添加中药的鸡腿蘑发酵液对葡萄糖苷酶及非酶糖基化的抑制作用.doc

添加中药的鸡腿蘑发酵液对a一葡萄糖普酶及非酶糖基化的抑制作用摘要:在鸡腿蘑发酵培养基中添加不同中药进行液体培养,比较对a一葡萄糖昔酶及非酶糖基化的抑制率。结果表明,添加苦瓜的鸡腿蘑发酵液的抑制率最高,分别为(416士1.1)%和(97.0士0.3)%。以四氧啼咙诱发的糖尿病小鼠模型进行降血糖试验,结果表明添加苦瓜的鸡腿蘑发酵液有显著降血糖作用。关键词:鸡腿蘑;a一葡萄糖普酶;非酶糖基化;发酵a一葡萄糖普酶抑制剂(a一glueosidaseinhibitor)通过抑制小肠刷状缘上a一葡萄糖普酶的活性,调节碳水化合物在肠道的吸收,达到防治餐后高血糖症的目的。a一葡萄糖昔酶抑制剂还有抗肿瘤、抗艾滋病病毒、抗鼠白血病病毒等作用卜4,对其研究受广泛重视。蛋白质非酶糖基化(non一enzymaticglycosylation)在糖尿病血管并发症的发生中有重要作用。蛋白质与葡萄糖发生非酶糖基化反应,形成不可逆的糖基化终产物(advancedglyeosylationendproduets,AoES)。该反应的产生与加速将导致胶原蛋白交联祸合、心室隔膜增厚及动脉硬化,从而引起一系列生理病理改变6j。因此,减少AGEs形成也是近年糖尿病研究的热点之一。鸡腿蘑(e即rinuseomatus),又名鸡腿菇、毛头鬼伞。研究表明,鸡腿蘑具有防止肝损伤、抗肿瘤、提高机体免疫力、降血糖等功效7一9。近年有学者提出中药发酵技术。气而鸡腿蘑作为药用真菌,也可以液体发酵生产。因此可尝试在深层发酵培养基中添加适量中药,设想鸡腿蘑在代谢过程中对中药成分进行转化,而中药成分也促进鸡腿蘑的生长与活性物质产生,从而增强治疗糖尿病的功效。本研究根据中药降血糖活性成分的差异汇,选择低毒性、药食两用的代表性中药进行试验,考察了添加中药的鸡腿蘑发酵液对a一葡萄糖普酶及体外非酶糖基化的抑制作用,并进行了小鼠的降血糖试验。收稿日期:2005一04一18作者简介:王锋(1979),男,硕士研究生,专业方向:发酵工程。Tel:0510一5864675E一mail:wxqdwfhotmail.eom1仪器与材料1.1菌种与材料650一60型荧光分光光度计旧立公司)。鸡腿蘑菌种由本实验室筛选保藏。绞股蓝、苦荞、魔芋、百合、人参、丹参(均购自江苏无锡山河药业集团)和苦瓜(新鲜苦瓜切片后60烘干至恒重)粉碎后备用。a-葡萄糖昔酶(无锡杰育斜酶制剂公司,效价1xl了1的刀i头4一硝基酚一a一D一毗喃葡萄糖昔(PNPG,EMerk公司);二甲双呱片(深圳中联制药厂,规格25omg);牛血清白蛋白(BSA,中国医药集团上海化学试剂公司);其余试剂均为分析纯。昆明种小鼠(雄性,体重21一269,中国科学院上海实验动物中心)。LZ培养基料面培养基:综合PDA培养基。种子培养基/gL一:葡萄糖20,玉米粉15,鼓皮5,KHZPo42,MgSO47H203,酵母膏2,玉米浆5。发酵基础培养基/gL一:葡萄糖10,玉米粉15,鼓皮10,KHZPo42,Mgso47H203。2方法与结果2.1溶液的配制中药发酵液:绞股蓝、苦荞、魔芋、百合、丹参、苦瓜的固体粉末按0.5%,人参按1.5%(w/w)分别加入装液量(发酵基础培养基)150nil的soonil摇瓶中,121灭菌30而n,冷却后按10%接种量接入鸡腿蘑液体种子,25oC培养4d(15Or/min)。结束后取发酵液离心(3000r/min)3Omin,以上清液作为中中国医药工业杂志ChineseJournalofPharmaceutieals2006,37(6)385药发酵液。另配制未加中药的鸡腿蘑发酵液,培养方法同上。中药水提液:取等量的上述中药材固体粉末,加适量水浸泡lh后保持微沸状态煎煮30而n,离心(3000r/min)ZOmin,药汁待用,药渣中补入适量冷水再煮沸ZOmin,离心取上清液,合并药汁,浓缩至对应发酵液的体积。复配液:取上述等量的中药水提液,与等体积未加中药的鸡腿蘑发酵液混合,再浓缩至原发酵液体积。2.2抑制a一葡萄糖普酶活力试验以PNPG为底物,参考文献,2测定a一葡萄糖普酶活力。用o.Zmol几、pH6.8磷酸钠缓冲液(PBs)为溶剂配制lmg/mlBsA溶液,再用此BsA溶液为溶剂配制40000u力111的a一葡萄糖普酶溶液。取PBS1.7ml,上述酶液50林l,混合后37OC保温10min,再加入o.ll6mol/LpNpG溶液50林l,37oC反应10min,用o.lmol/L碳酸钠溶液10ml终止反应,于400nm处测定在酶作用下释出的对硝基酚(PNP)的吸收度。其中a一葡萄糖普酶活力单位定义为:37、pH6.8条件下,lmin内水解pNpG释放l卿01pNp为一个活力单位。以未添加中药的鸡腿蘑发酵上清液为对照,42mg/ml二甲双肌水溶液为阳性对照。取待测液400川加至酶活力测定体系中(缓冲液体积相应减少)后,37OC保温IOmin,再加底物反应IOmin,碳酸钠终止反应,于400nm处测定吸收度,以抑制剂活力与酶活力相比计算抑制百分率,平行试验3次,结果见表1。2.3体外非酶糖基化药物干预实验31将BSA、己二醛和N咖3分别按10、12、Znlg力1且浓度溶于pH7.4、o.Zmol/L的PBS中。