胶原、明胶和胶原水解物的物理化学性能及护肤功能的研究.pdf

四川大学 硕士学位论文 胶原 明胶和胶原水解物的物理化学性能及护肤功能的研究 姓名 张忠楷 申请学位级别 硕士 专业 皮革化学与工程 指导教师 李国英 20060501 四川大学硕士学位论文 y9 9 3 7 7 9 胶原 明胶和胶原水解物的物理化学性能 及护肤功能的研究 皮革化学与工程专业 研究生张忠楷指导教师李国荚 用不同制备工艺从牛皮中制备胶原 明胶和胶原水解物 十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳方法确定三种样品的相对分子质量及其分布 结果表明 胶原的相对分子质量大约为3 0 万 分布很窄 明胶的相对分子质量小于3 0 万 分布很宽 胶原水解物相对分子质量从几千到5 万 分布也很宽 利用压t a 电 位滴定胶原 明胶和胶原水解物的等电点分别为8 2 6 4 8 8 4 5 4 圆二色谱分 析表明胶原在2 2 1 n m 和1 9 2 岫处分别有一个特征的正吸收峰和负吸收峰 即 典型的胶原三股螺旋结构 而明胶和胶原水解物的正吸收峰消失 表现为典型 的无规卷曲构象 粘度法测定的胶原变性温度为3 7 5 而明胶和胶原水解物 在测定过程中无明显的螺旋 无规卷曲变化过程 胶原在生理条件下能够自发聚 集成纤维 而明胶和胶原水解物丧失纤维再生能力 并且胶原比明胶和水解胶 原更耐胰蛋白酶水解 此外 胶原膜在扫描电子显微镜下呈现出纤维结构 其 抗张强度 5 8 N m m 2 大于明胶膜 3 6N m m 2 因此 从牛皮中制备高价值 的特有性能的胶原在生物材料 功能添加剂 日用化学品和制药等领域有着许 多潜在应用 为提高胃蛋白酶溶解胶原 P S c 在中性条件的溶解性 选择酸酐接枝改 性 得到的改性胶原 s P S c 基本物理化学性能发生了变化 胶原由改性前的 酸溶性胶原变成改性后水溶性胶原 等电点由在碱性范围变成酸性范围 s P S C 的相对粘度和特性粘数分别为P S C 的1 6 倍和1 8 倍 氨基酸分析表明P S C 和 s P S C 的氨基酸组成基本保持不变 只是 改性使S P S C 的赖氨酸含量细微减少 而缬氨酸含量增加 S D S P A G E 电泳表明s P S c 的亚基 B a l 和睨 与P s c 相似 只是电泳迁移小于P S C 这很可能与s P S C 的相对分子质量以及分子结 C 一 f p 四川大学硕士学位论文 构变化有关 圆二色谱分析表明改性细微降低了S P S C 的三股螺旋构象 粘度 法测定的P S C 和S P S C 变性温度分别为3 8 4 和3 4 7 P S C 和S P S C 冻干海 绵S E M 形貌有所不同 由改性前规则的蜂窝状均匀的多孔结构变成改性后长 条状的多孔结构 此外 从P S C 和S P S C 再生纤维的S E M 形貌可以看出P S C 再生纤维分布随机 均匀 而S P S C 再生纤维有一定的取向且分布不均匀 总 之 化学改性达到在不破坏胶原结构的条件下拓宽了胶原应用范围的目的 研究胶原 明胶和胶原水解物的基本性能以考查它们的护肤功能 采用鸟 氏粘度计测定胶原 明胶和胶原水解物的相对粘度和特性牯数 结果表明在相 同质量浓度下胶原的相对粘度是明胶或胶原水解物的5 倍左右 其特性粘数也 明显大于明胶和胶原水解物 用三硝基苯磺酸法测定样品的伯氨基含量 结果 表明胶原的伯氨基含量最少 其次是明胶 胶原水解物最多 吸湿实验的测定 结果表明胶原的吸湿性强于明胶和胶原水解物 通过荧光显微镜观察荧光标记 三种样品在大白鼠皮肤表层的分布和渗透情况 结果表明胶原 明胶和胶原水 解物都能渗透至毛囊中 但只有胶原仍均匀分布于皮肤表面 显示其优良的保 湿功能 角质形成细胞培养实验表明只有胶原能明显促进细胞的生长和繁殖 而在明胶和胶原水解物上培养的角质形成细胞的生长情况与参比样相似 因此 胶原比明胶和胶原水解物具有更优良的吸湿 保湿性能以及抗皮肤衰老功效 关键词 胶原明胶胶原水解物水溶性胶原物理化学性能 护肤功能 四川大学硕士学位论文 S t u d yo fp h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e sa n d s k i n c a r e f u n c t i o n so f c o l l a g e n g e l a t i na n d c o l l a g e nh y d r o l y s a t e L e a t h e rC h e m i s t r ya n d E n g i n e e r i n g P o s t g r a d u a t e Z h a n gZ h o n g k a iS u p e r v i s o r L iG u o y i n g C o l l a g e n g e l a t i na n dc o l l a g e nh y d r o l y s a t ew e r ep r e p a r e df r o mb o v i n es k i l L si n d i f f e r e n tp r e p a r a t i v ep r o c e s s e s S o d i u m d o d e c