录物中释放出来。剪切和修剪涉及核糖核酸酶有、D、P、F、E、M16、M23和M5等。核苷酸的修饰主要形式为核糖2- 羟基的甲基化，它发生在剪切和修剪反应之前。原核细胞tRNA前体的后加工方式也包括剪切和修剪以及核苷酸的修饰。其中的核糖核酸酶P由M1RNA和蛋白质组成。核苷酸的修饰主要集中在碱基上。已发现tRNA上的碱基修饰有近百种方式。真核细胞的细胞核mRNA前体所经历的后加工反应主要包括5- 端“戴帽”、3- 端“加尾”、内部甲基化、剪接和编辑。戴帽和加尾仅发生在mRNA和某些snRNA，这与聚合酶的CTD发生特异的磷酸化有关。帽子与第一个被转录的核苷酸之间以5，5- 三磷酸酯键相连，有0型、1型和2型。加帽反应是一种共转录反应。尾巴是指大多数真核细胞核mRNA的3- 端含有一段多聚腺苷酸序列，是在转录后添加上去的。由两种因素控制加尾反应：一种位于mRNA前体内部，为一段6核苷酸序列，充当加尾信号，其一致序列为AAUAAA；另一种为识别加尾信号的蛋白质或催化加尾反应的酶，包括剪切/多聚腺苷酸化特异性因子、剪切刺激因子、剪切因子和、poly (A)聚合酶以及poly (A)结合蛋白。剪接就是去除内含子，连接外显子的过程。真核细胞mRNA前体的剪接是高度精确的。其精确性取决于两个因素：其一是位于外显子和内含子交界处的剪接信号；其二是5种snRNP。真核细胞内有主要剪接途径和次要剪接途径。在主要剪接途径中，剪接信号的一致序列是内含子的前两个GU和最后两个AG，此外还包括在3剪接点不远处存在的一段主要由11个嘧啶碱基组成的序列，内含子中间还有一段被称为分支点的一致序列。参与剪接反应snRNP有U1、U2、U4、U5和U6。其中U1负责识别5- 剪接点的信号；U2主要识别分支点。U2与U6之间通过配对形成两段双螺旋，对于剪接反应非常重要；U5能够与一个外显子的最后一个核苷酸以及下一个外显子的第一个核苷酸结合，从而有助于将两个相邻的外显子并置在一起；U6既能与内含子的5- 端互补配对，也能够与U4配对。U4和U6之间的配对导致两者形成紧密的复合物。次要剪接途径的位于内含子和外显子的剪接信号为AT-GC，参与剪接的snRNP有U11、U12、U4atac、U6atac和U5。剪接反应发生在剪接体。而剪接体主要是由mRNA前体、mRNA前体结合蛋白和5种snRNP在细胞核内按照一定的次序组装起来的超分子复合物。剪接反应是2次连续的转酯反应。剪接体的组装是一个有序和耗能的过程，而且剪接体本身又处在动态变化过程中。同一种Pre-mRNA的不同剪接方式被称为选择性剪接，选择性剪接可导致一个基因编码出两种或两种以上的蛋白质。在某些生物体内（锥体虫和线虫），剪接能发生在两种不同的mRNA前体分子之间，这样的剪接被称为反式剪接。编辑是指在mRNA 的编码区内引入或丢失任何与其基因编码链序列不同信息的过程。它主要有两种方式：一种是在编码区内增加或减少一定数目的核苷酸（主要是U）；另外一种是编码区的碱基在RNA水平上发生转换或颠换。编辑的机制因编辑方式的不同而不同，核苷酸的插入或缺失一般需要gRNA引导，而碱基的转换或颠换则需要特殊的核苷酸脱氨酶的催化。编辑都需要一系列特殊蛋白质的参与，形成所谓的编辑体，以识别、结合和加工编辑点，保证编辑的忠实性。编辑的意义是调节基因表达、创造起始密码子或终止密码子等。真核生物rRNA前体的后加工包括剪切、修剪和修饰，有的还需要剪接。一般需要snoRNA。某些snoRNAs 参与rRNA初级转录物剪切成个别rRNA，但绝大多数snoRNA是通过其特定序列与rRNA前体上修饰位点周围序列的互补配对来确定修饰位点。在核苷酸修饰的同时或结束以后，rRNA前体在特定的核酸酶的催化下进行剪切和修剪。