第十一章 遗传的分子基础.doc

第十一章 遗传的分子基础在以上几章中，已说明了基因在染色体上，也讨论了基因与性状之间的关系。现在将进一步说明基因的化学本质是什么，基因是怎样来控制性状的。第一节 遗传物质是DNA（或RNA）要了解基因的化学本质是什么，首先要考虑基因所在的染色体的化学成分。染色体的化学成分很复杂，由DNA，两类蛋白质：组蛋白（histones）和非组蛋白（non-histones），以及RNA构成。DNA和组蛋白的分量大致相等，两者结合在一起，构成染色体的大部分。非组蛋白的比率有变化，RNA含量很低（图111）。图111染色体的化学组成。括号内的数字表示各成分的相对分量。染色体的主要成分是DNA和组蛋白，虽然这两种成分都在基因功能上起着重要的作用，但多数证据证明，基因的主要特性由DNA决定，或者说遗传信息贮存在DNA中。DNA是遗传物质的间接证据 间接证据很多，主要有下列各点：（1） DNA通常只在核中的染色体上找到。也有某些例外，例如细胞质中的线粒体和叶绿体等有它们自己的 DNA，但这些结构能自体复制，有它们自己的遗传连续性。（2）同一种生物，不论年龄大小，不论身体的那一种组织，在一定条件下，每个细胞核的DNA含量基本上是相同的，而精子的DNA 含量正好是体细胞的一半（表11-1）。蛋白质等其它化学物质不符合这种情况。（3）同一种生物的各种细胞中，DNA在量上恒定，在质上也恒定；相反地，蛋白质在量上不恒定，在质上也不恒定。例如在某些鱼类中，它们的染色体的蛋白质一般都是组蛋白，且含有少量RNA，而在成熟精子中，组蛋白完全不见了，全都是精蛋白了，RNA的含量也测不出，可见蛋白质在质量上也不是恒定的，不符合遗传物质对稳定性的要求。（4）各类生物中，能改变DNA结构的化学物质都可引起突变。DNA是遗传物质的直接证据 如果DNA确是遗传物质，那末能不能把DNA和蛋白质分开，单独观察DNA的作用呢？这些实验已在微生物中做了。下面我们就以微生物为例，证明遗传物质确是DNA（或RNA）。（1）噬菌体的感染 噬菌体的分子组成比较简单。噬菌体T2约有60的蛋白质和40的DNA，蛋白质构成它的外壳，而DNA藏在它的头部中。当一个噬菌体感染大肠杆菌时，它的尾部吸附在菌体上。细菌被感染后，它不再繁殖，在菌体内形成大量的噬菌体，接着菌体裂解，几十个到几百个跟原来一样的噬菌体就释放出来。那末噬菌体感染细菌时，进入菌体的是蛋白质，还是DNA呢？也就是说，在噬菌体的生活史中，连接亲代和子代噬菌体的物质是什么呢？硫仅存在于T2的蛋白质组分中，因为构成蛋白质的氨基酸中，甲硫氨酸和半胱氨酸是含有硫的，而DNA中从未发现过；相反，磷主要存在于DNA组分中，至少占T2中磷含量的 99。所以Hershey和Chase（1952）用放射性同位素35S来标记蛋白质，32P来标记DNA。把宿主细菌培养在含有35S的培养基中，或培养在含有32P的培养基中。宿主细菌在生长过程中，就被35S标记上了，或被32P标记上了。两种放射性同位素不能放在同一培养基中，因为两种同位素同时存在时，不易把它们区分开来。然后标记了的细菌用T2噬菌体去感染。噬菌体在细菌细胞内增殖，裂解后，释放出很多子代噬菌体来。这些子代噬菌体被宿主菌的放射性同位素标记上了，或被标上35S，或被标上32P。实验的第二步，用标记了的噬菌体去感染未标记的细菌，然后测定宿主细胞的同位素标记。用35S标记的噬菌体感染时，宿主细胞内很少有同位素标记；而大多数的35S标记的噬菌体蛋白质附着在宿主细胞的外面在感染噬菌体的外壳中。用32P标记的噬菌体感染时，在蛋白质外壳中很少有放射性同位素，而大多数的放射性标记在宿主细胞内（图112）。所以在感染时进入细菌的主要是DNA，而大多数蛋白质在细菌的外面。这样看来，噬菌体注入细菌的物质是DNA，释放的是跟原来一样的噬菌体，可见在噬菌体的生活史中，只有DNA是连续物质，所以说 DNA是遗传物质。（2）烟草花叶病病毒的重建 对病毒的研究逐渐深入以后，发现好多病毒含有RNA和蛋白质，却没有DNA。应用RNA病毒进行病毒重建实验，证明在只有RNA，而不具有DNA的病毒中，RNA是遗传物质。这实验是用烟草花叶病病毒（tobacco mosaic virus，TMV）进行的（Fraenkel Conrat， 1956）。TMV是一种RNA病毒，它有一圆筒状的蛋白质外壳，由很多相同的蛋白质亚基组成；内中有一单链RNA分子，沿着内壁在蛋白质亚基间盘旋着（图113）。约含有6的 RNA和 94的蛋白质。那末在这种 RNA病毒中，遗传信息在RNA上，还是在蛋白质上呢？把TMV在水和苯酚中震荡，把病毒的RNA和蛋白质分开，分别去感染烟草。单是病毒的蛋白质，不能使烟草感染；单是病毒的RNA，可以使烟草感染，病毒RNA进入叶子细胞，进行繁殖，产生正常的病毒后裔。单是RNA的感染效率很差，可能因为RNA裸露，在感染过程中容易被酶所降解。用RNA酶处理RNA，就完全失去感染力。TMV有很多株系，它们可以根据寄主植物的不同和在寄主植物叶片上形成的病斑的差异来加以区别。