y ls u l p h a t e p o l y a c r y l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e s i s S D S P A G E a n a l y s i ss h o w e dt h a tt h em o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o n o fc o l l a g e nw a sv e r yn a l T o w a b o u t2 0 0a n d1 0 0k D af o r8a n dac h a i n s r e s p e c t i v e l y c o m p a r e dw i t ht h o s eo fg e l a t i n 1 e s st h a n3 0 0k D aa n dw i t hw i d e d i s t r i b u t i o n a n dc o l l a g e nh y d r o l y s a t e 1 e s st h a n5 0k D aa n dw i t hw i d ed i s t r i b u t i o n T h ei s o e l e c t r i cp o i n t so fc o l l a g e n g e l a t i na n dc o l l a g e nh y d r o l y s a t ew e r e8 2 6 4 8 8 a n d4 5 4r e s p e c t i v e l y d e t e r m i n e db yZ e t ap o t e n t i a lt i t r a t i o n C i r c u l a rd i c h r o i s m c D s p e c t r ar e v e a l e dt h a tt h e r eW e l ap o s i t i v ep c a J a r o u n d2 2 1 眦a n d an e g a t i v ep e a k a r o u n d1 9 2n mf o rc o l l a g e n w h i c hw e r et h ec h a 功c t e r i s 石c so fc o l l a g e nt r i p l eh e l i x H o w e v e r g e l a t i na n dc o l l a g e nh y d r o l y s a t ed i dn o th a v ep o s i t i v ep e a k sa r o u n d2 2 0 n m s u g g e s t i n gr a n d o mc o i l s T h ed e n a t u r a t i o nt e m p e r a t eo fc o l l a g e nW a sa b o u t 3 7 5 d e t e r m i n e db yv i s c o s i t ym e t h o d w h e r e a st h e r eW e r en oh e l i x c o i lt r a n s i t i o n s f o rg e l a t i na n dc o l l a g e nh y d r o l y s a t ei nt h eh e a t i n gp r o c e s s e s C o l l a g e nr e a g g r e g a t e d t of i b r i l su n d e rp h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n s I nc o n t r a s t g e l a t i na n d c o l l a g e n h y d r o l y s a t el o s tt h ea b i l i t yo ff i b r i lf o r m a t i o n C o l l a g e nw a sm o l er e s i s t a n tt o U r p s i nh y d r o l y s i sc o m p a r e dw i t hg e l a t i na n dc o l l a g e nh y d r o l y s a t e I na d d i t i o n c o l l a g e nm e m b r a n e 5 8 N m m Z h a dh i g h e re x t e n s i o ns t r e n g t ht h a ng e l a t i nm e m b r a n e 3 6 N r a m z a n dp r e s e n t e dr e m a r k a b l ef i b r i ls h a p ea so b s e r v e db ys c a n n i n ge l e c t r o n m i c r o s c o p e S E M T h e r e f o r e c o l l a