定稿 紫红素-18.doc

泸州医学院2008届药学学士论文紫红素-18的分离提纯陈真林（药学院2008级3班 学号：200807010331 邮编：646000）指导教师：李东红（第三军医大学附属医院大坪医院 邮编400012）【摘要】目的：1确立以糊状叶绿素为原料制备紫红素-18的方法，探究在酸解时不同PH值对紫红素-18产率的影响，为紫红素-18的进一步化学修饰提供足够的原料。2探究不同展开剂对紫红素-18的分离效果的差别。方法：用Hynninen选择性酸法水解对糊状叶绿素进行粗提，调节粗提取溶液的PH值得到三组蚕沙粗提物（脱镁叶绿酸a），再经过氧化反应得到紫红素-18粗品，经硅胶柱层析分离纯化得到紫红素-18。 结果:紫红素-18初分产品对蚕沙的收率为1.43%细分紫红素的纯度达到98%。结论：紫红素-18的分离提纯的方法简单，操作性强，得到产物的纯度高，对于它们进一步结构修饰有重要意义。关键字：蚕沙、脱镁叶绿酸、紫红素-18、分离提纯ABSTRACT ：OBJECTIVE: To search for satisfactory preparation and purification conditions of purpurin 18 from silkworm excrement, and to offer enough reactants for the further modification of purpurin 18. METHODS: At first, Pheophorbide a was extracted from the pasty Chlorophyll a by the method of Hynninen acid hydrolization, and the crude propheophoride a was gotten by stirring pheophorbide a in concentrated hydrochloric acid. And then the crude purpurin 18 was obtained by oxidation of pheophorbide a. The crude products were purified by silica gel column chromatography to offer pure propheophoride a and purpurin 18. RESULTS： The yield of pururin 18 is 1.43% and its purity was 98%. CONCLUSION：It is a successful method by which pururin 18 from silkworm excrement is purified.The method is simple,flexible and operable. Further modification of Pyropheophorbide as structure seems to be of importance as well.KEY WORD：肿瘤光动力疗法（photodynamictherapy,PDT）是利用光敏剂和光的光动力学反应治疗肿瘤的一种无创或微创疗法。PDT作为一种冷化学反应，作用效果与所用光敏剂类型、照射条件、组织氧代谢状态，细胞类型有关。其治疗基础为先给予对肿瘤组织有选择性摄入作用的光敏剂，然后用一定波长的光辐照瘤区，诱发光敏剂产生光动力反应，导致肿瘤组织坏死而达到治疗目的。PDT因能相对选择性地杀伤肿瘤细胞，对健康组织损伤小，并发症及毒副作用少从而成为一项非常有效治疗肿瘤的的方法。迄今，肿瘤光动力疗法（PDT）现在已经发展成为肿瘤的法定疗法之一。光敏剂的性质直接决定了肿瘤光动力疗法的治疗效果。现在国内外临床应用的光敏剂如血卟啉衍生物（HPD）、癌光啉（PSD-007）等均为复杂的多组分卟啉混合物【1】，且作用光谱不理想【2】。且在吸收波长为600800um的治疗窗内吸收系数小而影响到组织的有效光动力反应深度，此外，他们的化学组成不定，有效成分尚未完全阐明而影响其深入的光生物学机理研究和难以发展成为单体法定新药，因此我们不断尝试研究新型的光敏剂。叶绿素降解产物（如脱镁叶绿酸【3】及紫红素-18【4】）及其衍生物，由于其较高的肿瘤选择性摄入及较强的光敏化氧化特性，（根据文献报道：叶绿素降解产物及其衍生物在红光区的吸收系数较现在广泛应用于肿瘤光动力疗法的混合卟啉制剂约高一个数量级），从而极大地增高了光动力损伤深度，成为光动力治疗癌症新药发展中颇受关注的研究对象，现在已经被用于肿瘤的荧光定位和光敏治疗【5】。