白血病细胞的免疫分型.doc

综述：白血病细胞的免疫分型 03级交大教改班 史蔚 5031819004白血病细胞的免疫分型正常血细胞从多能干细胞分化、发育、成熟为功能细胞的过程中，细胞膜、细胞浆或胞核抗原的出现、表达增多与减少甚至消失与血细胞的分化发育阶段密切相关，而且表现出与细胞系列及其分化程度相关的特异性。因此，这些抗原的表达与否可作为鉴别和分类血细胞的基础。白血病是造血系统的恶性肿瘤，在形态上变化虽相当大，但仍能表达正常血细胞所具有的抗原，因而仍可依据其抗原的表达谱对白血病进行免疫分型。由于白血病细胞具有肿瘤细胞的特征，其抗原表达又不完全同于正常血细胞，常可出现某些抗原缺乏、过度表达、系列交叉表达某一系列或阶段不应有的抗原，这又增加了白血病免疫分型的复杂性。近年来白血病的免疫分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要标准之一。国际上公认的通用的方法是流式细胞术（FCM），此外还有免疫组化法，电镜和荧光显微镜也可以帮助诊断。其中流式细胞术（FCM）和免疫组化法较为常用。流式细胞术中，白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体（McAb）作分子探针，多参数分析白血病细胞的细胞膜和细胞浆或细胞核的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。因为FCM能快速，多参数，客观的定性又定量测定细胞膜，浆，核的抗原表达。另一个重要理由是至今尚未发现白血病的特异抗原。所以能用正常血细胞的单抗来进行免疫分型是基于白血病形成的分化阻断学说即白血病细胞基因异常，分化受阻于某阶段形成不同亚型的白血病。这群细胞充盈于骨髓。抗原表达与其相应系列/阶段的血细胞无明显差异。与形态学检查相似仅能根据数量的差异来判断病变细胞的属性。单参数免疫标志测定易将正常细胞包括在内。因此，近年来主张用设门（gating）方法。即用CD45与侧向角（side scatter,SSC），对数取样后可将骨髓细胞清晰地分出淋巴细胞，单核细胞，成熟粒细胞，幼稚细胞和红细胞群，其理论依据是CD45是所有白细胞的抗原。其表达量在淋巴细胞最高，单核细胞，成熟粒细胞，早期造血细胞（blasts）依次减弱。红细胞（中，晚幼红细胞，成熟红细胞）不表达CD45。SSC反映细胞的颗粒性，成熟粒细胞SSC最高，依次为单核细胞，淋巴细胞，blasts，红细胞。以CD45/SSC双参数，对数取样时即可把各细胞群区分出来。若同时加上一个，二个甚或三个荧光标记的单抗，则很容易识别非正常细胞群所表达的抗原。这样可以排除正常细胞的干扰。在幼稚细胞低的情况下或检测残存白血病时尤为必要 。FCM分析白血病免疫表型时，测量细胞数量一般在1000050000细胞之间，而且快速、特异、准确，重复性好，能区分细胞起源、划分其分化发育阶段等，对白血病的诊断与分型、治疗方案选择与预后判断、发病机理研究等有重要价值。细胞免疫化学是细胞化学吸收了免疫学的理论和技术而发展起来的一门重要方法学.在现代医学领域中被广泛应用.尤其在细胞学中该技术的应用是微观世界形态学研究从单一的形态学描述上升到结构、功能和代谢为一体的动态观察。并可对细胞的属性、分化阶段和变异进行鉴别，有助于临床疾病的诊断。细胞免疫标记技术的方法学建立至今仅为短短30年左右的时间，但其发展异常迅速，检测方法可多达20多种以上。其基本原理是将组织和细胞作为抗原，与其相应的特异抗体产生抗原抗体反应，并借助荧光色素、酶、胶体金、铁蛋白等显示系统，在被测组织和细胞所相应的位置显示出来。由于抗原抗体系统具有高度的特异性和敏感性，能够将细胞形态学和功能代谢紧密的结合起来，进行观察和分析。免疫酶细胞化学技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高效，快速催化作用彼此结合，由此形成一种既具有免疫荧光、放射免疫的优点，又避免了他们的缺点。这项技术的原理和操作与荧光法有许多相似之处，所不同的是用酶来替代荧光素作为标志物，并采用底物被酶分解后的显色反应来显示抗原抗体的结合与否。作为血液学中的细胞免疫组化染色，应该首选碱性磷酸酶(AP)显色系统。 因为在血液和骨髓细胞中有一部分细胞含有非常丰富的内源性过氧化物酶，虽然在操作时可采取一些措施来抑制细胞内过氧化物酶，但这种处理比较粗糙，往往不能完全抑制该细胞内源酶的活性,又可造成部分细胞表面抗原的破坏或丢失。而对血液系统中许多恶性疾病的诊断，通常是检测其细胞表面的分化抗原。再则在血液和骨髓组织中，还存在大量的成熟红细胞。