g e ni s o l a t e df r o mb o v i n es k i n 8c a nb eah J i g h 四川大学硕士学位论文 v a l u ep r o d u c td u et oi t ss p e c i a lc h a r a c t e r i s t i c sa n dh a sm a n yp o t e n t i a la p p l i c a t i o n si n b i o m a t e r i a l s f u n c t i o n a la d d i t i v e s c o s m e t i c sa n dp h a r m a c e u t i e a li n d u s t r i e si nt h e f u t a r e P e p s i n s o l u b i l i z e dc o l l a g e nO s c W a sc h e m i c a l l ym o d i f i e di no r d e rt oi m p r o v et h e s o l u b i l i t yo fP S Co v e raw i d er a n g eo fp H T h e r ew o r eg r e a tc h a n g e si nt h e p h y s i c o e h e m i c a lp r o p e r t i e so fS P S Ca f t e rc h e m i c a lm o d i f i c a t i o no fP Sc s u c ha s b e t t e rs o l u b i l i t yi nn e u t r a ls o l u t i o n l o w e ra c i d i ci s o e l e c t r i ep o i n t a n dh i g h e r v i s c o s i t i e s T h er e l a t i v ev i s c o s i t ya n di n t r i n s i cv i s c o s i t yo fS P S Cw e 1 6 一f o l da n d 1 8 一f o l dh i g h e rt h a nt h o s eo fP S C r e s p e c t i v e l y T h ea m i n oa c i dp r o f i l er e m a i n e d u n c h a n g e dw i t ht h ee x c e p t i o no fas l i g h td e c r e a s ei nl y s i n ea n da ni n c r e a s ei nv a l i n e i nS P S C S D S P A G Ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ec o m p o s i t i o no fs u b u n i t s p 1 1 1a n dq 0 o fS P S Cw a ss i m i l a rt ot h a to fP S C w h e r e a st h em i g r a t i o no ft h es u b u n i t so fS P S C w a gs l o w e rt h a nt h a to fP S C p r o b a b l yd u et ot h eg r a f t e dr e a g e n ti n t r o d u c t i o na n d t h ec h a n g eo fm o l e c u l a rs t r u c t u r e C h e m i c a lm o d i f i c a t i o no n l ys l i g h t l ya l t e r e dt h e t r i p l e h e l i c a lc o n f o r m a t i o no fc o l l a g e n I na d d i t i o n t h ed e n a t u r a t i o nt e m p e r a t u r e so f P S Ca n dS P S C d e t e r m i n e db yv i s c o s i t y w e a e3 8 4 Ca n d3 4 7 r e s p e c t i v e l y F u r t h e r m o r e t h el y o p h i l i z e dS P S Ce x h i b i t e dl e s su n i f o r ma n dr e g u l a rp o r e st h a n t h a to fP S C d u et ot h er e p e l l e n c yo fn e g a t i v ec h a r g e si nS P S C M o r e o v e r t h e r e c o n s t i t u t e df i b r i I so fS P S Cw e