蚕沙（家蚕粪）是蚕业的主要副产物之一，其中，叶绿素含量占蚕粪干物的1%左右，是一种丰富廉价的叶绿素资源，而蚕沙中占叶绿素总量75%以上是叶绿素a。本实验以家蚕粪叶绿素粗提物（蚕沙粗品叶绿素）为原料，经酸降解反应得到叶绿素a的降解产物脱镁叶绿酸a，.对脱镁叶绿酸a进一步氧化碱降解得到紫红素-18粗品。 脱镁叶绿酸a 紫红素-18 1 材料与仪器1.1 实验仪器 高压液相色谱仪（美国，Agilent 1200 Series）、DU800型紫外可见分光光度计（美国Beckman公司），Varian 640-IR红外光谱仪（美国），YP-2压片机（上海山岳科学仪器有限公司），CCA-20低温冷却水循环泵（巩义市予华仪器有限责任公司），旋转蒸发仪RE-5299（巩义市予华仪器有限责任公司），循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司），521-I恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司)，DZF-6050型真空干燥箱、电子天平、玻璃柱子、电子秤、氧气袋、1.2 实验试剂 氯仿、乙醚、浓盐酸、THF、正丙醇、甲醇、丙酮、甲酸、三氟乙酸、乙氰等均为分析纯，氢氧化钠浓溶液（10 mol/l）,氢氧化钾(固体)，稀盐酸，氧气，蒸馏水。1.3 实验材料蚕沙 （海宁凤鸣叶绿素有限公司 检验批号 20100209）硅胶 （安徽良臣硅源材料有限公司 批号 110423）2实验方法2.1紫红素-18的分离提纯2.1.1脱镁叶绿酸a粗品的提取 称取糊状叶绿素100 g于2000 ml烧杯中，加入乙醚500 ml在冰浴下搅拌至完全溶解。再加入浓盐酸500 ml，在冰浴中搅拌约10 min，转入分液漏斗，加入冰水300 ml，摇匀，静置25 min，由于分层不明显根据加入水和酸的总量接取下层溶液，用10 mol/l的氢氧化钠溶液调PH至5、6、7三组值，分别编号为A、B、C三组。有黑色沉淀出现，抽滤，减压干燥，分别收集。2.1.2紫红素-18粗提物提取 称取蚕沙提取物（脱镁叶绿酸a）粗品1.50 g于250 ml三颈瓶中，加入120 ml乙醚和40 ml的四氢呋喃（THF）,搅拌5 min，使其完全溶解，通入氧气，加入含有2.50 g KOH的正丙醇40 ml,搅拌反应2 h后停止，将混合液移入分液漏斗中，加入去离子水200 ml，摇匀，静置，待分层明显后接取下层溶液。用稀盐酸调PH至34左右有黑色颗粒出现，抽滤，减压干燥，收集备用。2.1.3紫红素-18的分离纯化 取200300目硅胶约300 ml，流动相为 氯仿：丙酮：甲醇 =400:30:40，称取紫红素粗品0.25 g用流动相溶解，过滤，滤液湿法上样，用以上流动相进行柱层析，分为三带，第一带为淡黄色，第二带为紫红色（稍带黑色），第三带为绿色。收集第二浓紫红色带，旋转蒸干得纯紫红素-18初分品，减压干燥，固体备用。2.2 HPLC定性分析及纯度检测 色谱条件Zorbax 300 Extend-C18色谱柱（250 4.6 mm，含保护柱）；洗针上样量30 ul，410 nm检测，0.5 s，柱温为25C,流动相(D)：含5%乙腈，0.1% THF的水,C：含0.1% THF的乙氰，0-100% 15 min梯度洗脱，流速为1 mL.min-1， 进样量为30 ml。3.实验结果31数据表如下：蚕沙蚕沙提取粗品紫红素粗品紫红素初分（百分含量）PH=5（A） 700 g16.72 g7.12 g2.38 g(88.8%)PH=6（B）700 g18.48 g9.75 g3.08 g(55.2%)PH=7 (C)700 g22.37 g13.18 g4.32 g(73.4%)3.2 HPLC检测结果紫红素-18粗品经一次硅胶柱分离后，HPLC检测得到了较纯的紫红素-18，其与对照品的谱图如下：紫红素-18对照品（纯度86%）A（PH=5） 紫红素-18（纯度88.8%）B（PH=6） 紫红素-18（纯度55.2%）C（PH=7） 紫红素-18（纯度73.4%）3.3 紫红素-18细分HPLC检测本组实验采用PH=7（C）的粗品进行细分（因为其绝对产率最大）。