其中的血红蛋白对本法也会产生强烈的干扰，(因血红蛋白具过氧化物酶的功能)，可对被检标本的背景产生难以去除的非特异性染色。从而导致结果难以判断。这里就以流式细胞术为主要研究方法对白血病细胞的免疫分型进行阐述。骨髓血细胞是形态学分型的基础，FCM白血病免疫分型是对形态学分型的重要补充和进一步深化，国际白血病MIC分型协作组认为免疫分型对每一例急性白血病都是必不可少的，对下列情况意义更大：1、用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病。2、形态学为急性淋巴细胞白血病（ALL）或急性未分化白血病（AUL）但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。3、混合性白血病。4、部分髓系白血病。目前，免疫分型对粒细胞和单核细胞白血病的鉴别尚有一定困难。5、慢性淋巴细胞白血病。6、微小残留白血病。免疫分型常用的免疫标志及其意义白血病系列分化抗原T淋巴细胞白血病：CD3、CD5、CD7。B淋巴细胞白血病：CD10、CD19、CD22。NK淋巴细胞白血病：CD16、CD56、CD57。髓系白血病：CD13、CD14、CD33、MPO（髓过氧化物酶）。红白血病：GlyA（血型糖蛋白A）。巨核细胞白血病：CD41、CD42、CD61。白血病系列非特异性抗原CD34、HLADR为早期细胞抗原，无系列特异性，可与CD38联合运用于免疫分型。一般而言，干/祖细胞CD34、HLADR、CD38，原始细胞CD34、HLADR、CD38，而幼稚细胞（如早幼粒细胞）CD34、HLADR、CD38。白血病分化阶段抗原T细胞抗原CD4、CD8。B细胞抗原：CD10、Cy（胞浆链）、SmIg（表面膜免疫球蛋白）、CD38和CyIg（胞浆免疫球蛋白）、CD11C。白细胞共同抗原CD45为白细胞共同抗原，但原幼细胞表达量比成熟淋巴细胞低，幼红细胞不表达。用SSC/CD45 PerCP双参数分析可十分容易鉴别骨髓和血液中的原始或成熟细胞。用两个系列或阶段特异性McAb加CD45进行三色免疫荧光染色，经FSC、SSC、McAbl-FITC、McAb2-PE、CD45 PerCP五参数分析，可特异地分析原幼白血病细胞的免疫表型而不受成熟细胞的干扰。白血病的免疫分型一、 AMLMO、 Mo blasts 有低的SSC和FSC。在CD45SSC图上出现在淋巴细胞位置上，至少表达一个特异性标志如CD13或CD116，但MPO比CD13与CD33更灵敏。一般淋系标志阴性，但也可表达CD7或CD4。Mo blasts一般HLADR、CD34阳性，有些研究表明CD7与CD34共表达在AML且预后差。M1、 流式上M1与M0相似不易区分，M1一般CD13、CD33、HLADR，但CD34表达少于M0，可能表达部分CD15。M2、 M0与M1的主要区别是成熟度增加，blasts减少，CD15较M1较显著，CD34弱于M1，CD13有时表达强于CD33，多数病例HLADR（-）。CD45SSC图显示从髓系blast区至成熟骨髓细胞区的连续细胞带，CD45SSC图有助于确定blasts比例。M3、高颗粒性，具较高的SSC，但CD45较成熟C少，多数情况HLADR（-）或表达减少，CD34少于M2、一般CD13弱（），可有CD2表达。M4与M5、 两型表型相似，但M4较M5表达更多的CD34（），较之M0、M1，M4与M5有更大的FSS和SSC，CD45SSC图上，成熟C出现在单核区，重要的表型为CD13、CD33、HLADR、CD14和CD15，CD33可表达强于CD13，CD33（）、CD13（）、CD34（）很可能为M5，但只出现在少数病人中，部分M5可见CD56（）。M6、 M6较少见且特征不明显，一般HLADR，CD34、CD13、CD33阳性，CD45SSC图显示主要为红系成份。M7、 巨核细胞白血病，在AML中少于1。一般CD61（Gpa）和/或CD41（Gpb-a）阳性，而注意由于血小板粘附在blasts上造成的假阳性，可以用流式双色分析在EDTA存在下，测Gpb/a与CD34以减少激活血小板的粘附。二、 ALL： ALL是儿童中最常见的恶性肿瘤，约占全部肿瘤的25，在成人，ALL约占急性白血病的25，我们将ALL分为B祖细胞型，CD10或CD10，前B细胞型，B细胞型，T细胞型。B祖细胞型ALL：在幼儿约占ALL的6570，青少年为5560，成人为50。