7蛋白组学-功能.ppt

蛋白质组学 浙江大学生命科学学院江辉 第六章功能蛋白质组学蛋白质相互作用 功能蛋白质组学 功能蛋白质组学的研究对象是功能蛋白质组 即在某一特定时期或者某一生理现象相关的所有蛋白质的生理生化功能 它是介于对个别蛋白质的传统蛋白质研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组研究之间的一个层次 功能蛋白质组学研究背景 随着越来越多物种基因组测序的完成 生命科学进入了后基因组时代 即研究基因的编码产物蛋白质在生物体中的功能 蛋白质组学的出现 可以实现高通量蛋白质功能的研究 与传统蛋白质研究比较 个体整体静态动态孤立个体相互作用结构功能小规模 非连续高通量 自动化 主要研究内容 蛋白质复合物分析细胞内蛋白质的定位蛋白质与蛋白质之间的相互作用蛋白质在代谢 调控 信号传导通路中的作用 蛋白质与蛋白质之间的相互作用 protein proteininteraction 蛋白质与蛋白质之间的相互作用指的是蛋白质之间空间上相互靠得很近 因此是一种物理上的相互作用 physicalinteraction 蛋白质之间的相互作用力 疏水作用 静电 氢键等蛋白质是生物体功能的执行者 蛋白质相互作用在生命过程中有重要作用 细胞内 酶和底物 信号转导 细胞分裂 DNA复制 转录 翻译 细胞外 配体和受体 细胞粘连 细胞运动 病原体侵入 蛋白质相互作用研究方法 生物化学 亲和层析 免疫共沉淀 化学交联法 荧光共振能量转移分子生物学 酵母双杂交 细菌双杂交 噬菌体展示技术遗传学 合成致死效应基于质谱方法 串联亲和纯化 高通量质谱蛋白质鉴定 生物化学方法 蛋白质亲和层析 在一定的条件下 某种靶蛋白质可以共价连接在基质如琼脂糖 Sepharose 上 用以结合抽提物中能与该种蛋白质结合的配体蛋白质 融合蛋白的应用 为了提高亲和纯化的强度和特异性 往往在靶蛋白上连接一个标签 tag 在柱子上连接一个能够和标签有高强度和特异结合的分子 这样可以把靶蛋白固定在柱子上 常用的标签有 GST 谷胱甘肽S转移酶GlutathioneSTransferase 金黄色葡萄球菌的蛋白A proteinA 几个组氨酸 histidine 麦芽糖结合蛋白 maltosebindingprotein MBP 特异结合的分子分别是 谷胱甘肽抗体的Fc端金属镍直链淀粉 利用融合蛋白进行亲和层析 珠子标签靶蛋白 标签结合分子 利用GST亲和层析 GSTpull down His pulldown 蛋白质亲和层析的优缺点 优点灵敏度高 在高浓度固定蛋白质的条件下 可以检测微弱的相互作用可以同时检测抽提物中的所有蛋白质可以检测多亚基蛋白质之间的相互作用缺点蛋白质间接结合也能被检测出来两种蛋白质的细胞定位不同 但是在人为条件下却能以高特异性结合 免疫共沉淀 co immuno precipitation Co IP 原理 细胞在非变性条件下进行裂解时 完整细胞内的许多蛋白质 蛋白质相互作用没有破坏 仍然保留下来 假设 能相互作用 如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X 那么与X在体内相互作用的Y也能沉淀下来 免疫共沉淀技术 与亲和层析不同的是 免疫共沉淀技术使用抗体来结合靶蛋白 从而把靶蛋白固定在珠子上抗体直接和珠子共价结合珠子和金黄色葡萄球菌的蛋白A共价结合 抗体再和蛋白A结合引入蛋白标签 产生融和蛋白 蛋白A 金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白 和抗体Fc端高度特异结合标签蛋白 FLAG Myc HA His等 免疫共沉淀技术 免疫共沉淀技术 应用 测定两种目标蛋白质在体内能否相互作用 也可以测定一种蛋白质新的作用伴侣 缺点 可能检测不到低亲和力或瞬间结合的蛋白质相互作用检测到的相互作用可能不是直接作用 而是通过第三者在中间起桥梁作用必须在实验前预测目的蛋白是什么 以选择相应抗体 若推测不正确 实验就得不到结果 化学交联法 使用一种交联试剂 并且在交联试剂的光激活部分带有标记 将该试剂偶联到一蛋白质A上 偶联体A与抽提物温育 如果抽提物中的B蛋白能与偶联蛋白质A发生相互作用 光激活后 交联剂的一部分就结合到B蛋白上 加入还原剂 切割交联试剂 使B蛋白带上交联剂上的标记部分 然后通过凝胶电泳等方法分析该蛋白质 A A A B A A A B B B 荧光共振能量转移 FluorescenceResonanceEnergyTransfer FRET FRET是一个无辐射量子级能量转移现象 它指的是当一个荧光分子 即供体 受到激发时 能量向邻近的另一荧光基团 即受体 转移的过程 FRET发生的条件 当受体与供体间的距离小于10nm供体激发光谱和受体的吸收光谱有重叠时 FRET才能发生 空间取向的变化将引起FRET效率的改变 EGFR和Grb2的相互作用 EGF表皮生长因子 分子生物学方法 酵母双杂交系统 yeasttwo hybridsystem 酵母双杂交系统于1989年由FieldsS和SongO创立 是用来研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的简便而有效的方法 又称为 相互作用陷阱 酵母双杂交系统通常在酵母细胞中构建 酵母双杂交系统组成 蛋白系统转录因子的DNA结合结构域 DNA bindingdomain