r et h i n n e ra n do r i e n t e di no n ed i r e c t i o nt os o m e e x t e n t w h e r e a st h er e c o n s t i t u t e df i b r i l so fP S C 祈t hu n i f o r mn e t w o r kd i s t r i b u t i o n w e r e a r r a n g e dr a n d o m l yw i t h o u ta n y o r i e n t a t i o n I nc o n c l u s i o n c h e m i c a l m o d i f i c a t i o nu n d e rc e r t a i nc o n d i t i o n sk e p tt h es t r u c t u r eo fP S Ca n da c h i e v e dt h e a i mo fe x t e n d i n gc o l l a g e na p p l i c a t i o nf i e l d s T h eb a s i cp r o p e r t i e so fc o l l a g e n g e l a t i na n dc o l l a g e nh y d r o l y s a t ew e r ei n v e s t i g a t e d i nc o n s i d e r a t i o no ft h e i rs k i n c a r ef u n c t i o n s T h er e l a t i v ev i s c o s i t ya n di n t r i n s i c v i s c o s i t yo fc o l l a g e n m e a s u r e db yU b b e l o h d ev i s e o s i m e t e r w e r ef o u n dt o b e r e m a r k a b l yh i g h e rt h a nt h o s eo fg e l a t i na n dc o l l a g e nh y d r o l y s a t e T h ec o n t e n t so f p r i m a r ya m i n og r o u p si nt h es a m p l e s d e t e r m i n e db yt r i r d t r o b e n z e o s u l p h o l i ca c i d 四川大学硕七学位论文 T N B S m e t h o d w e I ei nt h eo r d e ro fc o l l a g e nh y d r o l y s a t e g e l a t i n c o l l a g e n M o i s t u r ea b s o r p t i o ne x p e r i m e n t sm d i c a t e dt h a tc o l l a g e nh a dag r e a t e rm o i s t u r e a b s o r p t i o nc a p a c i t y c o m p a r e dt og e l a t i na n dc o l l a g e nh y d r o l y s a t e T h ep e n e t r a t i o n a n dd i s t r i b u t i o no fT R l T C l a b e l e dc o l l a g e n g e l a t i na n dc o l l a g e nh y d r o l y s a t eo nt h e s u r f a c eo fh a i r c u t 伯ts k i nw e r eo b s e r v e db yf l u o r e s c e n tp h o t o m i c r o g r a p h y T h e r e s u l t ss h o w e dt h a ta l lt h es a m p l e sc o u l dp e n e t r a t ei n t oh a i rf o l l i c l e s H o w e v e r o n l y c o l l a g e na p p e a r e du n i f o r m l yo nt h es k i ns u r f a c e i l l u s t r a t i n gg o o dp r o p e r t y o f m o i s t u r er e t e n t i o n F u r t h e r m o r e k e r a t i n o e y t ec u l t u r ee x p e r i m e n t sd e m o n s t r a t e dt h a t o n l yc o l l a g e nc o n s i d e r a b l yp r o m o t e