例如有两株系，它们的外壳蛋白就不同： S株系（standard strain）的外壳蛋白不具有组氨酸和甲硫氨酸，而HR株系（Holmes Rib Grass strain）含有这两种氨基酸。FraenkelConrat利用分离而后聚合的方法，先取得S株系的蛋白质外壳和HR株系的RNA，然后把它们结合起来，形成杂种病毒（图114，5）。这些杂种病毒，有着S株系的外壳，可被抗S株系的抗体所失活，但不受对HR株系制备的抗体所影响。当杂种病毒用来感染烟草时，病斑总是跟RNA授体的病斑一样，从病斑分离的病毒可被对HR株系制备的抗体所失活。所以显而易见，第二代病毒颗粒具有HR株系的RNA和HR株系的蛋白质外壳。把HR株系的蛋白质和S株系的RNA结合起来，形成杂种病毒。把重建的病毒来感染烟草，也得到类似的结果。此外，小儿麻痹症病毒的RNA，脑炎病毒的RNA，都可单独地引起感染。所以我们可以这样说，在不含DNA，而只含有RNA的病毒中，复制和形成新病毒颗粒所必需的遗传信息是携带在RNA上。（3）肺炎球菌的转化DNA是遗传物质的证据主要来自肺炎球菌（Diplococcus pneumoniae，或简写为 pneumococcus）的实验。肺炎球菌能引起人的肺炎和小鼠的败血症（septicemia）。已知有很多不同菌株（strains），但只有光滑型（S）菌株能引起疾病。这些有毒菌株在每一细胞外面有多糖类的胶状荚膜，保护它们，使它们可以不被宿主的正常的防护机构所破坏；当生长在合成培养基上时，每一细菌长成一个明亮的光滑菌落。另外一些菌株没有荚膜，不引起病症，长成粗糙型（R）菌落。 Griffith（1928）发现，用热杀死的S型细菌和活的无毒的R型细菌注射到小鼠中，不仅很多小鼠因败血症而死亡，而且从它们的心脏血液中找到活的S型细菌（图116）。活的R型细菌，或死的S型细菌分别注射时，都不引起败血症。这说明，用热杀死的S型细菌把某些R型细菌转化为S型细菌，S型细菌有一种物质或转化因素（transformingprinciple）能够进入R型细菌，并引起稳定的遗传变异。Avery和他的同事经过10年工作，在离体条件下完成了转化过程，而不是在活体中。他们把DNA，蛋白质和荚膜物质从活的S型细菌中抽提出来，把每一成分跟活的R型细菌混和，悬浮在合成培养液中。他们发现，DNA组分，而且只有DNA组分，能够把某一R型细菌转变为S型。而且DNA的纯度越高，这种转化过程愈加有效。如果DNA用DNA酶（DNase）处理，使DNA分解，就不出现转化现象。其它的酶对抽提物的转化能力没有影响。所以从一种基因型的细胞来的DNA掺入到另一不同基因型的细胞中，可引起稳定的遗传变异；DNA赋有特定的遗传特性，是遗传物质。我们现在毫不迟疑地接受这个证据，认为DNA是遗传物质。但是在Avery等的实验刚发表的时候（1944），人们还是以怀疑的眼光看待这个实验的。虽然已证明，DNA酶破坏了转化作用，但仍有人争辩说，转化是DNA中蛋白质不纯物的结果，蛋白质才是有作用的因素。随后科学工作者继续纯化DNA，证明蛋白质不可能是转化因素。直到1949年，蛋白质杂质已降低到仅仅是0.02，得到的高度纯化的DNA不仅仍可引起转化，而且DNA纯度越高，转化频率也越高。以后转化试验在多种细菌和培养细胞中取得成功，也有报导在真核类生物，如果蝇、家蚕等取得成功的（表112）。这些转化实验看上去很像定向诱变，也就是用特定处理，诱发特定变异；其实这是由于转化时，供体DNA的一部分整合到受体细胞的DNA中的缘故。Fox-Allen（1964）在肺炎双球菌中， Bodmer-Ganesen（1964）在枯草杆菌中，用同位素标记供体DNA进行转化实验，都证明了这一点。这样，转化是一个直接证据，证明性状本身是不遗传的。在本实验中，多糖类是不遗传的；而遗传物质才是遗传的。这遗传物质现在已多方面证明是DNA（有时RNA）。以上几个实验告诉我们，在含DNA的生物中，DNA是遗传物质，在不含DNA而只含有RNA的病毒中，RNA是遗传物质第二节 DNA的分子结构与复制DNA是遗传物质，那么它的分子结构是怎样的，它能符合遗传物质的多样化的要求吗？它的复制方式是怎样的，它能符合遗传物质的恒定性的要求吗？两种核酸和它们的分布 DNA和RNA都是核酸（nucleicacids）。在说明DNA的结构和复制以前，先说明一下这两种核酸的化学组成和它们的分布。核酸是一种高分子化合物，它的单体是核苷酸（nucleotide）。每一核苷酸由三部分组成，一个磷酸分子，一个糖分子，一个碱基，碱基可以是嘌呤或嘧啶。两种核酸的化学成分的相同和差异见表113。高等动植物体内，绝大部分的DNA在细胞核内的染色体上，它是构成染色体的主要成分。有少量的DNA在细胞质中，它存在于叶绿体，线粒体等细胞器内。 RNA在细胞核和细胞质中都有，核内则更多地集合在核仁上，少量在染色体上。细菌也含有DNA和RNA。多数细菌病毒（噬菌体）只有DNA，植物病毒大多数是RNA，少数是DNA，动物病毒有些含有RNA，有些含有DNA。DNA的化学结构 DNA分子是核苷酸的多聚体。核苷酸是碱基跟脱氧核糖和磷酸连接起来构成的（图117）。