BD 与一个 诱饵 蛋白 bait 融合表达的杂合蛋白 hybrid Gal4BD LexABD转录因子的转录激活结构域 activationdomain AD 与一个 猎物 蛋白 prey 融合表达的杂合蛋白 hybrid Gal4AD LexAADDNA系统和转录因子结合的启动子区 Gal4或者LexA结合区域在启动子下游的报告基因 URA3 LEU2 HIS1 Bait能够和prey相互作用 AD就被BD募集到启动子区域 从而激活报告基因表达Bait不能和prey相互作用 AD不能到达启动子区域 报告基因不表达 酵母双杂交系统原理 酵母双杂交系统原理 存在BD bait 但是AD没有和prey融合 报告基因不表达存在AD prey 但是BD没有和bait融合 报告基因不表达 LexA酵母双杂交系统 LexA酵母双杂交系统流程 LexA酵母双杂交系统流程 LexA酵母双杂交系统流程 酵母双杂交系统优点 以酵母作为报道株具有研究优势融合体蛋白质之间的相互作用在真核酵母细胞内进行 蛋白质有可能保持天然的折叠状态 类似其在体内生理状态下的情况敏感性 具有高拷贝强启动子的表达载体 通过mRNA放大信号简洁性 不需纯化蛋白真实性 蛋白质体内短暂的相互作用 酵母双杂交系统局限性 存在假阳性和假阴性要求两个蛋白都要进入细胞核内才能激活转录 对于不能进入核内的蛋白质 膜蛋白 分泌蛋白 的相互作用研究不大合适有复杂的翻译后修饰的蛋白相互作用研究不大合适融合蛋白的构建可能会影响到蛋白质本身的活性或折叠状态 细菌双杂交 基于重组cAMP信号转导系统 Cya蛋白在细菌中编码腺苷酸环化酶 cAMPcyclase 催化ATP合成cAMP cAMP结合CAP 由CAP结合到基因启动子 激活基因表达 被激活的基因主要是一些参与代谢调控的基因 如参与乳糖 lactose 麦乳糖 maltose 代谢的酶 包括 半乳糖苷酶 galactosidase 细菌双杂交 基于重组cAMP信号转导系统 来源于Bordetellapertussis的Cya是一个很大的蛋白 有1706个氨基酸 1 400aa是Cya催化区域 该区域可分为T25 1 224 和T18 225 399 两个片断 两个片断分开 没有催化功能 两个片断结合在一起才有催化功能 细菌双杂交 基于重组cAMP信号转导系统 在cya基因缺陷的E coli菌株中 同时转入T25 X T18 Y 如果X Y能相互作用 则激活cAMP信号途径 如果X Y不能相互作用 则cAMP信号途径抑制报告基因 如LacZ 细菌双杂交 LB X gal Zip 酵母中转录激活因子Gcn4的亮氨酸拉链区 leucinezipper 可形成自身二聚体 噬菌体展示技术 噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置 在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下 使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达 融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面 被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性 以利于靶分子的识别和结合 噬菌体 噬菌体展示技术流程图 噬菌体cDNA展示技术 以改构的噬菌体为载体 cDNA基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白基因区 使外源蛋白表达并展示于噬菌体表面 通过亲和富集法筛选表达有特异蛋白质的噬菌体 Phagelibrary 一些噬菌体库已经商业化 遗传学方法 合成致死效应 syntheticlethality 单个基因的突变不能引起致死 而两个基因同时突变则会产生合成致死效果 说明这两个基因所编码的蛋白质在功能上可能是相关的 合成致死效应的优缺点 是一个体内实验可以在全基因组范围内进行筛选工作量大只适于低等生物 基于质谱的分析方法 串联亲和纯化 TandemAffinityPurification TAP 大规模的蛋白质相互作用研究也可用于蛋白质复合物的纯化系统包括 proteinA 结合抗体 抗体和珠子 bead 共价交联TEV 烟草蚀刻病毒 tobaccoetchvirus 蛋白酶切割位点 TEVsite 钙调素结合蛋白 CBP 以Ca2 依赖的形式结合钙调素 钙调素与珠子共价交联 calmodulin bindingpeptide CBP 靶蛋白 用于结合所需要的蛋白质 TAP分离过程 将TAP标签构建到靶蛋白上 在宿主细胞内表达 融合蛋白表达水平接近于靶蛋白的天然状态与靶蛋白发生相互作用的其他蛋白质结合到融合蛋白上形成复合体细胞裂解物和IgG基质温育在一起 通过proteinA复合体结合到IgG上冲洗后加入TEV蛋白酶 洗脱下复合体在Ca2 存在的情况下 洗脱液与包被着钙调素的珠子温育 复合体就结合到珠子上进一步洗去杂质后 加入EGTA螯合 复合体脱落SDS PAGE分离复合体各组分 胰酶酶切后 进行质谱分析 TAP分离过程 高通量质谱蛋白质鉴定 使用一分子标签如FLAG标记靶蛋白 使融合蛋白在细胞内过量表达通过免疫亲和 FLAG抗体 捕获到抽提物中靶蛋白形成的蛋白复合体SDS PAGE分离复合体各组分