四膜虫26S rRNA前体含有内含子，其后加工包括剪接。此类内含子的切除需要鸟苷或鸟苷酸充当辅助因子，但不需要剪接体和任何其他的蛋白质的参与，完全是一种自我催化的过程。四膜虫rRNA前体中的内含子同时被称为第一类内含子。起催化作用的是由414个核苷酸组成的内含子。除了第一类内含子以外，还有第二类内含子、第三类内含子和tRNA内含子。第一类内含子和第二类内含子的切除不需要任何蛋白质因子的参与，完全是一种自我催化，属于核酶；第三类内含子的去除需要snRNP的帮助，并在剪接体内发生的；tRNA中的内含子非常短，通常为1020 nt，无一致序列。对于真细菌，tRNA内含子属于第一类或第二类内含子，但在真核生物和古细菌，tRNA剪接由一系列专门的蛋白质组成的酶按照一定的次序进行催化。真核生物tRNA前体的后加工方式包括剪切、修剪、碱基修饰、添加CCA和剪接。其中剪切、修剪和碱基修饰与原核系统相似。而添加CCA和tRNA剪接则是真核系统所特有的两种后加工方式。第三十七章 反转录和RNA的复制病毒基因组RNA的复制有两条途径：一是依赖于RNA的RNA合成，即RNARNA，另外一条是以DNA为中间物的合成途径，即RNADNADNARNA。依赖于RNA的RNA合成由RNA复制酶催化。RNA指导的RNA合成的一般特征包括：RNA复制酶由病毒基因组编码，但可能还需要病毒和宿主编码的辅助蛋白；合成的方向为53；绝大多数在模板的一端从头启动合成，少数需要合成引物；属于易错、高突变合成；对放线菌素D不敏感，但对核糖核酸酶敏感；复制多发生在宿主细胞的细胞质，少数在细胞核。以DNA为中间物的RNA复制最为关键的一步就是反转录反应，它是反转录病毒生活史中最重要的一个环节。一个典型的反转录病毒颗粒按照从外到内的次序，依次是外被、衣壳和基因组RNA。基因组RNA共有两个拷贝，有反转录酶、整合酶、蛋白酶和tRNA引物与其结合。一个基因组RNA等同于一个全长的病毒mRNA。HIV属于反转录病毒，它是艾滋病的元凶。其宿主细胞主要包括：CD4-T淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞和树突细胞，这些细胞都含有CD4蛋白和趋化因子受体。HIV的生活史包括：附着与融合；核心颗粒释放和反转录；原病毒DNA进入细胞核；整合；转录及后加工；转录物输出到细胞质；翻译及翻译后加工；新病毒装配和出芽释放。反转录病毒编码的反转录酶以tRNA为引物，具有三个酶活性：53的依赖于RNA的DNA聚合酶活性，该活性用来催化负链DNA的合成；核糖核酸酶H活性，该活性用来水解tRNA引物和基因组RNA；53的依赖于DNA的DNA聚合酶活性，该活性用来合成正链DNA。反转录酶无35外切酶活性而缺乏校对能力。反转录病毒基因组RNA的反转录共经历7步反应，直至基因组RNA被转变成两端含有LTR（U3-R-U5）序列的双链DNA。控制反转录病毒基因转录的启动子和增强子序列位于U3，在T淋巴细胞和巨噬细胞中含有与启动子结合的转录因子，只有在5- 端加上了U3以后，将来才可能在宿主细胞RNA聚合酶的催化下得到全长的mRNA，再经过后加工得到完整的基因组RNA。其他与反转录现象有关的成分有：反转座子、反转录转座子、反转录质粒、反转录内含子、逆转子、端聚酶催化的反转录反应。某些DNA病毒的生活史中也有反转录反应。第三十八章 蛋白质的生物合成与细胞内降解蛋白质的生物合成也称为翻译，参与翻译的主要成分有核糖体、mRNA、各种氨酰tRNA、一种特殊的起始tRNA、起始因子、延伸因子和终止因子。核糖体含有多个功能部位，包括A部位、P部位、E部位、肽酰转移酶、mRNA结合部位、多肽链离开通道、一些可溶性蛋白质因子的结合部位。