因为碱基通常有4种，所以核苷酸也有4种，它们的名称是腺嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸。DNA分子就是这4种脱氧核苷酸的多聚体（图118），所以也叫做多核苷酸（polynucleotide）。核苷酸单体的联结通过磷酸残基。每一磷酸残基通过磷酸二酯键（phosphodiester bond）把一个脱氧核糖分子的3碳原子与下一个脱氧核糖的5碳原子相联结（图 11-8）。这一点很重要，因为这个不对称性，所以DNA分子有极性（polarity）。如果分子从碳原子在5位置的那一端开始，那末分子的另一端一定有一个碳原子在3位置。由于这种极性，如果一个核苷酸对其它的核苷酸的关系颠倒了，那么这个核苷酸就不能联结到延伸中的多核苷酸链（polynucleotide chain）上。DNA的模型 DNA分子的结构是Watson和Crick最初阐明的。他们从两个线索开始：（1）大量的结晶资料已经累积起来。用X线照射DNA分子，观察射线在照相底片上产生的点子，计算点子的分散角度。每一点子的分散角度代表DNA分子中的一个原子的位置或若干原子团（groups of atoms）的位置。这个技术极为复杂，计算点子的分散角度的程序也极为繁重。所得的数据表明，DNA分子是细长的，由两条链组成，互相平行。（2） Chargaff（19491951）研究不同生物的DNA，得到几个实验法则：（a）T+C量（嘧啶核苷酸总数）总是等于AG（嘌呤核苷酸总数）；（b）A量总是等于T量，C量总是等于G量，但 AT量不一定等于C+G量。Watson和Crick的DNA双螺旋模型就是根据这些线索推导出来的。这个模型的主要特点如下：第一，DNA分子是互相旋转的两条长链，成为一种双螺旋（double helix）形式（图11-10）。每一条链的主线代表交互存在的糖和磷酸，两条链的极性是相反的。就是说，一条链的原子顺序正好与另一条链的原子顺序相反，这两条链是反向平行的（antiparallel）。碱基的排列位置跟主线成直角，向DNA分子的中央突出。一条链上的碱基总是跟另一条链的同一水平上的碱基配对，每对碱基由弱氢键（weak hydrogen bond）联结起来。（图1111）。所有的碱基都是这样一对对地配对，所以DNA分子的双链是由碱基对（pairs of bases）的H键联结在一起的。腺嘌呤与胸腺嘧啶通过2个氢键配对，鸟嘌呤与胞嘧啶通过3个氢键配对。氢键比联结每一核苷酸的原子共价键弱得多，但已足够保证AT以及GC配对的专一性。因为AT对只有2个氢键，而GC对有3个氢键，所以GC对丰富的DNA比AT对丰富的DNA更为稳定些。第二，碱基的配对不是随机的。嘌呤和嘌呤结合在一起，位置不够，而嘧啶和嘧啶结合在一起，位置有余。而且有两个氢键的碱基（A或T）正常不能和有三个氢键的碱基（C或G）配对，所以A只能与T配对，C只能与G配对。就是说，如在一条链上，某一碱基是A，则另一个链上与它相对的必是T；与T相对的必是A，与C相对的必是G，与G相对的必是C。所以DNA分子中两条链是互补的，可简单地写成：所以这个模型要求腺嘌呤和胸腺嘧啶的分子数相等，胞嘧啶和鸟嘌呤的分子数相等，这正是 Chargaff所观察到的。应该注意到，对DNA分子中碱基顺序没有限制，所以AT量不一定要等于GC量，这也是跟 Chargaff的数据符合的。一对核苷酸的分子量约为700，DNA的分子量据估计约为3106-12，所以一个DNA分子大致上有 4千40亿个核苷酸对。一个DNA分子是很细很细的纤丝，从地球到太阳那样的长度，还没有半克重，所以显而易见， DNA分子在细胞中是折叠又折叠，反复地折叠着的。双链DNA的不同构型 两条DNA链反向平行，一条走向是53，另一条走向是35，两条互补链相互缠绕，形成双螺旋（double helix）。这种双螺旋构型可有几种形式，其中3种具有生物学上重要性。（1）BDNA 这是WatsonCrick模型，是右手螺旋。在正常生理状态时，DNA分子大都属于这种形式，碱基的平面对DNA分子的中轴是垂直的。事实上，细胞内BDNA分子每转一圈平均包括10.4核苷酸对（nucleotide pairs），也可说是10.4碱基对（base pairs），而不是恰好10碱基对。（2） ADNA 这构型也是右旋，每转一圈大约含有11个碱基对。在高盐分时，或在脱水状态时，DNA常以A型方式存在。活体中DNA分子可能很少以A型方式存在，但在活体中DNARNA异源双链（heteroduplexes，即 DNA链的碱基与RNA链的碱基互补配对）或RNARNA双链是以这种方式存在的，所以这种构型也值得注意。（3）ZDNA 最近证明，某些DNA顺序存在着一种独特的左旋的双螺旋形式，称作ZDNA。这儿Z表示糖磷酸主干呈Z字形，这型双链中碱基平面对螺旋中轴不再成直角。ZDNA每转一圈约有12碱基。这种构型可能与真核类中基因活性有重要关系。以前认为DNA的结构形式是恒常的，是稳定的，现在看来这种看法需要修改。DNA的构型常常从一种形式动态地转变为另一种形式，看来这种转变与基因活性的调节有密切关系。