da u a c h m e u ta n dp r o l i f e r a t i o no fc e l l s a n dt h e g r o w t hs i t u a t i o no fc e l l sc u l t u r e do ng e l a t i na n dc o l l a g e nh y d r o l y s a t ew a ss i m i l a r t o t h a to fc o n t r o lt r i a l T h e r e f o r e i tC a nb ec o n c l u d e dt h a t i nc o m p a r i s o nw i t hg e l a t i n a n dc o l l a g e nh y d r o l y s a t e c o l l a g e nh a sb e t t e rm o i s t u r er e t e n t i o np r o p e r t ya n d p o s s e s s e sb i o l o g i c a la c t i v i t yo fp r o t e c t i n ga g a i n s ta g i n go f s k i n c o l l a g e n g e l a t i n c o l l a g e nh y d r o l y s a t e w a t e r s o l u b l ec o l l a g e n p h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e s s k i n c a r ef u n c t i o n s 四川大学硕士学位论文 1 前言 1 1 胶原 明胶和胶原水解物的结构区别 胶原 明胶和胶原水解物可从动物的皮 骨 肌腱等组织中提取制备 因 而它们在氨基酸组成和某些性能上具有相似的地方 但在二级及高级结构和生 物性能上却有很大的区别u l 胶原是构成动物机体的重要功能物质 遍布动物体内的各处器官 并对各 器官的正常生理功能的调节起着举足轻重的作用 某些疾病与胶原发生的病变 有着内在的联系1 2 到目前为止 已分离出至少1 8 种胶原 如表1 1 所示 胶原 由三条a 多肽链组成 每一条a 链自身为左手螺旋构型 3 条a 链又相互缠绕在一 起形成右手超螺旋结构 在胶原的O r 链中 螺旋区肽段一般呈 G l y X Y 周期 性排列 x 和Y 常为P r o 或H y p 在螺旋区的两端 还有两个非螺旋的端肽 即 c 端肽和N 端肽 在这两个区段中极性氨基酸含量明显高于螺旋区段 且脯氨 酸含量很低 肽链构象呈比较松散的折叠构象 I 型胶原分子含有3 条a 多肤链 组成可表示为陋l 彻2 每条链含有 1 0 0 0 多个氨基酸 不同的脊椎动物I 型胶原a 链的氨基酸序列结构只有微小的 差别 O r l D 和a 2 0 是不同的基因产物 通过氨基酸序列和e D N A 序列可确定它 们长度略多于1 0 0 0 个氨基酸 甘氨酸分别占 1 和a 2 0 g 氨基酸总量的1 3 即 G l y X Y 周期性排列 其中x 和Y 是可变的 脯氨酸和羟脯氨酸所占的 比例很高 氨基酸连接次序即蛋白质的一级结构决定了蛋白质的构象方式 无 规卷曲 a 螺旋 B 折叠 B 转角等 胶原 G l y X Y 周期性排列一级结构是 其特有三股螺旋构象的基础 因为单股螺旋每圈是3 3 个残基 而三股的超螺 旋每圈每股是l O 个三联体 所以每第三个G 就必然靠近超螺旋的中心轴 且 在轴上没有侧链出现 也即侧链有最小的基团 一个H 原子 的甘氨酸能够满 足这种结构 从而得到致密的有氢键键合的稳定结构 而羟脯氨酸的羟基 经 脯氨酸羟化酶的羟基化作用后形成 对于氢键的形成以及三股螺旋结构的稳定 都是必不可少的 此外 I 型胶原的螺旋和非螺旋结构区还含有赖氨酸和羟赖 氨酸 与羟脯氨酸的形成类似 羟赖氨酸是在内质网内通过赖氨酸羟化酶的羟 基化作用形成的 脯氨酸羟化酶和赖氨酸羟化酶都需要分子氧 抗坏血酸 维 生素c 舡酮戊二酸和矽作为催化剂的辅助因子 赖氨酸和羟赖氨酸残基 可以链间共价交联 有利于胶原分子三股螺旋结构的稳定 同时羟赖氨酸的形 四川大学硕士学位论文 成有利于糖组份的吸附 可以发生半乳糖化或葡萄糖半乳糖化刚 表1 1 各类型胶原在动物体内组织的分布 F i g 1 1D i s t r i b u t i o no fv a r i o u sc o l l a g e n si na n i m a l 哩塑堕 胶原类型 组织分布 I 型 n 型 型 型 V 型 型 型 型 皮肤 骨 角膜 肌腱 肿瘤 软骨 玻璃体 皮肤 子宫壁 血管壁 基底膜 胎盘 皮肤 胎盘 羊膜 子宫壁 皮肤 角膜 羊膜 皮肤 内皮细膜 过程中 和性能 厂 7 四川大学硕士学位论文 4 机械强度降低 5 用发酵可以增大胶原的消化性 在向明胶转变过程中 胶原规则的三股螺旋结构向无规卷曲转变 从而在 性能上发生了巨大的变化 易于溶解 不耐酶解 许多生物性能丧失 胶原水解物化学组分与氨基酸的组成与胶原和明胶无大的区别 但是相对 分子质量一般比明胶小 不存在胶原螺旋结构 极易溶于水 也没有明显的生 物活性 然而 