取上述PBS各lml,分别加入中药发酵液、中药水提液及复配液lml,以蒸馏水为空白,未添加中药的发酵上清液为对照,42mg/ml二甲双呱水溶液为阳性对照,均加入蒸馏水lml,振荡混匀,37OC避光孵育15d,定容至10ml待测,每组平行试验5份。采用荧光法测定AGES:激发波长37Onm,狭长snm;发射波长440nm,狭长6nm。对非酶糖基化反应的抑制作用以抑制率表示,计算公式如一下:抑制率空白管荧光强度一药物干预管荧光强度空白管荧光强度x10仔K)结果见表1。表1不同发酵液对a一葡萄糖普酶活力及非酶糖基化的影响试样对a一葡萄糖普酶的抑制率/%对体外非酶糖基化的抑制率/%阳性对照未加中药加绞股蓝加人参加苦瓜加魔芋加月一参加苦荞加百合26乡士1.528,9士1.822.9士1.114.9士0.4393士1.6,)16,0士1.711.3士1.511.7士1.9203士1.173.0士2刀745土1.484.4士住41)81.0土1石士)959士041)85.2士1.7)81.0士1.61)70.0士.8668士2刀注:)t检验,与未加中药的发酵上清液相比,p复配液发酵上清液(未加中药)二甲双肌苦瓜水提液,尤以体外非酶糖基化抑制能力最为突出。可见苦瓜中国医药工业杂志ChineseJoumalofPharmaeeutioals2006,37(6)自身即含有一定的有效物质,将其加入发酵液后在上述两方面均获得最高的抑制率,且比中药提取液与发酵上清液简单复配的效果更佳,表明发酵过程中添加苦瓜后,鸡腿蘑的代谢产物可能与苦瓜中的某些组分发生了“生物转化”。2.4降糖实验雄性小鼠禁食24h后,腹腔注射200mg崛四氧崛陡造模,饲养sd,禁食3一5h后测定血糖值,取血糖值IOmmol/L者作为糖尿病模型鼠。模型鼠禁食3一sh后随机分为l个模型对照组、1个阳性对照组和3个试验组,试验组分别按10、20和33ml/kg3个剂量灌胃,对照组以水灌胃,阳性组选用二甲双肌水溶液灌胃,剂量为800mgha。连续给药30d后测空腹血糖值。考察发酵上清液与添加苦瓜的发酵液调节血糖的不同作用,见表2(A、B分别代表未加与添加苦瓜的发酵液)。表2发酵液的降糖效果研究结果也显示苦瓜有一定功效,但因剂量低,水提物的抑制率不高。鸡腿蘑发酵添加苦瓜后,抑制率有明显的提高,而添加苦荞等其他中药的抑制率均不理想。添加苦瓜发酵液比复配液的效果好,可能是在发酵代谢过程中加入苦瓜,使鸡腿蘑产生了一些新活性物质或促进了活性物质的积累,增强了发酵液的抑制活性。小鼠降血糖实验表明,添加苦瓜后的发酵液活性与原发酵液相比,降血糖功效有显著提高。由此推测,苦瓜鸡腿蘑发酵液在防治糖尿病方面可能有较好应用前景,本实验室将进一步研究。组别实验鼠数试验前血糖/mmolL一试验后血糖/mm0llL一l对照组阳性实验组低剂量组A中剂量组A高剂量组A低剂量组B中剂量组B高剂量组Bll1211l2l01O1lll19336士1.64719.214士1.60319.056土240219.248士2.36619.121士176019.137士232119.262士1.91619.340士1.69319,047土0,98111.664士O乡141)15213士1.735上)12.891士1.052,)11.123士0.9131)12251士1.739,之)10.147士12781卜2)9.012士1826.)注:与对照组比较,尸001;2)B与A相应剂量组比较,尸。.01由表2可见,添加与未加苦瓜的鸡腿蘑发酵液和二甲双肌均有较显著的降血糖功效(尸0.01)。发酵液(未加苦瓜)高剂量组与阳性组的降糖功效基本相当,说明发酵液本身有一定的降血糖功效。添加苦瓜发酵液的中剂量组效果即比未加苦瓜的各剂量组及阳性组好,且高剂量组的降糖幅度更大。表明添加苦瓜提高了鸡腿蘑发酵液的降血糖功效。3讨论本研究与文献4报道的二甲双肌体外非酶糖基化抑制作用结果基本一致。对苦瓜药用功效的研究表明,其可抗四氧嚓陡和链脉霉素引起的高血糖症,对基因遗传的糖尿病亦有作用5。Virdi等tl6则报道了苦瓜的水提物质有较好的抗高血糖作用,本参考文献:l徐林峰、沈忠明,殷建伟.五味子中提取a一葡萄糖营酶抑制剂的研究口口.中国生化药物杂志,2001,22(3):127一129.仁2BowlinTL,MekownBJ,KangMS,etaz,PotentiationofhumanIymPhokine一aetivatedkillereellaetivitybyswainsonine,aninhibitorofglyco讲otein班oeessmgJ.Can-eerRes,1989,49(15):4109一4115.3LaskyLA,GroopmanJE,Fennieew,etal.NeutralizationsoftheAIDSretrovirusbyantibodiestoareeombinantenve-lopeglyeoproteinJSeience,1986,233(4760):209一212.4AlanD,GlyeosidaseinhibitorsasantivivaxandzorantltumoragentsJ.eellBiol,1991,2:309一313.5BrownleeM,CeramiA,VlassaraHAdvaneedglyeosylationendProduetsintissueandthebioehe皿ealbasisofdiabetieeomplieationsJ.N勘91了油以,1988,318(20):1315一132一,仁6ChunHK,OhnishiY,ShindoK,。