DNA的变性和复性 将双链DNA在中性盐溶液中加热，DNA分子的共价键不受影响，而互补碱基对间的氢键则被打开，从而使两条多核苷酸链分开成为两条单链，这叫做DNA变性（denaturation）。变性后成为单链的DNA，在适当条件下又能回复成为双链DNA，这称为DNA复性（renaturation）或退火（annealing）。把DNA投放在含有0.18molL食盐和 0.018 molL 枸橼酸钠的溶液中，以100加热10分钟，可以完全分开成为单链。变性后的DNA如果慢慢冷却，时间经过10小时以上，DNA复性完全，因为在这个时间里，互补的碱基间又形成氢键。但是如果加热到100的溶液迅即冷却，则DNA仍然保持单链状态。加热使溶液中DNA分子的50成为单链时，所需温度称为解链温度（melting temperature），记作Tm。因为DNA分子中，A与T配对，氢链数是2个，G与C配对，氢链数是3个，所以 GC含量愈多，DNA稳定性愈高，愈加不容易由热或碱引起变性。因为变性和复性仅影响互补碱基对间氢键的打开和重新形成，所以通过变性和复性可用来制备单链DNA，进行多核苷酸链间的分子杂交，测定异源双链的同源性（homology，也就是碱基序列间的相似性），以及估算GC碱基对在DNA链中所占的比例等，在近代遗传学研究中有很多用处。DNA的复制 如果遗传信息是在DNA分子的碱基顺序上，那末这个顺序在细胞分裂时必须保持不变，所以一个DNA分子复制时，产生的两个子分子必须互相一样，而且也跟亲分子相同。（1） WatsonCrick模型中双链的互补性是复制方式的基础DNA复制时，碱基对间的氢键断裂，两条核苷酸链的旋绕松开，碱基显露出来。用譬喻来说，DNA分子像拉链一样地拉开了（图1112）。核苷酸链上的碱基显露后，它们按照互补配对的要求，吸引带有互补碱基的核苷酸，腺嘌呤吸引胸腺嘧啶核苷酸，鸟嘌呤吸引胞嘧啶核苷酸，等等，然后在邻接的核苷酸间形成磷酸二酯链，这样一条新的互补的核苷酸链就出现了。当这过程完毕时，新形成的两个DNA分子相互一样，也跟亲代分子一样。DNA复制时，每个分子都以它自己为模板，这种复制形式叫做半保留复制（semiconservative replication），因为原来两条链虽然保持完整性，但它们互相分开，作为新链合成的模板，各自进入子DNA分子 （daughter DNA molecules）中。（2） DNA的酶促合成 Kornberg在50年代后期最先发现DNA聚合酶（polymerase），并在试管中用脱氧核苷酸合成 DNA成功。Kornberg先把高能的磷酸基团接到4种脱氧核苷酸上，合成4种三磷酸脱氧核苷。他把这些化合物作为基质，放入试管中，添加从E. Coli分离的DNA聚合酶以及Mg2+，此外再投入从细胞中抽提出来的DNA作为合成的引物（primer）和模板（template），最后合成了许多新的DNA（图1113），其碱基组成比例与模板DNA相同（表114）。换句话说，新合成DNA的特异性不决定于试管中原来的4种三磷酸脱氧核苷含量的比例，也不决定于DNA聚合酶的来源，而是决定于加进去的少量DNA，即以现成的DNA为模板进行复制。关于DNA的酶促合成，还有一点要加以说明，那就是关于添加的DNA的作用。添加的少量DNA有两个作用：（a）作为合成反应的起始点，即作为引物。三磷酸脱氧核苷通过磷酸二酯键（phosphodiester bond），把核苷酸接到多核苷酸链的3-OH末端。所以一定要有一段DNA短链的存在，才可开始DNA合成。（b）作为新合成的DNA链的模板。进行聚合时，三磷酸脱氧核苷根据模板链的碱基顺序，通过氢键的形成，以其三磷酸与引物链的3OH末端相结合，进行聚合反应，所以结果新合成的DNA链与模板链是互补的（图1114）。（3）关于复制半保留性的实验 Meselson和Stahl（1958）用实验方法证明，DNA复制的确是半保留性的。他们把大肠杆菌培养在含有重同位素（15N）的培养基中。在细菌的生长过程中，重同位素进入含氮碱基，然后掺入新合成的DNA链中。在15N中经过多次细胞分裂，细菌细胞的DNA充分地被15N标记上了。然后把这些细胞移入正常的轻同位素（14N）的培养基中，经过一次或二次细胞分裂，抽取细菌样本，从每一样本中提取DNA，进行氯化铯（CsCl）梯度离心。CsCl以超速离心时，盐原子由于强大的离心力被拉向离心管底部，同时溶液中存在着的扩散作用又与离心力相对抗，使Cs+和Cl-离子分散在整个溶液中。CsCl溶液经过很多小时离心后，溶液达到一种平衡状态，扩散和沉淀的两个相对力量间保持平衡，出现CsCl的一个连续的浓度梯度；溶液的密度在离心管底部最大，而在离心管顶部最小。如果DNA分子溶解在CsCl溶液中，它们将逐渐集中在一条狭窄的带上，在那儿DNA分子的密度恰好跟那一点上的CsCl密度相等。所以DNA用重同位素15N标记后，在离心管中形成的一条带，位置较低，可以称为重带（heavy band）；而含有14N的轻DNA在离心管中也形成一条带，位置较高，可以称为轻带（light band）。Meselson和Stahl发现（图1115），细菌在15N中经过多代培养后，移到14N中培养一代，从这些细胞抽取的DNA形成一条带，位置在重带与轻带之间。