探究了三组不同的流动相， 第一组流动相为：氯仿：丙酮：甲醇=10:1:0.3第二组流动相为：氯仿：丙酮：甲醇=10:1:0.5第三组流动相为：氯仿：丙酮：甲醇=10:1:0.7紫红素-18粗分品紫红素-18细分品（纯度）第一组200 mg73.7 mg (98%)第二组200 mg73.8 mg (97.5%)第三组200 mg71.3 mg (93-95%)三组不同展开剂所得的高效液相色谱图如下： 第一组（纯度大于98%） 第二组（纯度97.5%） 第三组（纯度95.9%）3.4 紫红素-18的红外光谱IR（KBr）cm-1:3545(O-H), 2922(C-H), 1701(O-H) , 3545(C=O) , 1308(C-N), 992(-CH=), 1379(-COO)。3.5 紫红素-18的紫外光谱紫红素-18在405nm和696nm（可见红光区）出现两个特征吸收峰。在696nm处较强吸收表明紫红素-18对太阳光有很好的吸收截面，符合理想光敏剂要求。3.6 紫红素-18的核磁共振图谱3.7 紫红素-18的质谱图4.讨论 本实验是以蚕沙叶绿素a粗提物经酸降解制得的脱镁叶绿酸a粗品为原料，在氢氧化钾醇溶液的条件下通过氧化开环反应制得目标化合物紫红素-18。 脱镁叶绿酸的制备条件与焦脱镁叶绿酸相似，不同的是酸解反应时间缩短到十分钟（因为脱镁叶绿酸不稳定时间长于10 min 时极易生成焦脱镁叶绿酸），调节PH是关键，本次实验在第一步酸解时通过将PH调节到5、6、7三组不同值得出对比，由实验结果可得PH=7时产率最大，此时产物为分散的黑色固体，PH过低会使产物聚集溶液表面，呈粘稠状甚至果冻状不易抽干收集。影响紫红素合成产率的因素主要有两个。A.反应时间：控制好酸解时间（酸解时间稍长就会生成焦脱镁叶绿酸从而影响产物产率和后续的柱层析分离效果）；适当延长氧化反应时间（从1h增加到2h）有利于提高产率（使蚕沙提取物充分氧化）。 B. PH的调节: 实验发现在第一步酸解后PH调到7时产物产率最大，此时产物在溶液中呈黑色分散性颗粒，容易收集。随着PH降低，产物会漂浮在表面并呈油状，不易收集。最后紫红素的分离提纯，应注意流动相的极性，寻找分离效果最好的流动相。本实验尝试了三种不同比例的流动相，a. 氯仿：丙酮：甲醇=10：1:0.3 ,b.氯仿：丙酮：甲醇=10：1:0.5, c.氯仿：丙酮：甲醇=10：1:0.7,通过在混合流动相中减少甲醇的比例降低流动相的极性。在硅胶柱层析分离时，分为三带，第一带为浅黄色，第二浓色带（紫红色）为目标带，第三带为绿色带，当用c体系时，由于展开剂极性较大导致目标带与第三色带（副产物）有部分交叉，最后产物的纯度在93%-95%左右，而用a体系或者b体系时，由于流动相极性降低，第三色带在硅胶柱中移动减慢而对目标色带的移动基本没影响，增大了与目标色带的Rf值，使分离产物的纯度提高到98%，所以用a和b体系时的分离效果较好，又因为a和b体系分离效果相差较小但是a体系的极性较小导致柱层析时太慢会消耗更多的溶剂和时间，从经济适用出发本实验最终采用b体系。5结论本实验是以糊状叶绿素为原料，采用选择性酸水解和硅胶柱层析分离的方法，提取分离得到了脱镁叶绿酸a；并通过对脱镁叶绿素a进行氧化开环和硅胶柱层析分离得到了紫红素-18，。经HPLC检测，紫红素-18初分产品的纯度最好能达到88% 细分紫红素-18的纯度达到了98%。它们的成功分离纯化，为后续操作提供了物质基础，对研制新型的、有效的光敏剂，造福于人类具有一定的实际应用价值。参考文献1 Moan J.rphyrin pho to sensit izat and thera2pyJ.Pho tochem pho tobio 1,1986,43-68126902 Profio A E,Do iron DR T ranspo rt of light in tissue in pho todynam ic therapy J,Pho tochem Pho tobio 1,1987,46-591-5993 Takahasshi S, Sato S, Ito H et al. J Jpn Soc L aser M ed,1984;4(1):994 胡龙勤，许德余. 第二军医大学学报，1986；7（6）：4055 胡龙勤，许德余. 国外药学-合成药、生化药、制剂手册，1987；8（3）：146致谢：首先，衷心感谢我的论文指导老师李东红老师和实验室李鹏熙老师和郭林峰老师近四个月来对我的实验和论文所给予的指导。他们严谨的工作作风，乐观向上的工作态度，他们的谆谆教诲让我受益匪浅，并将继续激励我在学业上再接再厉，在工作中奋发向上。在此瑾想三