在蛋白质生物合成中起决定性作用的是rRNA，其肽酰转移酶的活性由大亚基的23S rRNA承担。mRNA作为翻译的模板，在其分子上至少含有一个ORF。每一个ORF一般以起始密码子AUG开始，终止密码子UAG、UGA或UAA结束。原核生物的mRNA通常是多顺反子，含有几个ORF，每一个ORF可翻译出一种蛋白质，而真核生物mRNA为单顺反子，只有一个ORF，一般只翻译出一种蛋白质。tRNA负责携带特定的氨基酸通过其反密码子去阅读mRNA上的密码子。决定某一种tRNA接受氨基酸专一性的主要因素是tRNA分子上由几个核苷酸甚至一个核苷酸组成的正、负元件。氨基酸与tRNA形成氨酰tRNA的过程被称为氨基酸的活化。活化反应由特定的aaRS催化，共消耗2个ATP。催化反应的每一种aaRS面对两种不同的底物都表现出高度的特异性，以确保能够识别和结合正确的tRNA与正确的氨基酸，从而合成正确的氨酰tRNA。氨酰tRNA合成酶使用“双筛”机制，尽可能降低误载的氨酰tRNA的生成。起始因子、延伸因子、释放因子和核糖体循环因子分别参与翻译的起始、延伸、肽链释放和核糖体循环。其中的某些蛋白质因子为G蛋白，其功能的发挥需要结合和水解GTP。自然界存在原核翻译系统、真核细胞质翻译系统、叶绿体翻译系统和线粒体翻译系统。所有的翻译系统都具有以下特征：以mRNA为模板，tRNA为运载氨基酸的工具，核糖体为翻译的场所；阅读mRNA的方向都是从5端3-端，多肽链延伸的方向是从N端C端；使用三联体密码；正确的氨基酸的参入取决于密码子与反密码子之间的相互作用，与tRNA所携带的氨基酸无关；遵守摆动规则。翻译可分为氨基酸的活化、起始、延伸、终止和释放。在原核生物的氨基酸活化阶段，除了形成各种氨酰tRNA以外，还要形成fMet-tRNAMetf，由它阅读起始密码子。翻译的起始阶段发生的主要事件是起始密码子的识别和起始复合物的形成。原核起始密码子的识别主要是依赖于mRNA的5-端的SD序列与16S-rRNA3端的一段反SD序列之间的互补配对。SD序列是mRNA分子上位于起始密码子上游的一段富含嘌呤碱基的序列。此外，mRNA分子上的特殊的二级结构对起始密码子的识别也有影响。起始复合物的形成需要IF1、IF2和IF3的帮助。在形成的三元复合物中，起始密码子正好处于P部位，而fMet-tRNAfMet通过密码子与反密码子的互补作用定位于P部位，A部位是空着的。肽链的合成进入延伸阶段以后，发生的主要事件是进位、转肽和移位且不断的循环。进位需要EF-Tu和ET-Ts，转肽由23SrRNA催化，移位由EF-G催化。正在合成的多肽链通过一个狭窄的出口通道离开核糖体。当终止密码子进入A部位以后，RF1或RF2便识别并结合上去，RF3GTP促进RF1和RF2的作用。核糖体上的肽酰转移酶的活性受到释放因子的作用发生改变，它将肽酰基转移给水分子，肽链因此被释放出来。随后空载的tRNA离开核糖体，释放因子因为与RF3结合的GTP水解而得以释放。最后，在RRF的帮助下，核糖体与mRNA解离。真核生物翻译过程与原核生物的差别有：核糖体的结构不同；原核生物的翻译和转录是紧密偶联的，而真核生物的转录和翻译不存在偶联关系；真核起始tRNA并不进行甲酰化；起始密码子的识别机制不同；起始tRNA与小亚基的结合先于mRNA；起始阶段不仅需要GTP，还需要ATP；起始因子种类与结构比原核生物要复杂得多；还没有证据表明肽酰转移酶活性由rRNA承担；释放因子有2种；对抑制剂的敏感性不同。真核生物的翻译的起始分为四个阶段：mRNA的准备和检查；Met-tRNAiMet与核糖体小亚基的结合；小亚基复合物与mRNA复合物结合后通过扫描发现起始密码子（一些病毒使用内部进入识别起始密码子）；大亚基的结合与起始因子的解离。