如果复制是半保留的，这恰恰是所预期的，因为每一DNA分子中，应该一条链是15N重链，一条链是14N轻链。在14N中生长二代以后，从这些细胞抽取的DNA形成两条带，一条在中间位置，另一条在轻带位置，这个观察又跟预期相符合。还有更使人信服的，他们从在14N中生长一代的细胞抽取DNA，通过热变性（thermal denaturation），使DNA双链分开，然后离心。这时他们观察到两条带，一条是重的，一条是轻的，证明第一代杂种分子是半保留性复制的产物，它们的双链中，一条来自亲代（15N），一条是新合成的，所以可以记作14N15N。（4）高等生物中染色体的复制 DNA复制也曾在有些植物中研究过。在这些实验中，观察单位不是DNA分子，而是含有DNA的染色体（Taylor， 1958）。染色体用放射性胸腺嘧啶核苷标记，因为这种核苷只进入DNA中。放射性是从氚（3H）来的，氚取代了氢的位置，代入的氚很稳定，很少跟溶液中的氢置换，所以氚可有效地标记掺入的胸腺嘧啶核苷的位置，从而可以标记DNA。把要观察的材料做成片子，用乳胶紧紧地覆盖在玻片上。经一定时间，DNA中氚核裂解后放出的粒子使乳胶中的银粒子还原。把乳胶显影，拿有标本的玻片和显影后的乳胶同时在显微镜下检验，就可正确地决定氚在染色体中的位置。进行实验时，把蚕豆（Vicia faba）幼苗培养在含有3H的胸腺嘧啶核苷的培养基（也叫热培养基）上， DNA复制时，3H胸腺嘧啶核苷掺入DNA中。培养一定时间后，染色体都带有放射性。然后把根移到含有秋水仙素的非放射性培养基（也叫冷培养基）中。秋水仙素抑制纺锤丝的形成，所以染色体分裂，细胞不分裂，这样不仅姊妹染色单体留在同一细胞中，而且存在的染色体数目表明复制的次数。根尖细胞移植到冷培养基后，在冷培养基上进行分裂。把根尖细胞制片，染色，并进行放射自显影，观察第一次分裂和第二次分裂，结果如图1116所示。第一次分裂中期，两条染色单体都均匀地标记上了；而标记后第二次分裂中期，可以看到一个染色体中，有一条标记了的染色单体和一条未标记的染色单体。这些结果可以这样说明：在间期的G1期时，染色体未复制，每一染色体是一条DNA双键，进入 S期后，DNA双链在3H-胸腺嘧啶核苷存在下复制，所以经G2期而进入标记后第一次分裂期（M期）时两条染色单体都被标记上了。第二次复制（S期）是在没有胸腺嘧啶核苷的培养基中进行，所以到标记后第二次分裂期（M期）时只有一条染色单体是被标记的。从而这个实验在染色体水平上表明了DNA双链的复制是半保留的。以后发展一种新的染色方法，可以不用放射自显影技术（aut-oradiography），直接观察染色体的半保留复制。这方法是，染色体在含有溴脱氧尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine，BrdU）的培养液中经过两次复制，然后用 Giemsa染色，结果就出现所谓色差染色体（harlequin chromosomes）。因为在BrdU中所合成的DNA链着色很浅，跟原来的链明显不同。色差染色体的出现方式跟用放射自显影所得的结果一样，都证明DNA的复制是半保留的（图1117，并请参照图1116）。（5）由放射自显影看DNA复制 大肠杆菌的染色体是环状的双链DNA。Cairns（1963年）用放射性同位素标记大肠杆菌染色体，他发现两个圆形的链在复制时分开，每一链分别复制，这种复制就出现Y形复制叉（replication fork）。Cairns的实验和解释是这样的：细菌细胞在含3H-胸腺嘧啶核苷的培养基中生长，DNA复制时，放射性同位素掺入DNA中。理论上所有新合成的子分子都含有一条放射性（热）链和一条非放射性（冷）链。在热培养基中经过不同时间的培养和不同次数的复制后，从细菌细胞抽取DNA，漂浮到膜上，经过放射自显影后，在电子显微镜下进行观察。在3H-胸腺嘧啶核苷中进行一次复制，在放射自显影图上看到一圈小点，他的解释见图1118。在第二次复制周期中，像预期那样，看到眼球状的结构，两侧各有一个Y形复制叉。还有，放射自显影图中三个区段的粒子密度不同，中间的一个弧形区段粒子密度较大，像图1119左方所表示那样，所以在右方作了相应的解释。（6）复制的起点与复制子EcoliDNA复制时，眼球的大小可以不同，但每一个分子的眼球数仅限于一个。可见DNA的复制从一点开始，随着复制叉（replication fork）同时向两侧移动，眼球部分渐渐扩大，最后成为两个环状分子，复制完毕。噬菌体和质粒的环状DNA大都以这种方式复制；但也有复制从起始点发动后，复制仅向一方进行的。Ecoli噬菌体以及质粒DNA都是独立复制的，这样的独立复制的单位，称为复制子（replicon）。复制子必然存在有复制的起始点（origin of replication），与复制有关的蛋白质，如DNA聚合酶等就在这儿起作用，使复制开始。一旦复制开始，即进行到底；那就是说，复制由起始点进行调节。高等生物的DNA是一个很大的分子，长度约为Ecoli DNA的数百倍，在分子内有好几个起始点（图11-20）。