在儿童，约90病例CD10，在幼儿只有少于50病例CD10，blasts一般FSC、SSC很少，是FAB标准的L1或L2，一般TdT(+)HLA-DR(+)，CD19(+)，此型又分为2个亚型，CD10和CD10，前者预后好，多数病例CD24，CD34，CD20表达随成熟度增加而增加，B祖细胞被定义为sIg-。前B细胞型ALL：此亚型约占儿童ALL的25，细胞一般为CD19，CD24，HLADR，胞浆CD22，CD10，TdT随CD20变化，CD34多为阴性，前B亚型被认为比B祖型预后更差，这与t(1；19)出现相关并由此产生E2APBX1融合蛋白，它的表型为CD19、CD10、CD9，不同程度CD20表达，CD34，确认此表型有助于诊断基因上不确定的病例。B细胞型ALL：成熟B细胞型ALL约占ALL25，B细胞型ALL较之B祖细胞型ALL有更大的FSC和SSC，在CD45SSC图上出现在淋巴和单核细胞区域，即FAB标准的L3，表型为CD19、CD20、CD22、CD24且sIg（多数为IGM）多数病例CD10。但成熟抗原及sIg使之区别于更早的B系ALL，极少数成熟B细胞ALL无FABL3形态。TALL：多数病例有大的FSC、SSC，在CD45SSC图上可能出现在淋系未成熟细胞和髓系未成熟细胞或单核细胞区，多数表现为胸腺亚型，最常见亚型为皮质晚期表达，CD1、CD2、CD5、CD7、CD4/ CD8双阳与极少膜表面CD3、TdT多为阳性。另一常见亚型为皮质早期表达CD2、CD5、CD7、TdT强表达。髓质期亚型表达CD2、CD5、CD7、与CD3CD4/CD3+CD8+,很少见TdT表达。前T细胞亚型，表达CD7胞浆CD3且无其它T细胞抗原，T细胞肿瘤的特征是丧失T细胞抗原而表现出其它异常抗原组合。杂合型白血病：随着流式技术的广泛应用，我们发现许多病例并不能严格划分为淋系或髓系，真正的双表型病人多为t(9；22)或（11q23），现在杂合型的误诊率很高。最常导致误诊的原因是在分析中未能排除非白细胞，过度强调弱的非特异性结合，忽略了某些抗体缺乏系特异性，最重要的系特异性抗原在B系、T系、髓系分别为CD22、CD3和MPO。三、 CML： 由于慢性期显著的细胞分化，在CD45SSC图上除了髓系细胞占主导外，只显示一个正常骨髓像，CML可确诊，如有Ph1即t(9；22)(q34;q11)，它可形成新的杂合BCRABL癌基因，其产生的一段8.5kb异常，RNA可编码一个210KD（P210）的融合蛋白，使正常的造血细胞转变为CML细胞，该产物可用CR扩增后用标记探针在流式细胞仪上检测，这种分子流式技术正在研究中并将使流式技术扩展到分子领域。CML起病与发展相对缓慢，慢性期的持续1年左右最终发展为加速期和急变期。流式细胞技术对急变期亚型的诊断具有极高价值。直接影响到治疗效果。急变期CML主要表现为髓系，偶为淋系，髓性急变可表现出多种形态包括未分化细胞。淋性急变具典型形态特征，为CD10B祖细胞ALL极少有T细胞型ALL。四、 CLL： CLL细胞主要为较正常淋巴细胞稍大的小淋巴细胞。免疫分型主要为：SIgM、SIgD弱表达，B系抗原为CD19、CD20、CD43、CD79a与CD5共表达，CD23表达使得CLL区别于帽细胞淋巴癌MU，即（CLL：CD23，MCL：CD23），CD10、CD23、CD11c和CD25、CD20常弱表达，尽管CLL起病慢，但CLL病人的生存率变化很大，有染色体异常的病预后不良，最常见的三联体trisony12、14q、13q、11q，免疫表型上没有特异的变化而免疫表型的变化并不是提示染色体异常。最近，有研究表明，三联体trisony12与SIg、CD20表达量高度相关，与CD23相关 与FMC7相关。B型前淋巴细胞白血病（BDLL）较CLL更为严重，流式细胞技术在区分BDLL和CLL上发挥很大作用，BDLL多为CD5，CD22，表达更强的sig。MU病人平均生存率不超过5年，与CLL在形态上很难区分，与CLL相似有CD5B祖细胞，但Sig表达强于CLL，且CD22。另一与CLL难于区分的是FCC，细胞为强Sig、CD5、CD10、CD23，具B系表型：对于诊断为CLL，CD5、FMC7、CD22与SIg，CD20异常强表表达的病例我们要考虑是否为DLL、MCC或CLL的亚型（trisomy12）因为它们危险性更大。参考文献：1. 急性早幼粒细胞白血病免疫表型分析. 中华血液学杂志,1998,19 (1)312. 唐亚辉，马葵，李次芬等。 AL 的形态学、免疫学、细胞遗传学和分子生物学分型。中华血液学杂志， 2002 ； 23 (5)； 264-266 3. 王晋芬，郗彦凤，王丽霞等。应用多重标记技术对 HL H/RS 细胞属性及生物学行为的研究。中华血液学杂志， 2004