真核生物的肽链延伸反应与原核生物相似，同样不断地经历进位、转肽和移位反应，只是由eEF-1代替了EF-Tu和EF-Ts，eEF-2代替了EF-G，转肽酶的活性似乎由核糖体蛋白提供。在真菌中，还需要第三种延伸因子eEF-3的参与。真核生物的肽链终止反应只有2个释放因子，其中eRF1识别所有的3种终止密码子。线粒体和叶绿体内发生的翻译更接近原核生物，但是它们也各有自己特有的性质。细胞有专门的质量控制机制处理异常的mRNA，以防止错误的翻译产物的在细胞内的堆积。原核细胞对丧失终止密码子的mRNA使用tmRNA进行抢救翻译，以释放出核糖体以及水解异常的多肽产物。真核细胞对于异常mRNA控制的机制有两种，一种是无义介导的mRNA降解，另一种无终止mRNA降解。细胞内的蛋白质在不断地合成或分解。在真核细胞中，主要存在两套蛋白质降解系统：一套是溶酶体系统，不依赖于ATP，另一套是蛋白酶体系统，依赖于ATP，还需要泛素，而降解的真正场所是在蛋白酶体。蛋白质的泛酰化有单泛酰化、多重单泛酰化和多聚泛酰化三种形式。通过泛素Lys48残基的多聚泛酰化参与蛋白酶体的降解，实际上，多泛素链的形成是将需要降解的蛋白质打上“死亡标签”，它似乎是靶蛋白进入蛋白酶体进行降解的先决条件。细菌既没有泛素，也缺乏与蛋白酶体相关的蛋白质，但也存在依赖于ATP的蛋白酶降解系统。第三十九章 多钛链折叠与翻译后加工细胞内刚翻译好的产物还需经历后加工、定向和分拣等过程，才能最终成为有功能的蛋白质。翻译后加工反应主要包括：多肽链的剪切、N端添加氨基酸、蛋白质的剪接、氨基酸的修饰、添加辅助因子和寡聚化。多肽链的剪切是在特殊的蛋白酶催化下进行的。通过剪切反应，许多蛋白质丢掉一些已经无用的氨基酸序列，如信号序列的切除，还有许多蛋白质只有去除一些氨基酸序列以后才有活性，如酶原的水解激活和激素原转变为激素等。某些蛋白质在翻译以后以多聚蛋白质的形式存在，或者与其他蛋白质融合在一起，需要通过剪切才能释放出来。N端添加氨基酸是在特定的氨酰tRNA：蛋白质转移酶的催化下进行的，添加氨基酸的场所并不在核糖体上。蛋白质剪接是指一条多肽链内部的内含肽序列被去除，两侧的外含肽序列重新被连接起来的翻译后加工方式。剪接反应经历一种分支蛋白中间体，是一种自催化反应。氨基酸的修饰包括对肽链N端或C端的修饰以及对各种氨基酸侧链的修饰。氨基酸修饰的主要形式有：磷酸化、糖基化、脂酰基化、异戊二烯化、羟基化、泛酰化、ADP-核糖体基化、甲基化、酰胺化、乙酰化、甲酰化、-羧基化、碘基化、焦谷氨酰化、硫酸化、GPI附着、腺苷酸化、小泛素相关修饰物修饰。多肽链的折叠有时也可视为后加工的一种方式。体内一个蛋白质的折叠总结起来有五点：正确折叠的信号包含在其一级结构之中；不同种类的蛋白质具有不同的折叠途径；体内绝大多数蛋白质的折叠需要分子伴侣的帮助；某些蛋白质折叠还需要肽酰脯氨酰顺反异构酶或蛋白质二硫键异构酶的帮助；非折叠蛋白会诱发内质网的过载反应。蛋白质在细胞内的定向和分拣可用信号学说进行解释。其主要内容是：各种蛋白质在细胞中的最终定位是由蛋白质本身所具有的特定氨基酸序列决定的。这些特殊的氨基酸序列起着一种信号的作用，称为信号序列。信号序列能够被细胞中的特殊成分识别，由此启动定向和分拣的过程。如果一个蛋白质缺乏任何一种信号序列，则会留在细胞液。整个定向和分拣的过程可分为三步：识别、移位和成熟。细胞内的蛋白质定向和分拣有两种途径，一种是共翻译途径，另一种是翻译后途径。细胞膜蛋白、内质网蛋白、分泌蛋白和溶酶体蛋白为共翻译定向，这些蛋白质的信号肽序列一般位于N端，富含疏水氨基酸残基。转位过程需要SRP。膜蛋白和可溶性蛋白的移位过程有所不同，其中前者还可能含有停止转移序列，其作用是阻止肽链的进一步移位而让肽链在信号序列被切除以后仍然锚定在膜上。