根据放射自显影推断，起始点与起始点之间的距离随生物种类而异，大致在10250之间。这个长度含有3104-8105碱基对，相当于Ecoli染色体全长的120。高等生物的染色体是多复制子（multi-replicon），原核生物的染色体是单复制子，两者是不同的。因此，尽管每个复制叉的移动速度以细菌为快，但染色体全体的复制速度还是高等生物方面快。又染色体的复制速度随细胞种类和生理状态而异，但这不是由于复制叉移动速率（即复制速率）不同，是由复制从那个起始点开始决定的。（7）DNA聚合酶 DNA复制的特点是以DNA自体作为模板，但在DNA聚合反应中还需要蛋白质，其中一类重要蛋白质是催化核苷酸聚合的DNA聚合酶。Kornberg最初发现的聚合酶是DNA聚合酶，以后又从细菌中分离到2种聚合酶，分别称为DNA聚合酶和。这些酶的作用在Ecoli中研究得最为详细。实际上在DNA复制中起作用的是DNA聚合酶。这酶在细胞中含量最少，每细胞约10个分子。DNA聚合酶在细胞中含量最多，每细胞约有400个分子，这主要有关于DNA的损伤修复。关于聚合酶的作用，还不清楚。高等生物也有3种DNA聚合酶，分别称为，和。其中DNA聚合酶在复制中起作用，聚合酶在损伤修复中起作用，但因为没有适当的突变型可以进行验证，所以这些聚合酶的作用尚有待于证实。（8）DNA链的伸长构成DNA的两条核苷酸链是逆向平行的，从而复制叉向两侧推进时，如在起始点的一侧合成方向为53，而在另一侧，合成方向必然为35。可是已知的DNA聚合酶只能以53方向合成DNA，为了解决这个矛盾，提出了不连续复制（discontinuous replication）模型。根据这个模型，先合成DNA短链，随后与已有的DNA长链结合。以后冈崎证明，在细胞内确实是这样进行的，所以这样的DNA短链就称为冈崎片段（Okazaki fragment）。图1121是DNA复制过程的模式图。随着复制叉的移动，分开的两条DNA链分别合成一条新的互补链。在复制起始点的一侧，DNA合成的方向与复制叉移动的方向相同，但在另一侧，DNA合成的方向与复制叉移动的相反。这时先形成由若干核苷酸而成的RNA引物（RNA primer）。为什么先要合成RNA引物？那是因为DNA聚合酶不能开始新DNA的合成。Ecoli大约以100到200核苷酸的间隙形成这样的RNA引物。催化RNA引物合成的是称作引物酶（primase）的特殊的RNA合成酶。DNA短链伸展，到达已有的DNA长链的5末端，在这儿两者接合，不过事先引物RNA已被除去。在这阶段中，DNA多聚酶在起作用。这个酶在同一分子内有两个酶活性：一个是在53方向降解多核苷酸链的核酸外切酶活性（exonuclease acti-vity），另一个是在同一方向合成DNA链的聚合酶活性。由于这两个酶活性，RNA被除去，同时由于DNA链的伸长，填补了留下的空隙，最后由连接酶（ligase）的作用，DNA短链与原有的DNA长链结合。因为在结合之先，RNA引物已被切除，所以完成的DNA看不到RNA部分。DNA复制还有许多蛋白质参与。DNA双螺旋必须在复制过程中旋转，因为两条链是相互缠绕的。这是由一类称为拓扑异构酶（topoisomerases）来完成的。它可把环状DNA的一种构型变为另一种构型（图1122）。例如拓扑异构酶或促旋酶（gyrase）可以促使松环DNA（relaxed DNA）形成超螺旋DNA（supercoiledDNA）。超螺旋的形成，出现很大的扭力，使双链DNA易于解开。为了把DNA双链分开成为单链，还需要解旋酶（helicase）的参与。此外，DNA的复制还与其它一些蛋白质有关。通过上述这些蛋白质的协同作用，正确的复制过程才得以进行。（9）DNA复制过程的概括DNA的复制过程是DNA双链解开，每一条链作为新链合成的模板，最后形成两个相同的DNA分子。图1121中，下方一条链的走向是35。在这链的起点右侧，在DNA聚合酶的参与下，新链连续合成，方向为53。在复制叉前沿由于拓扑异构酶的作用，形成超螺旋，大大地增加了扭力，再加上解旋酶 （helicase）等的参与，使亲代双螺旋松开。松开后露出的单链部分由单链结合蛋白（single-stranded bindingprotein）的协助，保持稳定，促使DNA合成连续进行。而在起点左侧，新链必须间断合成，因为所有DNA聚合酶以53方向合成的。所以只有在模板链的新区段松开后，新链片段才可开始合成。合成时先要有引物酶（primase），在这酶的催化下，以DNA为模板，合成一段RNA短链，作为引物。RNA引物合成后，接着在DNA聚合酶的催化下，以DNA为模板，合成冈崎片段或DNA短链。当后一DNA短链合成后，在DNA聚合酶的参与下，前一DNA短链的RNA引物被降解，而且RNA切除后留下的空隙被填补。然后在连接酶（ligase）的催化下，使不连续的短链连结成为DNA新链（图1123）。最后两条新合成的链连同各自的模板链，形成两个相同的DNA分子。第三节 DNA与蛋白质合成上面我们证明了DNA是遗传物质，接着又说明了DNA的结构和复制，现在我们要讨论蛋白质和性状的关系，DNA如何控制蛋白质的合成，以及基因与DNA等。