tal.BiotransformationofflavoneandflavanonebySt厂e尸to哪ceslividanseellscarryingshumedbiophenyldioxygenasegenesJ了九人,2catal丑:En刃matie,2003,21(3):113一121.7ByeungHL,HyunJK,JongSC,etal.Inhibito习effeetor已矽rinusco次atusethanolextraetontheliverdamageinbenzo(a)Pyrene一treatedmieeJ.JKoreanoeFoodSeiNurr,1999,28(6):1364一1368.8HyunJK,ByeungHL,okMK,etal.Antimutageniee月乞etofthefruitingbodyandthemyceliaextractsofo刀7rinuseoma扭sJ.JKOreansoc尸00己SciNutr,1999,28(2):452一457-9王玉萍,李翔太,尹进,等.富铬鸡腿蘑菌丝发酵液急性毒性和降血糖作用的初步研究川.山东大学学报,2000,35(l):117一120.10王兴红,李棋德,曹秋娥.微生物发酵中药应成为中药研究的新内容J.中草药,2002,32(3):267一268.中国医药工业杂志ChinesezournalofPharmaeeutieals2006,37(6)387仁11郭舜民,郭尧惠.天然药降血糖成分的研究进展J.海峡药学,2000,12(r):1一5.仁12ChaPdelaineP,TremblayRR,DubeJY.P-Nitrophenol一a一D-glueoPyramosideassubstrateformeasurementofmaltaseactivityinhumansemenJI.elinehe从,1978,24(2):208-211.13KimHY,MoonBH,LeeHJ,etal.FlavonolglycosidesfromtheleavesofEueo邢miaulmoides0withglyeationinhibi-toryaetivityJl.JEthn叩harmacol,2004,93(2):227一23014程梅芬,肖洁,周丽诺,等.蛋白体外非酶糖化及氨基肌、二甲双呱的抑制作用J.上海医科大学学报,1998,25(1):35一38.15GroverJK,YadavSPpharmaeologiealaetionsandpotentialusesof协moraic;e入arantia:areviewJ.了五丫人n叩入armaeol,2004,93(1):122,一132.仁26Vi记12,sivakamis,shahanls,etal.AntihyperglyeehaeeffeetsofthreeextractsfromMomordicacharantiaJ.JEthno-尸harm。,eol,200388(x):一07一11.InhibitoryEffeetsofFermentationBrothsofCoprinuseomctusFeedingwithDifferentTraditionalChineseMedieinesona一GlueosidaseanolNon一enzymaticGlycosylationWANGFeng,DINGZhongYil们g,ZHANGKe一Ch;妞g恋ab.ofBio从二:Resourc。傲dKeyLab,oflndustrialBi口technologyofM执ist理of盛泥“2瓦oIl,Southe胡y亡扮29趁。确ivers奴WtLxi刀403引ABSTRACT:IlthibitoryeffectsoffellnentationbrothsofC口Prinuse口matusfe(,dingwithdifferenttraditionalChinesemedieinesona一glueosidaseandnon一enzymatieglyeosylationwereinvestil要ated.Theresultsshowedthatthefermentationbrothfeedingwith肥cha二ntiaL.hadstrongestinhibitoryeffeetona一glueosidas。(41.6士1.1)%andnon一enzymatieglycosylation(97.0土0.3)%.Itwasfoundthattheabove一mentionedfermentationlrotheouldsignifieantiydecreasehighlevelofblood