由细胞核基因编码的定位于线粒体、质体、细胞核和过氧化物酶体的蛋白质基本上属于翻译后定向。某些蛋白质具有双重的定位信号（其中有一种定位信号比较隐蔽），这样的蛋白质可定位到不同的细胞器。进入线粒体的蛋白质信号序列位于N端。为了便于将来的跨膜转运，细胞质中的分子伴侣与蛋白质前体结合，以防止其提前折叠。分子伴侣在细胞液和细胞器分别执行不同的功能：在细胞液阻止蛋白质折叠，维持蛋白质处于一种细长的、容易跨膜的伸展状态，而在细胞器，却是促进蛋白质折叠成有功能的形式。蛋白质进入叶绿体的过程与蛋白质进入线粒体很相似，但也有不同：分拣和定位更加复杂；参与跨膜运输的通道与参与线粒体膜运输的蛋白质无同源性；输入到线粒体基质的蛋白质需要跨线粒体内膜的质子梯度。蛋白质定位于细胞核信号序列NLS位于多肽链的内部，主要由一些碱性氨基酸残基组成。核蛋白不是直接通过膜的转运，而是通过核孔复合物，以完全折叠的状态进入的。指导蛋白质进入过氧化物酶体的信号序列PTS一般位于肽链的C端，其一致序列为SKL，进入过氧化物酶体蛋白质在细胞液已完全折叠成有功能的形式。细菌也需要将它的某些蛋白质输送到外膜、内膜、外周腔或胞外的培养基上。这些需要被输送出细胞质的蛋白质在N端也含有特殊的信号序列。在原核细胞里也发现了SRP，也发现分子伴侣结合需要转运的蛋白质。第四十章 再次程序化的遗传解码和翻译暂停某些蛋白质在翻译的过程中，当核糖体前进到mRNA的某些区段的时候，以一些特殊的方式进行解码，这些特殊方式的解码被称为再次程序化的遗传解码。再次程序化的遗传解码包括：翻译水平的移码、通读、跳跃翻译以及含硒半胱氨酸和吡咯赖氨酸的参入。翻译水平的移码是指核糖体在进行移位反应的时候，一次移动的核苷酸数目不是3个，而是2个或者4个，改变了原来模板上的阅读框架的现象。通常将移动2个和4个核苷酸的移码分别称为-1移码和+1移码。许多反转录病毒借助翻译水平的移码得到GAG-POL融合蛋白。大肠杆菌RF2只有通过在其第26个密码子UGA附近进行+1移码才能得到全长的有功能的蛋白质。移码的发生通常与移码位点所处的特定环境有关。在RF2的移码位点上游存在第二个SD序列能促进移码，RF2本身的浓度高低也影响到移码。鸟氨酸脱羧酶的抗酶是首例在真核生物中发现+1移码的蛋白质。通读是指翻译中以一个ORF内的终止密码子作为一个氨基酸的密码子来阅读，而得到一个加长的多肽链的过程。发现有这种现象的主要是在一些病毒的mRNA进行翻译的时候。跳跃翻译是指核糖体在翻译的过程中，跳过ORF中的一段核苷酸序列，再接着翻译它下游序列的现象。这段并不决定任何氨基酸序列的核苷酸序列被称为翻译水平的内含子。T4噬菌体的基因60蛋白和大肠杆菌色氨酸阻遏蛋白在翻译时分别跳跃了50 nt和55 nt，只有发生跳跃才能得到有功能的蛋白质。含硒半胱氨酸和吡咯赖氨酸的参入实际上都属于特殊形式的通读。Sec以UGA为密码子，Pyl以UAG为密码子。至于机体是如何将作为编码Sec或Pyl的终止密码子与正常的终止密码子区分开的，不仅与它们在mRNA上特殊的环境有关，而且还需要一些特殊的蛋白质因子的帮助。翻译的延伸并不一定以匀速进行，在mRNA编码区内可能存在一些“瓶颈”影响到延伸的速度。当核糖体遇到这些“瓶颈”的时候，翻译可能不得不暂停。在编码区内发生的翻译暂停对于新生多肽链的正确折叠十分重要。第四十一章 原核生物的基因表达调控原核生物基因的表达调控可以在DNA水平、转录水平和翻译水平上进行，但最重要的控制环节是转录水平，尤其是对转录的起始阶段的调控。在DNA水平上控制基因表达的主要手段有：启动子序列和DNA重排。