性状和蛋白质 我们看到的性状是千变万化的，可是经过仔细分析，都跟蛋白质有关。一个细胞可以含有几千种不同的蛋白质分子，这些蛋白质各有一定的成分和结构，在细胞或体内执行不同的功能，引起一系列错综复杂的代谢变化，最后显示为各色各样的形态特征和生理性状。蛋白质的种类很多，按照功能不同，大致可以分为下列几类：（1）酶 细胞每进行一项工作，都包括一系列错综复杂的化学变化，一个反应的产物是另一个反应的底物。这些化学反应几乎没有一个是自发的，那就是说，在试管中进行得很慢，或者根本不进行，可是在一种特殊蛋白质酶的存在下，这样的反应都进行得很快。为了发生反应，这种蛋白质只要微量就可以了。它们跟反应中的分子结合，使反应可以更有效地或更为迅速地进行，蛋白质本身并不在这反应中改变，在释放产物后，它又可跟另外反应中的分子结合。一个活细胞中进行着几千种反应，它应有同一数目的酶，因为每一种酶催化一种反应。如果一个细胞中缺少某一种酶，尽管反应中的分子是存在的，不能进行相应的反应。例如缺少一种尿黑酸氧化酶，不能把尿黑酸变为乙酰醋酸，直接在尿液中排泄出来，这样就出现了黑尿病。（2）运载蛋白质 血红蛋白是脊椎动物血液中的一种蛋白质，它很容易与分子氧结合。血液通过肺的时候，血红蛋白和氧气结合。血液返回心脏，流向身体其余部分时，把这结合的氧释放出来，供应给各种组织。所以血红蛋白不是催化一种化学反应，而是帮助某一特定物质的运输，是一种运载蛋白质（transportprotein）。细胞的膜上或膜内含有很多种类的运载蛋白质，它们帮助需要的物资运入细胞，而把不要的物质运出细胞。所有这些运载蛋白质都能认出特定的物质，并把它们运输。例如细胞中缺少一种能够促进小分子通过细胞膜的运载蛋白质，使胱氨酸等氨基酸通过细胞膜的运输过程受到影响，这样就出现胱氨酸尿症。（3）作为结构单位的蛋白质 细胞器（膜，核，染色体，线粒体、叶绿体等）是由较小的亚基构成，这些亚基大都是蛋白质分子。这些亚基以一定方式配搭起来，从而决定了总的形状，使它们能够执行特定的功能。不过一种蛋白质作为一个结构的亚基，例如作为细胞膜的一个亚基，并不是说它就不能同时作为一种酶或一种运载蛋白质了。 （4）激素 在昆虫和高等动物中，身体的一部分可以产生一种特定蛋白质，释放到血液中，通过循环系统，调节其他细胞的活动，它们叫做激素。激素的作用也是很专一的，这自然跟它的特定的结构和组成有关。 例如男性的脑下垂体前叶产生一种激素促性腺激素（gon adotropic hormone，或GSH），刺激睾丸的间质细胞，促进睾酮（testosterone）的分泌，使精子持续地形成。但在XXY个体，因为靶的器官睾丸对促性腺激素的反应减弱，或不起反应，所以在这样的个体中，尿中促性腺激素的排泄量就上升了。 （5）抗体在脊椎动物中，一种外来蛋白质，多糖或核酸进入血流，带到淋巴结和脾，就产生一种特定蛋白质抗体。由于抗体的独特结构和组成，可以认出外来分子，并与之结合，身体运用这个系统作为一种防御机制，来防止细菌，病毒等的侵入。因为一个动物从出生以后，不断接触来自入侵微生物等的外来大分子，所以血液中含有大量不同种类的抗体蛋白质。患无-球蛋白血症（agammaglobulinemia）的婴儿，血浆中基本上没有-球蛋白，不能形成某些抗体，所以在出生半年后，当母体来的抗体消失时，对细菌的侵染很敏感，接连地受到感染，虽然这种婴儿对病毒侵染的抵抗力大多数是正常的。（6）受体 受体是细胞膜或细胞内的大分子蛋白质，能选择地与一定活性物质相结合，产生特定的生理效应。例如在人中，有一种X连锁隐性遗传病睾丸女性化综合症（testicular feminization syndrome），患者的性染色体是XY，有睾丸发育，也能分泌正常量的雄激素。但由于患者靶组织细胞中的胞液受体（cytosol receptor）异常，对雄激素部分地或全然不敏感，导致雄激素的作用发生障碍，影响睾丸成熟和精子发生，所以有女性体态，而无生育能力。上面介绍了几种不同功能的蛋白质，并指出遗传性状与这些蛋白质的关系。那么有的遗传性状，例如常染色体隐性遗传的着色性干皮症（xeroderma-pigmentosum），患者有日光过敏症，在皮肤的见光部分易于发生色素沉着，皮肤萎缩，角化过度，发生癌变。已知这病起因于DNA损伤，不是与蛋白质无关吗？但深入研究后很快就发现，这病实在是由于患者缺乏DNA修复酶（DNArepair enzyme），在DNA损伤后，不能修补，从而引起突变，甚而导致癌变。由此可见遗传性状直接或间接都与蛋白质的改变有关。蛋白质的结构和组成 所有蛋白质都是多聚体，构成的单位是氨基酸。氨基酸有20几种，有一个共通的结构：中央是碳原子，一旁是氨基（N端，N-terminal end），另一旁的羧基（C端，C-terminal end），但是连接中央碳原子上的基团（R）可以很不相同（图1124）。所以虽然氨基酸构成单独的一类，有着一些共同的特性，但是不同的氨基酸在化学上是可以明确地相互区别的。图1125是20种标准氨基酸中的几个例子。氨基酸和氨基酸可以通过肽键相互连接起来（图1126）。氨基酸从N端到C端规则地连接起来，构成多肽。