目前人们对这三者的认识常常产生混淆 认为它们具有相同性能 甚至认为它们是同一种东西 1 2 胶原的生物学性能 6 随着胶原研究的不断深入 特别是近年来基因工程和克隆技术的飞跃发展 人们对胶原的形态结构 分布 物理性质以及生物生理功能有了更加深刻的了 解 胶原在医用生化材料 保健材料等方面 具有合成材料不可比拟的优越性 用各种不同方法精制得到的未变性胶原 其结构仍然保持其在动物体内时的天 然结构 因此 作为生物医用材料在人体内应用时 胶原被看作是生物体的一 个组成部分而不是外来物质 1 胶原的低抗原性 胶原的抗原性与其它蛋白质比较 要低得多 而且常被认为是没有抗原性 的蛋白质 胶原的抗原性主要是来自胶原分子链端的非螺旋区域 即c 末端肽 和N 末端肽 通过适当的处理方法去除胶原的端肽可获得非常低抗原性的胶原 因此 不同方法制备的胶原表现出的抗原性不同 2 可生物降解性 胶原的三股螺旋结构十分稳定 只有特定的酶 如 胶原酶 对它才有降 解作用 但是一旦胶原变性 三股螺旋结构瓦解 后 胶原就可被许多蛋白酶 水解 胶原酶对胶原作用很专一 胶原特定的位点被水解后 形成两个片断一 T C A 和T C B 长度分别为原来胶原的3 4 和1 4 胶原在生物体内发生分解 代谢时 因场所不同而分为细胞外和细胞内两条途径 胶原纤维受胶原蛋白酶 3 四J I I 大学硕士学位论文 弹性蛋白酶等中性蛋白酶作用而分解成小分子多肽 氨基酸后再进入血液循环 中 这个过程发生在细胞外 称为胶原的细胞外代谢途径 另一种为先经酶作 用将胶原分子打断成适当分子量大小的断片后由于细胞的吞噬作用而被细胞吸 食 在细胞内被分解成小分子多肽和氨基酸的过程 称为胶原的细胞内代谢途 径 3 胶原止血作用 胶原通过促使血小板的凝集形成血栓达到止血作用 血管壁的内皮层发生 损伤时 靠近损伤部位的血小板与内皮细胞下层的结缔组织接触 促使血小板 活化 聚集 形成血栓从而迅速凝血 这一过程纤维胶原是诱导血栓形成的主 要基质蛋白 即纤维胶原是触发血小板血栓形成的一个重要因素 4 胶原有利于细胞的存活和生长 在细胞培养中 多数细胞是贴壁依赖性的 使细胞生长 分化 生殖和代 谢 需要有一个结合位点 胶原是生物体中细胞外基质的主要成分 它能提供 这样的位点 例如 成纤维细胞在胶原上生长时 代谢和形态与其在体内十分 相似 胶原不仅能促进细胞的生殖分裂 而且对维持细胞的分裂机能也有效果 因此 胶原可以作为组织修复的支架材料 1 3 胶原 明胶和胶原水解物的应用 胶原保留特有的天然螺旋结构和性质 使得胶原有着广泛的用途 胶原纤 维是动物皮肤组织的主要纤维 具有特殊立体网状结构 生皮经过一系列的物 理和化学的处理 去除其它非胶原组分后 并通过鞣制提高其耐湿热稳定性和 机械强度 使其变成革 再通过整理工序赋予革特殊的性质和风格 从而成为 用途广泛的商品 胶原作为生物材料具有其它合成材料无法比拟的优良性甜 比如生物相容性 可生物降解性以及生物活性等 胶原经特殊处理后 可用于 烧伤和创伤治疗 美容 矫形 组织修复和创面止血等医药卫生领域 现已运 用于临床中的有用于烧伤 创伤治疗的胶原膜 用于美容矫形的胶原医用注射 剂 用于刨伤止血的胶原止血海绵等 胶原结构一定程度上决定了应用性能 例如 胶原止血海绵止血性能优于明胶海绵 8 1 作为澄清剂用的鱼胶原如果变 4 性则沉降能力明显降低 9 1 胶原作为一种皮肤结构蛋白质 在护肤品中起着滋 润 调理和保湿等作用 因此 胶原作为天然的生物资源 可以广泛应用于食 品 1 0 1 1 1 医刻1 2 1 组织工程 1 3 1 化妆品 1 4 1 等领域 在很多领域中 要将胶原制 备成可溶性胶原才能应用 其制备的方法一般可分为酸法 碱法 盐法 酶法 以及它们的结合法 明胶是胶原在高温作用下变性 解旋的产物 在食品 医药卫生 照相工 业等领域有重要的应用价值 明胶虽然是一种缺少色氨酸的 不完全蛋白质 但是优良物理性质使明胶广泛用作食品的胶凝剂 稳定剂 乳化剂 增稠剂 发泡剂 粘合剂 粘结剂 澄清剂等 消费量相当可观 在医药卫生方面 明 胶主要用于制作药物胶囊 药物载体 l 卯 常用于制备明胶的原料一般为动物的皮和骨 制备方法有热处理法 酸法 碱法 盐碱法 酶法等 1 仅用热水长时间抽提 使胶原转化为明胶的方法称为热处理法 2 通过浸酸使胶原水解而制取明胶的方法称为酸法 3 用石灰悬浮液 氢氧化钠溶液等预处理含有胶原原料生产明胶的方法 称为碱法 4 用硫酸钠和氢氧化钠的混合液代替石灰乳液浸渍原料而生产明胶的方 法称为盐碱法 5 用酶处理使胶原溶解并经热变性而成为明胶的方法称为酶法 美国药典把酸法明胶归类为A 型明胶 碱法明胶归类为B 型明胶 A 型明胶 在酸性溶液中较稳定 含氮量为1 8 1 8 6 等电点为7 5 9 B 型明胶在碱性 溶液中较稳定 含氮量为1 8 以下 等电点为5 左右 胶原水解物是胶原变性后进一步经过酶 化学试剂水解后的产物 相对分 子质量更小 并且具有更易降解和吸收的特点 所以广泛用作营养保健品和日 用化学品添加剂 l 8 胶原水解物可用于生物发酵培养基 也可以作为一种高 蛋白饲料营养添加剂替代进口鱼粉用于混 配合饲料生产 1 4 胶原作为生物材料的缺点及解决方法 胶原作为一种重要的生物材料具有其它合成材料无可比拟的安全性 应用 空间十分广阔 但是 胶原作为生物材料也存在不足的方面 