启动子序列是调控持家基因的唯一方式：一个基因的启动子的序列与启动子的一致序列越接近，则表达频率就越高，反之，则表达频率就越低。DNA重排可以改变一个基因与其控制元件之间的关系，也可以缩短基因之间或基因片段之间的距离，从而实现对某些基因的表达调控。在转录水平上调节基因的手段有操纵子、弱化子和抗终止作用。大肠杆菌的乳糖操纵子模型第一个被阐明的原核基因表达调控系统，大多数原核生物的基因表达调控都使用这种方式。操纵子模型认为：一些功能相关的结构基因成簇存在，构成多顺反子，其基因表达作为一个整体受到同一种控制元件的调节。控制元件由启动子、操纵基因和调节基因组成。调节基因编码调节蛋白，与操纵基因结合而调节结构基因的表达。如果调节基因编码的蛋白质与操纵基因的结合是阻遏基因的表达，则为负调控，相应的调节蛋白为阻遏蛋白；如果调节基因编码的蛋白质与操纵基因的结合是激活基因的表达，则为正调控，相应的调节蛋白为激活蛋白。乳糖操纵子除受到阻遏蛋白的负调控以外，还受到CRP的正调控。CRP必须与cAMP结合以后才有活性。乳糖操纵子之所以要受到双重调控，有两个原因：一是使细胞能够优先利用葡萄糖；第二个原因是lac启动子序列是一个弱启动子，需要CRP-cAMP的激活。阿拉伯糖操纵子编码3个与阿拉伯糖代谢有关的酶。阿拉伯糖操纵子的调节蛋白既是一种激活蛋白，又是一种阻遏蛋白。大肠杆菌Trp操纵子是一种阻遏型的操纵子，它控制5种参与Trp合成酶基因的表达。Trp作为辅阻遏物与阻遏蛋白结合而阻止Trp操纵子的表达。除了Trp操纵子是阻遏型以外，其他与合成代谢有关的操纵子也都属于阻遏型操纵子。白喉杆菌内的白喉毒素的基因表达调控是类似于大肠杆菌的Trp操纵子的阻遏型的负调控，作为辅阻遏物的是离子。原核细胞还能通过使用不同的因子来改变基因的表达。许多噬菌体合成自己的因子，以改变宿主细胞RNA聚合酶对启动子的特异性，从而选择性表达自己的基因。调节子是指不同的操纵子受同一种调节蛋白调节的网络结构，通过调节子可以协调一系列在空间上分离但功能上相关的操纵子的转录活动。大肠杆菌有3个重要的调节子：SOS调节子负责协调参与SOS修复有关的多个操纵子基因的表达，起协调作用的调节蛋白是LexA蛋白；与热休克反应有关的调节子；负责协调核苷酸代谢的调节子。改变基因转录的终止不仅可以调节一个终止子下游的基因是否表达，而且可以影响到一个转录物3- 端非翻译区的结构，从而能在转录后水平对基因表达实行调控。有两种调节转录终止的手段：一是弱化，此手段是通过调节特殊的终止子活性来进行的；另一种手段是抗终止，它通过修饰RNA聚合酶使之忽略终止子结构而导致转录发生“通读”。弱化子是一种更为精细的调节基因表达的模式，它建立在翻译和转录之间偶联的基础上，因此，为原核细胞所特有。弱化子一般存在于参与生物合成的操纵子之中，与操纵子一起，共同调节参与生物合成的酶基因的表达。弱化子的存在使得“逃过”阻遏这一关的不正常转录得到及时终止，这是对操纵子阻遏效应是一个很好的补充，而对那些无阻遏蛋白的操纵子来说，弱化子成为控制结构基因表达的唯一手段。枯草杆菌的Trp操纵子无前导链序列，但在有Trp的条件下，胞内的TRAP蛋白与Trp结合，结合Trp的TRAP与正在合成的RNA结合，迫使它形成终止子结构。某些蛋白质作为抗终止蛋白能够与RNA转录物的一段特殊的序列结合，从而阻止了终止子结构的形成。此外，某些特殊的空载tRNA可以和前导链mRNA配对，形成抗终止子使转录得以继续。在翻译水平的调控手段有反义RNA、RNA开关、翻译控制、自体调控、mRNA的二级结构、mRNA的稳定性和严谨反应。反义RNA是指与特定目标RNA分子（通常是mRNA）因存在互补序列，而发生配对从而调节目标RNA功能的RNA分子。反义RNA对基因转录的调控主要在翻译水平上，少