构成蛋白质的多肽，有的较短，只有10个左右的氨基酸，有的较长，可以多到2000个左右。20种氨基酸（表115）可以以各种顺序连接起来，每一种氨基酸在多肽链中可以重复出现。所以我们很容易想象，虽然所有蛋白质都由同样一些氨基酸连结起来的，但是可以构成的蛋白质的数目却是惊人的。氨基酸在多肽链中的顺序，叫做一级结构（图1127），因为邻近的氨基酸不同，相互之间，或相吸引，或相排斥，所以肽链倾向以一定方式旋曲起来，这叫做次级结构。这种旋曲又倾向以一定方式相互靠拢，相互折叠，所以每种蛋白质各有它的立体形状，这叫做三级结构。结果出现的形状可以是纤维状，也可以是球状等。每一条折叠着的多肽又可和其它的相同的或不同的多肽链联系起来，例如血红蛋白分子就是有4条多肽链通过弱键而联结起来的。总的说来，蛋白质是20种不同的氨基酸以一定的顺序连接起来构成的。氨基酸在蛋白质中的顺序就决定了它的立体结构和其它的化学和物理性质。20种氨基酸的顺序排列数目是天文数字的，所以存在的蛋白质种类也是不可胜计的，每一种蛋白质都有着跟其它所有蛋白质稍有不同的理化性质，所以蛋白质可以执行难以胜计的生物学功能。DNA的功能 DNA有自体催化（autocatalysis）和异体催化（heterocatalysis）两种功能。DNA分子以自己为模板，半保留性地复制，由一个分子成为两个相同的分子，这是自体催化，已在上一节讲过。DNA的另一功能是控制蛋白质的合成；就是根据它所储存的遗传信息，决定蛋白质的氨基酸顺序，这是异体催化，是我们现在要说明的。异体催化时，最简单的想法是，以DNA为模板，直接合成蛋白质。可是实验证明，信息的传递不是由DNA直接给蛋白质，而是通过另一种核酸RNA。因为在真核类中，DNA是在细胞核中而蛋白质的合成是在细胞质中。例如用3H尿核苷标记变形虫的一种（Amoeba proteus），它的核RNA被标记上了，然后把标记了的核移植到未标记的变形虫中，用放射自显影术追迹标记的分布。结果发现，大部分的标记了的核RNA随后转移到细胞质中。这是一个直接证据证明RNA在核中合成，在合成后大多数RNA分子进入蛋白质合成的地方细胞质中。所以概括地说，DNA控制蛋白质合成的程序是这样的：以DNA为模板，合成RNA，RNA合成后转移到细胞质中，在那儿控制蛋白质的合成。也就是说，DNA先把遗传信息转录给RNA，然后再转译为蛋白质（图1128）。RNA分子的结构 RNA分子像DNA，也是核苷酸的多聚体，也是长链的大分子；但是也有几点不同的性质：RNA通常是单链，而不是像DNA那样，通常是双链；它的核苷酸中的糖是核糖，而不是脱氧核糖；它所含有的4种碱基中没有胸腺嘧啶，而代之以尿嘧啶，虽然尿嘧啶（U）的配对性质跟胸腺嘧啶（T）一样，也与腺嘌呤（A）形成氢键。RNA分子中为什么没有胸腺嘧啶，而有尿嘧啶，为什么不是脱氧核糖，而是核糖，没有人确切知道；不过RNA的最重要特性是单链，而且在结构上很像DNA，它的碱基可以有任何顺序，也可以各种次数重复（图1129）：这就为我们提供一个线索，表明RNA的转录方式类似于DNA的复制，也以DNA为模板，按碱基互补的原则合成的。信使RNA 以DNA为模板，根据互补方式，合成RNA，把DNA上所带的遗传信息，传给RNA，这过程称为转录（transcrip-tion）。转录后形成的RNA进入细胞质中，控制蛋白质的合成。因为这种RNA传达DNA上的遗传信息，所以称之为信使RNA（messenger RNA）或mRNA。mRNA的合成需要一种酶，叫做依赖DNA的RNA聚合酶（DNA-dependentRNApolymerase）。这酶在Ecoli中研究得最为详细，全酶（holoenzyme）包括6个多肽，其中5个多肽（a2）构成核心酶（coreenzyme），第6个多肽称为因子（sigma factor）。以DNA为模板合成RNA时，因子能正确识别DNA上的起动区（promoter），RNA聚合酶随即与之结合。当RNA合成开始后，因子被释放，RNA链的延伸由核心酶催化。RNA转录到终止区（terminator），合成停止。起动区和终止区确定了转录范围。关于终止作用的分子细节尚未完全了解，至少还有一种称为因子（rho factor）的蛋白质是不可缺少的（图1130）。转录不是沿DNA分子全长进行的，是以包括一个或几个基因的DNA区段为单位进行合成的。合成时作为模板的仅是DNA双链中的一条。这是容易想象的，如果某一区段的DNA双链都被转录，那么将产生两条互补的RNA链，形成两种完全不同的蛋白质。这显然不是如此。而各种实验也证明，在一个时候RNA只从某一DNA单链的某一区段转录，尽管在整个DNA分子中，在整个生活史中不一定总以同一条DNA链作为模板的。跟DNA合成一样，由RNA聚合酶催化的RNA合成也是从5到3进行。这时作为模板的DNA链与由此合成的RNA链方向是相反的。换句话说，转录时对DNA链是从3到5读取的。RNA聚合酶沿DNA双链移动时，DNA双链打开（图1131），在RNA聚合酶的作用下，游离的三磷酸核苷（ribonucleoside triphos-phate）的碱基跟DNA的模板链上的露出