比如在体内降解 四川大学硕士学位论文 过快 机械强度较低 1 9 2 0 1 在组织内易钙化n 2 1 1 酸溶胶原随着p H 值的升高 胶原的溶解性会降低 甚至沉淀析出 因此 选择适当的方法改性胶原 可以 克服其应用局限性 扩展胶原的应用空间 化学改性方法是一种有效的方法 针对胶原活性基团的性质 常见化学改性方法如下 四川大学硕士学位论文 2 胶原 明胶和胶原水解物的制备及物理化学性能表征 2 1 试剂及仪器 2 1 1 化学试剂 名称规格 胃蛋白酶1 1 0 0 0 0 胰酶I 2 5 0 三硝基苯磺酸 T N B S 5 w v 牛血清白蛋白 生化试剂 考马斯亮3 埴 R 2 5 0 T H s 溴酚蓝 B I B 分析纯 B 巯基乙醇分析纯 十二烷基硫酸钠分析纯 过硫酸铵 分析纯 丙烯酰胺 双丙烯酰胺 四甲基乙二胺分析纯 磷酸氢二钠 分析纯 磷酸二氢钠 分析纯 碳酸氢钠化学纯 乙二胺四乙酸二钠分析纯 氯化钠 分析纯 五水硫酸铜 分析纯 碘化钾分析纯 乙酸 分析纯 酒石酸钾钠 分析纯 氢氧化钠 分析纯 盐酸 分析纯 对二甲氨基苯甲醛化学纯 氯氨T分析纯 7 产地 S i g m a P 7 0 0 0 A m i e s c o4 5 8 S I 枞P 2 2 9 7 北京元亨圣马生物技术研究所 上海伯奥生物科技有限公司 A m r e s c o4 9 7 上海试剂三厂 成都科龙化工试剂厂 成都科龙化工试剂厂 汕头市西陇化工厂 B I M O L5 0 0 7 3 B I O M O L 0 6 0 3 l 中国前进化学试剂厂 成都科龙化工试剂厂 成都科龙化工试剂厂 成都化学试剂厂 成都科龙化工试剂厂 成都科龙化工试剂厂 上海公私合营恒信化工厂 重庆化学试剂总厂 成都科龙化工试剂厂 重庆北碚化学试剂厂 成都科龙化工试剂厂 成都科龙化工试剂厂 天津傲然精细化工研究所 成都科龙化工试剂厂 四川大学硕士学位论文 规格 Q H Z 9 8 A G L 2 0 G B 一2 6 0 U V 7 5 l G D L a m b d a2 5 6L i t e rC a q c a d eF r e e z e D H G 9 0 7 0 A B H 2 R F L J S M 5 伽0 I Z e t a w e i g h tN a n o Z S J 5 0 0 C 2 0 P C M i I l i P R d I E A N3C e U A s s e m b l y 0 5 r a m 0 6 m m P H S 一3 C K Q 3 2 0 0 B R B 5 2 C S S H Z D T J 2 2 X W A 9 0 2 E A l l 0 4 A 8 产地 江苏省太仓市华美生化仪器厂 哈尔滨市东联电子技术开发有限 公司 上海安亭科学仪器厂 上海亚荣生化仪器厂 上海分析仪器总厂 P e r l d n E l m e r U S A L A B C O N C OC O R P O R A T I O N 上海一恒科技有限公司 O L Y M P U S 日本 J E O LJ a p a n i a l v e t l U K J a s c o J a p a n N E T Z S C H G e r m a n y 美国B I O R A D 公司 上海申立玻璃仪器有限公司 上海精密科学仪器有限公司 昆山市超声波仪器有限公司 上海亚荣生化仪器厂 浙江黄岩求精真空泵厂 广东恒联食品机械有限公司 上海青浦沪西仪器厂 上海振荣科学仪器有限公司 上海精天电子仪器有限公司 四川大学硕士学位论文 2 2 实验方法 2 2 1 原料皮预处理 天然I 型胶原是具有生物活性的纤维蛋白 主要分布在皮 肌腱 骨骼 大动脉 神经 肝脏 胎盘等组织 动物皮组织来源广泛 胶原含量高 因此 从皮中提取I 型胶原不会受到原料限制 实验选择新鲜牛皮经脱脂 脱毛处理 后作为胶原的原料 2 2 2 胶原的制备 胃蛋白酶水解方法得到胶原具有低抗原性 可生物降解等优点 其操作工 序如下 1 将预处理过的皮用绞肉机绞成米粒大小颗粒 2 酸性 低温条件下将皮酶解成可溶性胶原 3 用适量浓度的N a C l 盐析 透析纯化 用B e r g m a n 和L o x l e y 方法测定羟脯氨酸质量浓度 从而确定胶原的质量浓 度1 2 4 1 2 2 3 明胶和胶原水解物的制备 脱毛后的牛皮用3 4 石灰和0 5 N a O H 复灰两周 然后水洗 中和至 p H 值为5 5 6 0 从7 0 C 到9 0 4 C 以5 1 2 间隔提取明胶 产物1 0 0 0 0 X g 离心后 取上清液即为明胶 胶原水解物是由明胶用0 0 2 w v 胰蛋白酶在4 0 水解 4 h 然后在沸水浴中煮5 m i n 使得胰酶失活得到的 用B i u r e t 方法测定明胶和 胶原水解物的质量浓度伫5 l 2 2 4 冻千实验样品制备 透析处理后的胶原及明胶和胶原水解物用蒸发表面皿装取3 m m 高度 置 入冻干机冻干 样品冻干操作如下 1 将箱体温度降低至4 0 使得样品冻结实 2 打开真空泵抽真空 真空度0 1 3 3 m b a r 以下 3 保持低温高真空条件将样品冻干 4 缓慢升高温度至室温 关闭真空泵 9 四川大学硕士学位论文 溶液恒湿器中 以5 C m i n 升 2 2 1 1 成纤维性能 取胶原 明胶和胶原水解物溶液各1 0 m L 浓度均为0 5 m g m L 装入透析 袋中 在4 C 用p H 7 2 磷酸盐缓冲液透析2 4 h 后 用紫外分光光度计观测样 品在3 5 2 3 1 3 r i m 处吸光度随时间变化情况 得到它们的纤维形成曲线 将所 得到的胶原再生纤维样品在1 0 0 0 0 X g 离心 得到沉淀 经处理1 2 1 冻干后用 扫描电子显微镜观察再生纤维的形貌 2 2 1 2 样品抗胰酶水解性 将质量浓度为0 4 m g m 1 加 5 m g m L 的胶原样品在4 0 用p H 为7 2 磷酸 盐缓冲液透析7 2 h 明胶和胶原水解物溶液则直接用去离子水配制成质量浓度 为0 5 m g m L 的溶液 所有样品在3 0 用0 0 4 w v 胰酶 1 2 5 0 水解 每隔l h 取出一定量样品 加入1 w v S D S 溶液在沸水浴中煮5 m i n 以使胰 酶失活 通过T N B S 方法测定相应水解时间后样品的伯氨基含量 2 2 1 3 成膜及其性能表征 分别将1 0 m L 浓度为5 m g m L 的胶原 明胶和胶原水解物溶液倒入培养皿 中 在室温下自然干燥 成膜 用扫描电子显微镜观察膜的形貌特征 并测定 膜的抗张强度和断裂伸长率 2 3 结果与讨论 2 3 1 相对粘度及特性粘数测定 粘度法测定得到比浓增比粘度 通过哈里斯外推方法得到样品的特性粘数 而特性粘数值的大小与样品的粘均分子量是相关的 对于同一类的样品来说 一般特性粘数越大 其粘均分子量也越大 胶原 明胶和胶原水解物的相对粘 度及特性粘数见表2 1 四川大学硕士学位论文 表2 1 样品的相对粘度和特性牯数 T a b 2 1R e l a t i v ev i s c o s i t i e sa n di n t r i n s i cv i s c o s i t i e so f s a m p l e s 质量浓度均为t m g m L 以水作为溶剂 从表2 1 看出胶原水解物和明胶的相对粘度相差很小 而胶原的相对枯度是 其它样品的5 倍左右 这与胶原的高相对分子质量及其特殊的结构是密切相关 的 特性粘数是高聚物的一个物理参数 当聚合物的化学组成 溶剂 温度确 定后 r I 值与聚合物的相对分子质量关系 可用M a r k H o u w i n k 方程表达 即 r l l K M 4 由于这些样品在溶液中所呈现出的形态未知 相对分子质量分布 又比较宽 因此特性粘数只能定性地反映出它们粘均分子量的大小 从表2 1 可以看出胶原的特性粘数最大 明胶次之 胶原水解物最小 因而 粘均分子 量从大到小顺序为胶原 明胶 胶原水解物 2 3 2 样品的等电点 等电点是蛋白质一个重要的参数 它与蛋白质侧链酸性和碱性氨基酸的残 基比例相关 明胶和胶原水解物是不同的相对分子质量的多肽混合物 因此 等电点是各种多肽的平均等电点 胶原 明胶和胶原水解物的Z e t a 电位与p H 值关系 见图2 1 茹 罱 2 k 胶原 e p 8 1 2 四川大学硕士学位论文 佰 主 o 霍 5 主 罱 5 O 拿 S 1 0 晨 茎6 品o 5 P H 4 目I 明胶 4 P H P H 5 4 咬原水解物 D H 图2 1 胶原 明胶和胶原水解物Z e t a 电位与p H 关系 F i g 2 1 R e l a t i o n o f t h e Z e t a p o t e n t i a l o f c e l l a g e n g e l a t i n a n dc o l l a g e nh y d r o i s a t e 耐血p H 胶原 明胶和胶原水解物的等电点分别为8 2 6 4 8 8 和4 5 4 胶原的等电 点在碱性范围是由于酸性的提取条件保持了胶原侧链氨基酸残基的完整性 在 强碱和高温的制备条件下明胶和胶原水解物的侧链酰胺残基被水解 从而产生 高密度的羧基残基 使得等电点在酸性范围 2 3 3S D S P A G E 凝胶电泳分析 S D S P A G E 系统由于加入一定量的阴离子表面活性剂 S D S 和强还原剂 D 巯基乙醇 后 蛋白质样品与S D S 充分结合形成带负电荷的复合物 蛋白 质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基的相对分子质量的大小 而电荷因素可以 忽略不计 从图2 2 所示的电泳分析图谱可以看出 胶原的相对分子质量最大 电泳图有3 条泳带 在1 0 0 k D a 附近出现的2 条泳带分别是胶原分子的c t l 链和0 c 2 链 在2 0 0 k D a 附近出现的1 条泳带是胶原分子的B 链 即胶原的每条多肽链相 对分子质量为l O 万 3 条多肽链构成一个胶原分子 因此 胶原分子相对分子质 四川大学硕士学位论文 量为3 0 万 明胶的电泳分离带为一个连续带 相对分子质量分布在小于3 0 万l 胶原水解物也是一个连续分离带 但其相对分子质量比明胶小 主要分布在几 千到5 万左右 四川大学硕士学位论文 2 3 4 三股螺旋构象及螺旋一无规卷曲转变 胶原是一类光学活性蛋白质 采取类聚脯氨酸 I I 型的螺旋构象 2 8 1 其圆二 色谱特征是在1 9 0 n m 左右有一个负吸收峰 在2 1 0 n m 一2 3 0 n m 范围内